Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo DFG conceder MU 3340/1-1 e a Deutsche Krebshilfe concedem 111134 (ambos premiados para M.R.M.). Agradecemos Elke Malenke pela excelente assistência técnica).

Todos os experimentos realizados com material humano foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade de Tübingen e escrito consentimento informado foi obtido de todos os pacientes que contribuíram amostras para este estudo.
1. isolamento e estimulação de Jurkat células
Nota: Para otimizar o protocolo, use a linha de células Jurkat que é conhecida por expressar os altos níveis de NFAT2. Todas as etapas são executadas sob uma capa de fluxo laminar.
<...

Os passos críticos da realização de um ensaio da microplaqueta bem-sucedida estão a seleção de um anticorpo adequado e a otimização da tosquia processo25a cromatina. A seleção do anticorpo αNFAT2 provou para ser particularmente desafiador durante o desenvolvimento do presente protocolo. Embora existam vários anticorpos αNFAT2 comercialmente disponíveis e a maioria destes funciona bem para a mancha ocidental e outras aplicações, clone 7A6 foi o único anticorpo que pode ser usado co...

Leucemia linfocítica crônica (CLL) representa a leucemia mais comum em adultos nos países ocidentais, exibindo distinto acúmulo de CD5, CD23 e CD19 expressar B maduro células1. A maioria dos pacientes apresentam um curso de doença indolente, que não necessita tratamento específico por muitos anos. Pelo contrário, alguns pacientes mostram progressão rápida, que exigem intervenções terapêuticas imediatas com imune-quimioterapia ou outras terapias alvo2,3. Fator nuclear das células T ativadas (NFAT) é uma família de factores de transcrição, controlando vários no desenvolvimento e processos de ativação em numerosas células tipos4,5,6. Recentemente demonstramos superexpressão e ativação constitucional de NFAT2 nas células CLL de pacientes com doença indolente7. Aqui, regula um estado sem resposta à estimulação do receptor de células B chamado anergy7. Para demonstrar que o NFAT2 vincula-se à promotora linfócitos específicos da proteína tirosina quinase (LCK) e regula a expressão LCK em células humanas CLL, um ensaio de imunoprecipitação de cromatina específico (ChIP) foi desenvolvido e empregado.
ChIP é uma das várias técnicas para investigar o papel de factores de transcrição do gene expressão8. Expressão gênica é firmemente orquestrada de uma forma muito complexa por vários reguladores com fatores de transcrição, levando uma parte insubstituível deste processo9,10,11,12. Fatores de transcrição que regulam a expressão do gene em um contexto espacial e temporal foram identificadas em várias espécies (por exemplo, para o desenvolvimento e diferenciação)13,14,15, 16,17,18. Erros nos mecanismos de controle intrincadas envolvendo fatores de transcrição podem levar a uma variedade de processos patológicos, incluindo câncer19,20. Daí, identificação de fatores de transcrição e seus respectivos destinos pode oferecer novas avenidas terapêutico21,22. Para investigar este campo intrigante vários métodos estão disponíveis como ChIP, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA), vários ensaios suspensos de DNA e repórter-ensaios de11,8,12, 23 , 24.
Para demonstrar que um determinado fator de transcrição interage com regiões específicas do genoma in vivo ChIP é uma técnica ideal25. Para este efeito, DNA e proteínas associadas em células vivas são reticuladas utilizando irradiação UV ou formaldeído (ChIP reticulado, XChIP). Esta etapa é omitida para obter melhor DNA e proteína recuperação em nativo chamado ChIP (NChIP)26. Os complexos DNA-proteína são posteriormente cortados pelo sonication em fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp) e immunoprecipitated a partir dos escombros de célula, usando um anticorpo específico contra o fator de transcrição de interesse. Os fragmentos de DNA associados são então purificados e caracterizados por PCR, clonagem molecular e sequenciamento. Técnicas alternativas usam microarrays (ChIP-on-Chip) ou o sequenciamento de nova geração (ChIP-Seq) para analisar o DNA de immunoprecipitated.
Microplaqueta foi introduzido pela primeira vez por Gilmour e Lis em 1984 quando usaram UV e luz covalentemente ligação transversal DNA e ligado a proteínas na vida bactérias27. Após a lise celular e imunoprecipitação de bacteriana RNA polimerase, sondas específicas de genes conhecidos foram usadas para mapear a distribuição na vivo e densidade da RNA polimerase. O método foi posteriormente usado pelos mesmos investigadores para analisar a distribuição dos eucariota RNA polimerase II em genes de proteínas de choque térmico em Drosophila28. O ensaio de XChIP aperfeiçoado por Varshavsky e colegas de trabalho que primeiro usou o cross-linking para estudar a associação de histona H4 com calor choque proteína genes29,30de formaldeído. A abordagem NChIP, que leva a vantagem de uma melhor recuperação de DNA e proteína devido a epitopos naturalmente intactas e, portanto, maior especificidade do anticorpo, foi primeiramente descrito por Hebbes e colegas em 198831.
A vantagem do ChIP em comparação com outras técnicas para analisar interações da ADN-proteína na verdade, é que a interação real de um factor de transcrição pode ser investigado in vivo e sem sondas ou condições artificiais criadas pelos buffers ou géis empregado de11,8,12. Combinando o ChIP com o sequenciamento de nova geração, podem ser identificados múltiplos alvos simultaneamente.
Principais limitações desta técnica são a sua aplicabilidade limitada para ensaios em grande escala em organismos intactos25. A análise de padrões de expressão diferencial do gene também pode ser desafiador, usando técnicas de ChIP, se as respectivas proteínas são expressas somente em níveis baixos ou durante as janelas de tempo estreita. Outro fator potencialmente limitante é a disponibilidade de um anticorpo adequado adequado para o ChIP11.
O protocolo de ChIP aqui apresentado pode ser empregado para identificação de genes-alvo de um fator de transcrição na vivo por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Especificamente, o objetivo era identificar genes alvo romance de NFAT2 em CLL. Microplaqueta foi escolhida devido ao seu potencial para demonstrar diretamente a vinculação de NFAT2 para as regiões de promotor dos genes-alvo diferente em condições naturais no pacientes células CLL.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é caracterizada pela expansão dos clones de células malignas de B e representa a leucemia mais comum em países ocidentais. A maioria dos pacientes CLL mostra um curso indolente da doença, bem como um fenótipo anérgicas das suas células de leucemia, referindo-se a um receptor de células B não responde a estímulos externos. Nós recentemente têm mostrado que o fator de transcrição NFAT2 é um regulador essencial de anergy em CLL. Um grande desafio na análise do papel do fator de transcrição em diferentes doenças é a identificação de seus genes-alvo específicos. Isto é de grande importância para a elucidação dos mecanismos moleculares e possíveis intervenções terapêuticas. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma técnica clássica para demonstrar as interações proteína-ADN e pode, portanto, ser usada para identificar genes-alvo direto de fatores de transcrição em células de mamíferos. Aqui, o ChIP foi usado para identificar LCK como um gene alvo direto de NFAT2 em células humanas de CLL. DNA e proteínas associadas são quitosana utilizando formaldeído e posteriormente cortado pelo sonication em fragmentos de DNA de cerca de 200-500 de pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de DNA associados com NFAT2 então são seletivamente immunoprecipitated de detritos celulares usando um anticorpo αNFAT2. Após a purificação, fragmentos de DNA associados são detectados através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Sequências de DNA, com evidente enriquecimento representam regiões do genoma que são alvo de NFAT2 na vivo. Corte adequado de DNA e a seleção do anticorpo necessário são particularmente crucial para o sucesso da aplicação desse método. Este protocolo é ideal para a manifestação de interações diretas de NFAT2 com genes-alvo. Sua principal limitação é a dificuldade de empregar o ChIP em ensaios em grande escala, analisando os genes alvo de múltiplos fatores de transcrição em organismos intactos.

A Figura 1 mostra uma análise de citometria de fluxo exemplar de um paciente CLL realizada após coloração com anticorpos CD19-FITC e CD5-PE. Figura 1a mostra a retenção dos linfócitos, que representa a maioria das células no sangue de pacientes CLL. A Figura 1b mostra a proporção de CD19+/CD5+ CLL células, que representam 89.03% dos linfócitos, neste exemplo. A propo...

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Esse método pode ajudar a fornecer informações-chave no campo da oncologia, como a identificação de genes-alvo putativos e mecanismos patogênicos para desenvolver possíveis intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que se pode detectar a interação de NFAT2 e outros fatores de transcrição com genes de destino conhecidos e novos. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque as condições ideais de fixação e desarquivamento são difíceis de estabelecer.Para começar a encher um tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 37% de formaldeído. Em seguida, encha outro tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 1,25 molar glycine em um tubo de cinco mililitros com quatro mililitros de PBS. Em seguida, após a estimulação das células giram as células de acordo com o protocolo de texto, e re-suspendem as células em 500 microliters de PBS e colocam o tubo em uma caixa cheia de gelo.Adicione 13,5 microliters de 37% de formaldeído às células e misture por pipetação para cima e para baixo. Em seguida, incubar a suspensão em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 57 microliters de 1,25 glicina molar para parar a fixação.E deixe a suspensão incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Imediatamente após o período de incubação, coloque as células no gelo e centrifugar as células a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aspirar o supernaspe.Em seguida, lave as células duas vezes com um mililitro de PBS gelado a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova o supernante. Resuspense a pelota de célula em cinco mililitros de tampão de lise um por pipetação para cima e para baixo. Em seguida, coloque as amostras no gelo e incuba-as com agitação por 10 minutos.Depois disso, centrifufique os tubos a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma pipeta para remover cuidadosamente o supernante. Homogeneize as células em cinco mililitros de tampão de lise dois e pipeta para cima e para baixo para misturar.Em seguida, incubar as células no gelo por 10 minutos com agitação. Após o período de incubação, centrifugar os tubos a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, e remover cuidadosamente o supernasal. Em seguida, resuspende a pelota de célula em tampão de tesoura um com inibidor de protease 1X.Em seguida, incubar a suspensão celular no gelo por 10 minutos. Transfira 140 microliters da suspensão celular para tubos sonicadores tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. Coloque os tubos em um ultrassônico focado a sete graus Celsius e corte por 10 a 7 e 1/2 minutos.Transfira a suspensão celular para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar as amostras a 15.700 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, e coletar o supernasal em um novo tubo. Primeiro, prepare 20 microliters de contas revestidas de proteína A para cada precipitação em um tubo de 1,5 mililitro.Deixe as contas se acomodarem em um rack magnético por um minuto e remova o supernatante. Em seguida, lave as contas com 40 microliters de tampão de chip 1X para cada 20 microliters de proteína revestidas de A por pipetação para cima e para baixo. Deixe as contas se acomodarem em um rack magnético por um minuto e remova o supernatante.Repita este processo de lavagem mais três vezes antes de suspender as contas em seu volume original de 1X chIP buffer um. Adicione o inibidor de protease BSA, tampão chIP 5X e água de grau ChIP-seq às contas. Em seguida, adicione a cromatina desarmada.Use 10 microgramas de anticorpo anti-NFAT2 para capturar NFAT2, e 2,5 microgramas de anticorpo IgG como controle. Incubar as misturas durante a noite a quatro graus Celsius em uma roda girando a seis RPM. No dia seguinte gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes G e incuba-os no rack magnético por um minuto.Em seguida, aspire o supernasciente e lave as contas uma vez com buffers de lavagem um, dois, três e quatro consecutivamente. Gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes G antes de incubar os tubos no rack magnético por um minuto. Depois disso, remova o supernatante e adicione o próximo tampão de lavagem.Após a última lavagem, gire os tubos por cinco segundos a 7000 vezes G.Incubar os tubos no rack magnético por um minuto. Remova o supernatante e pegue as contas em 100 microliters de tampão de eluição um. Em seguida, incubar os tubos na roda giratória por 30 minutos.Em seguida, gire brevemente os tubos e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione quatro microliters de tampão de eluição dois. Para criar o controle de entrada misture um microliter da cromatina desarmada com 99 microliters de tampão de elução um e quatro microliters de tampão de elução dois.Em seguida, incubar as amostras por quatro horas a 65 graus Celsius com agitação. Depois disso, adicione 100 microlitadores de 100% isopropanol aos tubos. Vórtice e gire as amostras por cinco segundos a 7000 vezes G., adicione 10 microliters de contas magnéticas a cada amostra.Vórtice e incubar as amostras em uma roda giratória à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, gire os tubos brevemente e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Aspire o supernascer e resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lavagem um.Inverta os tubos para misturá-los e incubar-nos por cinco minutos em uma roda giratória à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar brevemente os tubos. Coloque-os em um rack magnético por um minuto e use uma pipeta para remover o supernatante.Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de lavagem dois. Inverta os tubos para misturá-los e incubar-nos por cinco minutos em uma roda giratória à temperatura ambiente. Depois disso, centrifufique brevemente os tubos e coloque-os em um rack magnético por um minuto.Remova o tampão de lavagem dois via aspiração e resuspenja as contas em 55 microliters de tampão de eluição. Para eluto o DNA precipitado incubar as amostras em uma roda giratória à temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, gire os tubos brevemente e coloque-os em um rack magnético por um minuto.Finalmente, transfira o supernatante para novos tubos de 1,5 mililitro. Este protocolo foi realizado pela primeira vez com células Jurkat analisando LCK como um potencial alvo NFAT2. Como mostrado aqui, os resultados ideais foram documentados pelo enriquecimento significativo do controle positivo il-2 e do DNA LCK.A tesoura subótima ou a falta de fixação podem levar a DNA de má qualidade. Finalmente, este protocolo foi realizado com células CLL humanas primárias com CD40L servindo como o controle positivo e LCK como alvo experimental. Como demonstrado pelo forte enriquecimento do DNA LCK, lCK é um alvo NFAT2 direto em células CLL humanas primárias.A tesoura inadequada que resulta em DNA de má qualidade pode retornar resultados subótimos. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que as etapas de fixação e sônica são cruciais para o sucesso deste método e podem ter que ser ajustadas às células que estão sendo analisadas.

Research

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Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

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Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

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Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

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Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

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