Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Эта работа была поддержана DFG Грант му 3340/1-1 и Deutsche Krebshilfe Грант 111134 (оба присуждена M.R.M.). Мы благодарим Elke Malenke за отличную техническую помощь).

Все эксперименты с человеческого материала были утверждены Комитетом по этике университета Tübingen и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, которые внесли образцы для этого исследования.
1. изоляция и стимуляции Jurkat клетки
Прим...

Важнейшие шаги выполнения успешно пробирного чип являются выбор соответствующей антитела и оптимизации хроматина, стрижка процесса25. Выбор αNFAT2 антитела оказалось особенно сложным во время разработки этого протокола. Хотя есть несколько αNFAT2 антител коммерчески доступн?...

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) представляет собой наиболее распространенных лейкемии у взрослых в западных странах, выставке собственный накопление CD19, CD23 и CD5 выражая зрелые B клетки1. Большинство пациентов выставку праздного течения, которые не требуют специального лечения для многих лет. Напротив некоторые пациенты показать быстрой прогрессии, требующих немедленного терапевтических вмешательств с иммунной химиотерапии или другие целевые терапии2,3. Ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) — семейство контроля развития различных факторов транскрипции и активации процессов в многочисленных ячейка типы4,5,6. Недавно мы продемонстрировали гиперэкспрессия и конституционных активации NFAT2 в клетки CLL от пациентов с праздного болезни7. Здесь он регулирует отвечать государства для стимуляции рецепторов клетки B называется анергия7. Чтобы продемонстрировать, что NFAT2 связывается с лимфоцитов специфические белки тирозин киназы (LCK) промоутер и регулирует LCK выражение в клетках человека ХЛЛ, assay иммунопреципитации конкретные хроматина (чип) разработана и занятых.
Чип представляет один из нескольких методов для изучения роли факторов транскрипции гена выражение8. Экспрессия генов плотно делается очень сложным образом несколькими регуляторами с транскрипционными факторами незаменимой участвуя в этот процесс9,10,и11,12. В многочисленных видов (например, для развития и дифференциации)13,14,15, выявлены транскрипционные факторы, регулирующие экспрессии генов в пространственной и временной контекст 16,17,18. Ошибки в замысловатые контрольных механизмов с участием транскрипционных факторов может привести к различных патологических процессов, включая рак19,20. Следовательно выявление факторов транскрипции и их соответствующие цели может предложить роман терапевтических направлений21,22. Расследовать этот интригующий поле несколько методов доступны как чип, assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA), различные ДНК выпадающее assays и репортер анализов8,11,12, 23 , 24.
Чтобы продемонстрировать, что определенные транскрипционный фактор взаимодействует с конкретными регионами генома в естественных условиях, чип является идеальной техникой25. Для этой цели ДНК и связанных белков в живых клетках сшиты с помощью УФ-облучения и формальдегид (сшитый чип, XChIP). Этот шаг пропускается, для получения лучшего ДНК и белка восстановления в так называемых родной чип (NChIP)26. Комплексы ДНК белок впоследствии стриженый, sonication на фрагменты примерно 200-500 пар оснований (ВР) и immunoprecipitated от мусора ячейки, используя специфическое антитело против транскрипционный фактор интереса. Связанные фрагменты ДНК затем очищенный и характеризуется PCR, молекулярное клонирование и секвенирование. Альтернативные методы использовать microarrays (чип на Chip) или секвенирование нового поколения (чип-Seq) для анализа immunoprecipitated ДНК.
Чип был впервые введен Гилмор и лис в 1984 году, когда они использовали УФ света ковалентно перекрестных ссылок ДНК и связанных белков в живых бактерий27. После лизиса клеток и иммунопреципитации бактериальных РНК-полимеразы конкретных зонды известных генов были использованы для сопоставления в vivo распределения и плотности РНК-полимеразы. Для анализа распределения эукариот РНК-полимераза II на тепловой шок белок генов в дрозофилы28же следователей впоследствии использовался метод. XChIP проба была далее обогащена Варшавский и coworkers, которые впервые используется формальдегид cross-linking учиться ассоциации гистона H4 с тепловой шок белок генов29,30. NChIP подход, который несет в себе преимущества лучше восстановления ДНК и белка из-за естественно нетронутыми эпитопов и, следовательно, большей специфичности антитела, впервые был описан Hebbes и коллеги в 1988 году31.
Преимуществом чип по сравнению с другими методами для анализа ДНК белковых взаимодействий является на самом деле, что фактическое взаимодействие транскрипционный фактор может быть исследованы в естественных условиях и не зондов или искусственные условия, созданные буферов или гели работают8,,1112. Объединив чип с секвенирование нового поколения, одновременно могут быть определены несколько целей.
Основные ограничения этой техники являются его ограниченную применимость для крупномасштабных анализов в неповрежденной организмов25. Анализ картин выражения гена дифференциальных также может быть сложным, с использованием методов чип, если соответствующие белки выражаются только на низком уровне или в ходе узких временных окон. Еще одним потенциально ограничивающим фактором является наличие соответствующих антител, подходит для чипа11.
Протокол чип, представленные здесь может быть использован для идентификации генов-мишеней транскрипционного фактора в vivo Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). В частности цель заключалась в выявлении новых целевых генов NFAT2 в ХЛЛ. Чип был выбран за его потенциал непосредственно продемонстрировать привязку NFAT2 промоутер регионам различных целевых генов в естественных условиях в клетках человека ХЛЛ пациента.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) характеризуется расширением злокачественные клетки B клонов и представляет собой наиболее распространенных лейкемии в западных странах. Большинство пациентов ХЛЛ показывают праздного течения заболевания, а также anergic фенотип их лейкозных клеток, ссылаясь на B клеточных рецепторов, не реагируют на внешней стимуляции. Недавно мы показали, что фактор транскрипции NFAT2 является важным регулятором анергия в ХЛЛ. Одной из основных задач в анализе роли фактора транскрипции в различных заболеваний заключается в определении своих конкретных целевых генов. Это имеет большое значение для разяснения патогенетических механизмов и потенциальных терапевтических вмешательств. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является классический способ продемонстрировать взаимодействий протеин дна и может таким образом, использоваться для выявления прямых целевых генов факторов транскрипции в mammalian клетках. Здесь чип использовался для выявления LCK как прямой целевого гена NFAT2 в клетках человека ХЛЛ. Связанные белков и ДНК, сшитые с помощью формальдегида и впоследствии стриженый sonication на фрагменты ДНК приблизительно 200-500 пар оснований (ВР). Сшитых фрагментов ДНК, связанные с NFAT2, затем выборочно immunoprecipitated от мусора ячейки с помощью αNFAT2 антитела. После очистки связанные фрагменты ДНК обнаруживаются через Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). Последовательности ДНК с очевидным обогащения представляют регионы генома, которые являются мишенью для NFAT2 в естественных условиях. Соответствующие стрижка ДНК и подбор необходимых антитела являются особенно важное значение для успешного применения этого метода. Этот протокол является идеальным для демонстрации прямого взаимодействия NFAT2 с генов-мишеней. Его основным ограничением является трудность использовать чип в крупномасштабных анализов, анализ генов-мишеней несколько факторов транскрипции в нетронутыми организмов.

Рисунок 1 демонстрирует образцовую потока cytometry анализ ХЛЛ пациента после окрашивания с CD19 FITC и CD5-PE антител. Рисунок 1a показывает стробирования лимфоцитов, представляющие большинство клеток в крови пациентов ХЛЛ. Рисунок 1b</s...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) является наиболее распространенным лейкемии в западном мире. NFAT транскрипционные факторы являются важными регуляторами развития и активации в многочисленных типах клеток. Здесь мы представляем собой протокол для применения иммунопреципитации chromatin (обломока) в клетках человека CLL для выявления новых целевых генов NFAT2.

Assay иммунопреципитации Chromatin для выявления роман NFAT2 целевых генов в хронический лимфоцитарный лейкоз

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Этот метод может помочь предоставить ключевую информацию в области онкологии, такие как выявление целевых генов и патогенных механизмов для разработки потенциальных терапевтических вмешательств. Основным преимуществом этого метода является то, что можно обнаружить взаимодействие NFAT2 и других транскрипционных факторов с известными и новыми генами-мишени. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что оптимальная фиксация и стрижка условия трудно установить.Для начала заполните 1,5-миллилитровую трубку одним миллилитром 37%формальдегида. Затем заполните еще 1,5-миллилитровую трубку одним миллилитром 1,25 моларглицина в пятими миллилитровой трубке с четырьмя миллилитров PBS. Далее, после стимуляции клеток спина клеток в соответствии с текстовым протоколом, и повторно приостановить клетки в 500 микролитров PBS и поместить трубку в заполненной льдом коробке.Добавьте 13,5 микролитров 37%формальдегида в клетки и смешайте с помощью трубок вверх и вниз. Затем инкубировать подвеску при комнатной температуре. После этого добавьте 57 микролитров 1,25 молярного глицина, чтобы остановить фиксацию.И дайте подвеске инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Сразу же после инкубационный период поместите клетки на лед и центрифугу клеток в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах цельсия. Затем аспирировать супернатанта.Затем, мыть клетки дважды с одним миллилитр ледяной PBS при 200 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и удалить супернатант. Resuspend гранулы клетки в 5 миллилитров буфера лиза одного pipetting вверх и вниз. Затем положить образцы на лед и инкубировать их тряской в течение 10 минут.После этого центрифуга труб при 500 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем используйте пипетку, чтобы тщательно удалить супернатант. Гомогенизировать клетки в пяти миллилитров лиза буфера два и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.Затем инкубировать клетки на льду в течение 10 минут с встряхивания. После инкубационный период центрифуга трубки при 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах цельсия, и тщательно удалить супернатант. Далее, повторное использование клеточных гранул в стрижке буфера с ингибитором 1X протеазы.Затем инкубировать подвеску клетки на льду в течение 10 минут. Передача 140 микролитров клеточной подвески в sonicator трубки, заботясь, чтобы избежать формирования пузырьков воздуха. Поместите трубки в сфокусированный ультразвуковой аппарат при семи градусах по Цельсию и скоут в течение 10-7 и 1/2 минут.Перенесите подвесную клетку в 1,5-миллилитровые трубки. Центрифуга образцов на 15, 700 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, и собирать супернатант в новой трубке. Во-первых, подготовить 20 микролитров белка С покрытием бисера для каждого осадка в одной 1,5-миллилитровой трубки.Разрешить бисер поселиться на магнитной стойке в течение одной минуты, и удалить супернатант. Затем мыть бисер с 40 микролитров 1X чип буфера по одному на каждые 20 микролитров белка-покрытые бисером путем трубопроводов вверх и вниз. Позвольте бисеру поселиться на магнитной стойке в течение одной минуты и удалить супернатант.Повторите этот процесс стирки еще три раза, прежде чем повторно приостановить бисер в их первоначальном объеме 1X chIP буфер один. Добавьте в бисер ингибитор протеазы BSA, буфер 5X chIP и воду класса ChIP-seq. Далее добавьте сноф chromatin.Используйте 10 микрограммов антител против NFAT2 для захвата NFAT2 и 2,5 микрограмма антител IgG в качестве контроля. Инкубировать смеси на ночь при четырех градусах по Цельсию на колесе, вращающемся при шести об/мин. На следующий день вращайте трубки в течение пяти секунд при 7000 раз G и инкубировать их на магнитной стойке в течение одной минуты.Затем аспирировать супернатант и мыть бисер один раз с мыть буферов один, два, три и четыре последовательно. Спин трубки в течение пяти секунд на 7000 раз G до инкубации труб на магнитной стойке в течение одной минуты. После этого снимите супернатант и добавьте следующий буфер стирки.После последней стирки, спина трубки в течение пяти секунд в 7000 раз G.Incubate труб на магнитной стойке в течение одной минуты. Удалите супернатант и возьмите бисер в 100 микролитров элюционного буфера. Затем инкубировать трубки на вращающемся колесе в течение 30 минут.Далее, кратко спина труб и поместить их на магнитной стойке в течение одной минуты. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и добавьте четыре микролитров буфера elution два. Для создания управления входом смешайте один микролитер с стрижкой хроматина с 99 микролитров буфера элюции один и четыре микролитера элюционного буфера два.Затем инкубировать образцы в течение четырех часов при 65 градусах по Цельсию со тряской. После этого добавьте в трубки 100 микролитров 100%изопропанола. Vortex и спина образцов в течение пяти секунд в 7000 раз G.Then добавить 10 микролитров магнитных бусин для каждого образца.Vortex и инкубировать образцы на вращающемся колесе при комнатной температуре в течение часа. Затем коротко закрути трубы и поместите их на магнитную стойку на одну минуту. Аспирировать супернатант и повторно помыть бисер в 100 микролитров мыть буфера один.Переверните трубки, чтобы смешать и инкубировать их в течение пяти минут на вращающемся колесе при комнатной температуре. Далее, кратко центрифуга труб. Поместите их в магнитную стойку на одну минуту, и использовать пипетку, чтобы удалить супернатант.Затем добавьте 100 микролитров буфера мытья два. Переверните трубки, чтобы смешать и инкубировать их в течение пяти минут на вращающемся колесе при комнатной температуре. После этого кратко центрифуга труб и поместите их в магнитной стойке в течение одной минуты.Удалите буфер мытья два через аспирации и повторно бусинки в 55 микролитров элюционного буфера. Чтобы узнать осаждаемую ДНК, инкубируют образцы в вращающемся колесе при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого, спина трубки кратко и поместить их в магнитной стойке в течение одной минуты.Наконец, перенесите супернатант на новые 1,5-миллилитровые трубки. Этот протокол был впервые выполнен с jurkat клетки анализа LCK в качестве потенциальной цели NFAT2. Как показано здесь, оптимальные результаты были задокументированы значительным обогащением положительного контроля Ил-2 и ДНК LCK.Неоптимальные стрижки или отсутствует фиксация может привести к плохому качеству ДНК. Наконец, этот протокол был выполнен с первичными клетками CLL человека с CD40L, выступающей в качестве положительного контроля и LCK в качестве экспериментальной цели. Как показало сильное обогащение ДНК LCK, LCK является прямой целью NFAT2 в первичных клетках ХЛЛ человека.Неадекватный стрижка, приводящая к плохому качеству ДНК, может привести к неоптимальным результатам. При попытке этой процедуры важно помнить, что шаги фиксации и звуковой связи имеют решающее значение для успеха этого метода и, возможно, должны быть скорректированы на анализируемые клетки.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Иммунопреципитация родной Chromatin, с использованием Neurospheres опухоли мозга мышиных

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Анализ последовательности гена иммуноглобулинов в хронический лимфоцитарный лейкоз: От пациента материала для интерпретации последовательности

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Рабочий процесс интеграции данных для выявления комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Субклеточная фракция первичных клеток хронического лимфоцитарного лейкоза для мониторинга торговли ядерным/цитоплазмическим ибелением

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...