Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el DFG concesión MU 3340/1-1 y el Deutsche Krebshilfe conceden 111134 (ambos a MRM). Agradecemos a Elke Malenke excelente asistencia técnica).

Todos los experimentos realizados con material humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Tübingen y se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes que contribuyeron las muestras para este estudio.
1. aislamiento y estimulación de Jurkat células
Nota: Para optimizar el protocolo, utilice la línea de células Jurkat que conoce para expresar los niveles de NFAT2. Todas las medidas se realizan bajo campana de flujo laminar.
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Los pasos críticos de realizar un exitoso análisis de ChIP son la selección de un anticuerpo apropiado y la optimización de la cromatina corte proceso25. La selección de los anticuerpos αNFAT2 demostrado para ser especialmente difícil durante el desarrollo de este protocolo. Aunque existen varios anticuerpos de αNFAT2 disponibles en el mercado y la mayoría de estos funciona bien para western blot y otras aplicaciones, 7A6 clon fue el único anticuerpo que podría utilizarse con éxito par...

Leucemia linfocítica crónica (CLL) representa la leucemia más común en adultos en países occidentales, exhibiendo distinta acumulación de CD19, CD23 y CD5 expresando B madura las células1. Mayoría de los pacientes presentan un curso indolente de la enfermedad, que no es necesario tratamiento específico durante muchos años. Por el contrario, algunos pacientes demuestran progresión rápida que requieren las intervenciones terapéuticas inmediatas con inmune-quimioterapia o terapias dirigidas2,3. Factor nuclear de células T activadas (NFAT) es una familia de factores de transcripción que controla varios desarrollo y procesos de activación en numerosas células tipos4,5,6. Recientemente hemos demostrado sobreexpresión y activación constitucional de NFAT2 en las células CLL de los pacientes con enfermedad indolente7. Aquí, regula un estado insensible a la estimulación de receptores de células B llamado anergia7. Para demostrar que NFAT2 se une al promotor linfocitos proteína tirosina quinasa (LCK) y regula la expresión de LCK en las células CLL humanas, un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina específicos (ChIP) fue desarrollado y empleado.
ChIP es una de las varias técnicas para investigar el papel de factores de transcripción en el gene expresión8. Expresión génica es bien orquestada de manera muy compleja por varios reguladores con factores de transcripción tomando parte insustituible en este proceso9,10,11,12. Factores de transcripción que regulan la expresión génica en un contexto espacial y temporal se han identificado en muchas especies (por ejemplo, para el desarrollo y diferenciación)13,14,15, 16,17,18. Errores en los mecanismos de control complejas que involucran factores de transcripción pueden conducir a una variedad de procesos patológicos incluyendo cáncer19,20. Por lo tanto, la identificación de factores de transcripción y sus respectivos objetivos podría ofrecer nuevas vías terapéuticas21,22. Para investigar este intrigante campo varios métodos están disponibles como ChIP, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA), varios ensayos de pull-down de ADN y ensayos reportero8,11,12, 23 , 24.
Para demostrar que un cierto factor de transcripción interactúa con regiones específicas del genoma en vivo, ChIP es una técnica ideal25. Para ello, ADN y proteínas asociadas en las células vivas son reticuladas utilizando radiación UV o formaldehído (ChIP reticulado, XChIP). Este paso se omite para obtener ADN mejor y la recuperación de proteína en el supuesto nativo ChIP (NChIP)26. Posteriormente, los complejos DNA-proteína se esquilan por sonicación en fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (PB) y immunoprecipitated de la ruina de la célula usando un anticuerpo específico contra el factor de transcripción de interés. Los fragmentos de ADN asociados son entonces purificados y caracterizados por PCR, clonación molecular y secuenciación. Técnicas alternativas utilizan micromatrices (ChIP-on-Chip) o la secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq) para analizar la immunoprecipitated ADN.
ChIP fue introducido por Gilmour y Lis en 1984 cuando utilizan UV de luz al ADN de reticulación covalente y enlazado a proteínas en la vida de las bacterias27. Lisis celular y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, se utilizaron sondas específicas de genes conocidos para mapear la distribución en vivo y la densidad de la ARN polimerasa. El método fue utilizado posteriormente por los mismos investigadores a analizar la distribución de la eucariota ARN polimerasa II en genes de proteínas de choque térmico en Drosophila28. El ensayo XChIP fue perfeccionado por Varshavsky y compañeros de trabajo que utilizan por primera vez formaldehído Cross-linking para estudiar la Asociación de la histona H4 con calor choque proteína genes29,30. El enfoque NChIP, que lleva la ventaja de una mejor recuperación de DNA y proteínas debido a epitopos naturalmente intacto y, por lo tanto, una mayor especificidad de anticuerpo, primero fue descrito por Hebbes y colegas en 198831.
La ventaja del ChIP en comparación con otras técnicas para analizar las interacciones DNA-proteína es en realidad, que la interacción real de un factor de transcripción puede ser investigado en vivo y sin sondas o condiciones artificiales creadas por tampones o geles son empleado8,11,12. Mediante la combinación de ChIP con secuenciación de próxima generación, pueden identificarse múltiples objetivos simultáneamente.
Principales limitaciones de esta técnica son su limitada aplicabilidad a los ensayos a gran escala en organismos intactos25. El análisis de patrones de expresión génica diferencial también pueden ser difícil usando técnicas de ChIP si las proteínas respectivas se expresan sólo en niveles bajos o durante las ventanas de tiempo estrecho. Otro factor potencialmente limitante es la disponibilidad de un anticuerpo apropiado para ChIP11.
El protocolo ChIP presentado aquí puede ser empleado para la identificación en vivo de genes diana de un factor de transcripción por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Específicamente, el objetivo era identificar los genes de la nueva diana de NFAT2 en CLL. ChIP fue elegido debido a su potencial para demostrar directamente el enlace de NFAT2 a las regiones promotoras de genes diferentes en condiciones naturales en células humanas del paciente CLL.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Leucemia linfocítica crónica (LLC) se caracteriza por la expansión de clones de células B malignas y representa la leucemia más común en los países occidentales. La mayoría de los pacientes CLL muestra un curso indolente de la enfermedad, así como un fenotipo anérgico de sus células de la leucemia, refiriéndose a un receptor de la célula de B no responde al estímulo externo. Recientemente hemos demostrado que el factor de transcripción NFAT2 es un regulador crucial de anergia en CLL. Un desafío importante en el análisis de la función de un factor de transcripción en diferentes enfermedades es la identificación de sus genes diana. Esto es de gran importancia para la elucidación de los mecanismos patogénicos y posibles intervenciones terapéuticas. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica clásica para demostrar las interacciones DNA proteína y puede, por tanto, utilizarse para identificar los genes objetivo directo de factores de transcripción en células de mamíferos. Aquí, el ChIP se utilizó para identificar LCK como gene del objetivo directo de NFAT2 en células humanas de la CLL. ADN y las proteínas asociadas son reticuladas con formaldehído y posteriormente cortado por sonicación en fragmentos de ADN de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de ADN asociados con NFAT2 son entonces selectivamente immunoprecipitated de restos celulares usando un anticuerpo αNFAT2. Después de la purificación, se detectan asociadas fragmentos de ADN mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Secuencias de ADN con evidente enriquecimiento representan regiones del genoma que están dirigidas por NFAT2 en vivo. Corte adecuado de la DNA y la selección de los anticuerpos requeridos son particularmente cruciales para la exitosa aplicación de este método. Este protocolo es ideal para la demostración de interacciones directas de NFAT2 con genes de la blanco. Su principal limitación es la dificultad para emplear viruta en ensayos a gran escala, análisis de los genes diana de múltiples factores de la transcripción en organismos intactos.

La figura 1 muestra un análisis de citometría de flujo ejemplar de un paciente CLL realizado después de la tinción con anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE. Figura 1a muestra la compuerta de los linfocitos, que representa a la mayoría de las células en la sangre de los pacientes CLL. Figura 1b muestra la proporción de CD19+/CD5+ CLL las células, que representan el 89.03% de lo...

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Este método puede ayudar a proporcionar información clave en el campo de la oncología, como la identificación de genes diana putativa y mecanismos patógenos para desarrollar posibles intervenciones terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede detectar la interacción de NFAT2 y otros factores de transcripción con genes diana conocidos y novedosos. Generalmente los individuos nuevos en este método lucharán porque las condiciones óptimas de fijación y cizallamiento son difíciles de establecer.Para comenzar a llenar un tubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 37%formaldehído. A continuación, llene otro tubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 1,25 de glicina molar en un tubo de cinco mililitros con cuatro mililitros de PBS. A continuación, después de la estimulación de las células girar las células de acuerdo con el protocolo de texto, y volver a suspender las células en 500 microlitros de PBS y colocar el tubo en una caja llena de hielo.Añadir 13,5 microlitros de 37% formaldehído a las células y mezclar por pipeteo arriba y abajo. A continuación, incubar la suspensión a temperatura ambiente. Después de esto, añadir 57 microlitros de 1.25 glicina molar para detener la fijación.Y deje que la suspensión se incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Inmediatamente después del período de incubación coloque las células sobre hielo y centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Entonces aspira el sobrenadante.A continuación, lave las células dos veces con un mililitro de PBS helado a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retire el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de licesis uno por pipetear arriba y abajo. Luego ponga las muestras en hielo e incubarlas con agitación durante 10 minutos.Después de esto, centrifugar los tubos a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, utilice una pipeta para quitar cuidadosamente el sobrenadante. Homogeneizar las células en cinco mililitros de tampón de lysis dos y pipeta arriba y abajo para mezclar.Luego incubar las células sobre hielo durante 10 minutos con temblores. Después del período de incubación centrifugar los tubos a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, resuspender el gránulo celular en el tampón de cizalla uno con inhibidor de la proteasa 1X.Luego incubar la suspensión celular sobre hielo durante 10 minutos. Transfiera 140 microlitros de la suspensión celular a tubos sonicadores teniendo cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. Coloque los tubos en un ultrasonido focalizado a siete grados Celsius y cizallar durante 10 a siete minutos y 1/2 minutos.Transfiera la suspensión celular a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar las muestras a 15,700 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En primer lugar, prepare 20 microlitros de cuentas recubiertas de proteína A para cada precipitación en un tubo de 1,5 mililitros.Deje que las perlas se asienten en un bastidor magnético durante un minuto, y retire el sobrenadante. A continuación, lave las perlas con 40 microlitros de tampón de chip 1X uno por cada 20 microlitros de cuentas recubiertas de proteína A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Deje que las perlas se asienten en un bastidor magnético durante un minuto y retire el sobrenadante.Repita este proceso de lavado tres veces más antes de volver a suspender las perlas en su volumen original de 1X chIP buffer uno. Agregue el inhibidor de la proteasa BSA, el tampón chIP 5X y el agua de grado ChIP-seq a las perlas. A continuación, agregue la cromatina cizallada.Utilice 10 microgramos de anticuerpos anti-NFAT2 para capturar NFAT2, y 2,5 microgramos de anticuerpos IgG como control. Incubar las mezclas durante la noche a cuatro grados centígrados en una rueda girando a seis RPM. Al día siguiente gire los tubos durante cinco segundos a 7.000 veces G e incubarlos en el bastidor magnético durante un minuto.A continuación, aspirar el sobrenadante y lavar las cuentas una vez con los tampones de lavado uno, dos, tres y cuatro consecutivamente. Gire los tubos durante cinco segundos a 7000 veces G antes de incubar los tubos en el bastidor magnético durante un minuto. Después de esto, retire el sobrenadante y agregue el siguiente búfer de lavado.Después del último lavado, gire los tubos durante cinco segundos a 7000 veces G.Incubar los tubos en el bastidor magnético durante un minuto. Retire el sobrenadante y tome las perlas en 100 microlitros de la tampone de elución uno. A continuación, incubar los tubos de la rueda giratoria durante 30 minutos.A continuación, gire brevemente los tubos y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y agregue cuatro microlitros de búfer de elución dos. Para crear el control de entrada, mezcle un microlitro de la cromatina cizallada con 99 microlitros de tampón de elución uno y cuatro microlitros de búfer de elución dos.Luego incubar las muestras durante cuatro horas a 65 grados Celsius con temblor. Después de esto, añadir 100 microlitros de 100%isopropanol a los tubos. Vórtice y gire las muestras durante cinco segundos a 7000 veces G.Then agregue 10 microlitros de cuentas magnéticas a cada muestra.Vórtice e incubar las muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, gire los tubos brevemente y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado uno.Invierta los tubos para mezclarlos e incubarlos durante cinco minutos en una rueda giratoria a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar brevemente los tubos. Colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto y use una pipeta para quitar el sobrenadante.A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de lavado dos. Invierta los tubos para mezclarlos e incubarlos durante cinco minutos en una rueda giratoria a temperatura ambiente. Después de esto, centrifuga brevemente los tubos y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto.Retire el tampón de lavado dos a través de la aspiración y resusppend las perlas en 55 microlitros de tampón de elución. Para eluir el ADN precipitado incubar las muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de esto, gire los tubos brevemente y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto.Por último, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Este protocolo se realizó por primera vez con células Jurkat analizando LCK como un objetivo NFAT2 potencial. Como se muestra aquí, los resultados óptimos fueron documentados por un enriquecimiento significativo del control positivo IL-2 y el ADN LCK.La cizalladura subóptima o la falta de fijación pueden conducir a ADN de mala calidad. Finalmente, este protocolo se realizó con células CLL humanas primarias con CD40L que sirven como el control positivo y LCK como objetivo experimental. Como lo demuestra el fuerte enriquecimiento del ADN LCK, LCK es un objetivo directo de NFAT2 en células CLL humanas primarias.El cizallamiento inadecuado que resulta en ADN de mala calidad puede devolver resultados subóptimos. Al intentar este procedimiento es importante recordar que los pasos de fijación y sonicación son cruciales para el éxito de este método y podrían tener que ajustarse a las células que se están analizando.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

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Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Inmunoprecipitación de cromatina nativa usando neuroesferas del Tumor de cerebro murino

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Análisis de secuencia del Gene de inmunoglobulina en leucemia linfocítica crónica: Paciente material de interpretación de la secuencia

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

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Fraccionamiento subcelular de células de leucemia linfocítica crónica primaria para monitorear el tráfico de proteínas nucleares/citoplasmáticas

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

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