Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Detta arbete stöds av DFGEN bevilja MU 3340/1-1 och den Deutsche Krebshilfe bevilja 111134 (båda tilldelas M.R.M.). Vi tackar Elke Malenke för utmärkt tekniskt bistånd).

Alla experiment som utförs med humant material godkändes av den etiska kommittén av universitetar av Tübingen och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter som bidragit prover till denna studie.
1. isolering och stimulering av Jurkat celler
Obs: För att optimera protokollet, använda Jurkat cell linje som är känd att uttrycka de höga nivåerna av NFAT2. Alla åtgärder utförs under en LAF.
<ol><li>Förbereda 50 mL RPMI 1640 kompletteras...

De kritiska steg för att utföra en lyckad ChIP-analysen är valet av en lämplig antikropp och optimering av den kromatin klippning process25. Valet av αNFAT2 antikroppen visat sig vara särskilt utmanande under utvecklingen av detta protokoll. Medan det finns flera αNFAT2 antikroppar kommersiellt tillgänglig och majoriteten av dessa fungerar bra för western blotting och andra applikationer, var klon 7A6 den enda antikropp som kan användas framgångsrikt för ChIP7. ...

Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) representerar de vanligaste leukemi hos vuxna i västvärlden, uppvisar distinkta ansamling av CD19, CD23 och CD5 uttrycker mogna B-celler1. De flesta patienter uppvisar en indolent sjukdom kurs, vilket inte nödvändiggör särskild behandling under många år. Däremot uppvisar vissa patienter snabb progression som kräver omedelbar terapeutiska interventioner med immun-kemoterapi eller andra riktade terapier2,3. Nukleär faktor av aktiverade T-celler (NFAT) är en familj av transkriptionsfaktorer som styr olika utvecklings och aktivering processer i många cell typer4,5,6. Vi visade nyligen överuttryck och konstitutionella aktiveringen av NFAT2 i KLL celler från patienter med indolent sjukdom7. Det reglerar här, ett tillstånd som inte svarar på B-cell receptorn stimulering kallas anergi7. För att visa att NFAT2 binder till promotorn lymfocyter-specifika protein tyrosine kinase (LCK) och reglerar LCK uttryck i mänskliga KLL celler, en specifik kromatin immunoprecipitation assay (ChIP) utvecklades och anställd.
ChIP är en av de flera teknikerna för att undersöka betydelsen av transkriptionsfaktorer i gen uttryck8. Genuttryck är tätt iscensatt i ett mycket komplext sätt av flera tillsynsmyndigheter med transkriptionsfaktorer som en oersättlig del i denna process9,10,11,12. Transkriptionsfaktorer som reglerar genuttrycket i rumsliga och tidsmässiga sammanhang har identifierats i talrika arter (t.ex. för utveckling och differentiering)13,14,15, 16,17,18. Fel i intrikata kontrollmekanismer som involverar transkriptionsfaktorer kan leda till en mängd olika patologiska processer inklusive cancer19,20. Identifiering av transkriptionsfaktorer och deras respektive mål kan därför erbjuda nya terapeutiska möjligheter21,22. För att undersöka detta spännande område finns flera metoder som ChIP, elektroforetiska mobilitet Skift assay (EMSA), olika DNA nedrullningsbara analyser och reporter-analyser8,11,12, 23 , 24.
För att visa att en viss transkriptionsfaktor interagerar med specifika regioner i genomet är in vivo ChIP en idealisk teknik25. För detta ändamål, är DNA och associerade proteiner i levande celler tvärbunden med hjälp av UV-bestrålning eller formaldehyd (tvärbunden ChIP, XChIP). Detta steg utelämnas att erhålla bättre DNA och protein återhämtning i den så kallade infödda ChIP (NChIP)26. De DNA-proteinkomplex är därefter klippt av ultraljudsbehandling i fragment av ca 200-500 baspar (bp) och immunoprecipitated från de cellfragment som använder en specifik antikropp mot Transkriptionfaktorn av intresse. De associerade DNA-fragment därefter renas och kännetecknas av PCR, molekylär kloning och sekvensering. Alternativa tekniker använda microarrays (ChIP-on-Chip) eller nästa generations sekvensering (ChIP-Seq) för att analysera immunoprecipitated DNA.
ChIP introducerades först av Gilmour och Lis 1984 när de använde UV ljus kovalent korslänk DNA och bundna proteiner i levande bakterier27. Vid cell lysis och immunoprecipitation bakteriell RNA-polymeras användes särskilda sonder av kända generna att mappa in-vivo distribution och täthet av RNA-polymeras. Metoden användes senare av samma utredarna för att analysera fördelningen av eukaryota RNA-polymeras II på heat shock protein gener i Drosophila28. XChIP analysens förfinades ytterligare av Varshavsky och medarbetare som först används formaldehyd tvärbindningsmedel för att studera associering av Histon H4 med heat shock protein gener29,30. Det NChIP synsättet, som bär fördelen med en bättre DNA och protein återhämtning beror på naturligt intakt epitoper och, därför, större antikropp specificitet, beskrevs först av Hebbes och kollegor i 198831.
Fördelen med ChIP i jämförelse med andra tekniker för att analysera DNA-protein interaktioner är i själva verket att faktiska växelverkan av en transkriptionsfaktor kan vara undersökta i vivo och ingen sonder eller konstgjorda förhållanden skapats av buffertar eller geler är anställd8,11,12. Genom att kombinera ChIP med nästa generations sekvensering, kan flera mål identifieras samtidigt.
Stora begränsningar av denna teknik är dess begränsad tillämplighet till storskaliga analyser i hela organismer25. Analysen av differentiell gen uttrycksmönster kan också vara utmanande med ChIP teknik om respektive proteinerna uttrycks endast vid låga nivåer eller under smala tidsfönster. En annan potentiellt begränsande faktor är tillgången på en lämplig antikropp lämpad för ChIP11.
Protokollet ChIP som presenteras här kan användas för identifiering i vivo av målgener av en transkriptionsfaktor av kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). Specifikt, var målet att identifiera nya målgener av NFAT2 vid KLL. ChIP valdes på grund av dess potential att direkt påvisa bindning av NFAT2 till arrangören regioner i olika målgener under naturliga förhållanden i mänskliga KLL patientens celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) kännetecknas av utbyggnaden av maligna B cell kloner och representerar de vanligaste leukemi i västvärlden. Majoriteten av patienter med KLL visar en indolent kurs av sjukdomen samt en anergic fenotyp av sin leukemiceller, hänvisar till en B-cell receptor okänslig för yttre stimulering. Vi har nyligen visat att den Transkriptionfaktorn NFAT2 är en viktig regulator av anergi i KLL. En stor utmaning i analysen av rollen av en transkriptionsfaktor i olika sjukdomar är identifiering av dess specifika målgener. Detta är av stor betydelse för förtydligandet av patogenetiska mekanismer och potentiella terapeutiska interventioner. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en klassisk teknik att demonstrera protein-DNA interaktioner och kan därför användas för att identifiera direkta målgener av transkriptionsfaktorer i däggdjursceller. Här användes ChIP att identifiera LCK som en direkt mål gen av NFAT2 i mänskliga KLL-celler. DNA och associerade proteiner tvärbunden med formaldehyd och därefter klippt av ultraljudsbehandling i DNA fragment av ca 200-500 baspar (bp). Tvärbunden DNA-fragment som är associerad med NFAT2 är sedan selektivt immunoprecipitated från cellfragment som använder en αNFAT2 antikropp. Efter rening upptäcks associerade DNA-fragmenten via kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydlig anrikning representerar regioner i genomet som är målriktade genom NFAT2 in-vivo. Lämpliga klippning av DNA och val av krävs antikroppen är särskilt avgörande för en framgångsrik tillämpning av denna metod. Detta protokoll är idealisk för demonstration av direkta interaktioner mellan NFAT2 och målgener. Dess största begränsningen är svårigheten att anställa ChIP i storskaliga analyser analysera mål generna av flera transkriptionsfaktorer i hela organismer.

Figur 1 visar en exemplarisk Flödesanalys flödescytometri av KLL patienten utförs efter färgning med CD19-FITC och CD5-PE-antikroppar. Figur 1a visar den gating av lymfocyter, som representerar majoriteten av celler i blodet hos patienter med KLL. Figur 1b visar andelen CD19+/CD5+ KLL-celler, som representerar 89.03% av lymfocyter i detta exempel. Andelen av CD19+...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) är den vanligaste leukemi i västvärlden. NFAT transkriptionsfaktorer är viktiga regulatorer av utveckling och aktivering i många celltyper. Här presenterar vi ett protokoll för användning av kromatin immunoprecipitation (ChIP) i mänskliga KLL celler att identifiera nya målgener av NFAT2.

En kromatin Immunoprecipitation analysen identifiera roman NFAT2 målgener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Denna metod kan bidra till att ge nyckelinformation inom området onkologi såsom identifiering av förmodade målgener och patogena mekanismer för att utveckla potentiella terapeutiska interventioner. Den största fördelen med denna teknik är att man kan upptäcka samspelet mellan NFAT2 och andra transkriptionsfaktorer med kända och nya målgener. Generellt individer nya till denna metod kommer att kämpa eftersom optimal fixering och skjuvning villkor är svåra att fastställa.Att börja fylla en 1,5-milliliter tub med en milliliter av 37%formaldehyd. Fyll sedan ytterligare 1,5-milliliter rör med en milliliter på 1,25 molarlygin i ett fem-milliliter rör med fyra milliliter PBS. Nästa, efter stimulering av cellerna snurra cellerna enligt textprotokollet, och åter upphäva cellerna i 500 mikroliter pbs och placera röret i en isfylld låda.Tillsätt 13,5 mikroliter av 37%formaldehyd till cellerna och blanda genom pipettering upp och ner. Inkubera sedan suspensionen i rumstemperatur. Efter detta, tillsätt 57 mikroliter av 1,25 molar glycin att stoppa fixeringen.Och låt suspensionen inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Omedelbart efter inkubationstiden placera cellerna på is och centrifug cellerna på 500 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Därefter aspirera supernatanten.Därefter tvätta cellerna två gånger med en milliliter iskall PBS vid 200 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten. Resuspend cell pelleten i fem milliliter av lys buffert en genom pipettering upp och ner. Lägg sedan proverna på is och ruvar dem med skakning i 10 minuter.Efter detta centrifugera rören vid 500 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Använd sedan en pipett för att försiktigt ta bort supernatanten. Homogenisera cellerna i fem milliliter av lysbuffert två och pipett upp och ner för att blanda.Sedan inkubera cellerna på is i 10 minuter med skakningar. Efter inkubationstiden centrifug rören vid 500 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius, och försiktigt ta bort supernatant. Därefter resuspend cell pelleten i skjuvning buffert en med 1X proteashämmare.Inkubera sedan cellupphängningen på is i 10 minuter. Överför 140 mikroliter av cellen suspensionen till sonicator rören var noga med att undvika att bilda luftbubblor. Placera rören i en fokuserad-ultraljudsgräns på sju grader Celsius och skjuvning för 10 till sju och 1/2 minuter.Överför cellupphängningen i 1,5-milliliterrör. Centrifugera proverna vid 15, 700 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, och samla supernatanten i ett nytt rör. Förbered först 20 mikroliter protein A-belagd pärlor för varje nederbörd i en 1,5-milliliter tub.Låt pärlorna att bosätta sig på ett magnetiskt rack i en minut, och ta bort supernatanten. Tvätta sedan pärlorna med 40 mikroliter av 1X chip buffert en för varje 20 mikroliter protein A-belagda pärlor genom pipettering upp och ner. Låt pärlorna sätta sig på ett magnetiskt rack i en minut och ta bort supernatanten.Upprepa denna tvättprocess tre gånger till innan du åter upphäver pärlorna i sin ursprungliga volym 1X chIP buffert en. Lägg till BSA proteashämmare, 5X chIP-buffert och ChIP-seq-kvalitet vatten till pärlorna. Lägg sedan till den sakjulerade kromatin.Använd 10 mikrogram anti-NFAT2-antikropp för att fånga upp NFAT2, och 2,5 mikrogram IgG-antikropp som kontroll. Inkubera blandningarna över natten vid fyra grader Celsius på ett hjul som roterar vid sex RPM. Nästa dag snurra rören i fem sekunder vid 7, 000 gånger G och inkubera dem på magnetstället i en minut.Sedan aspirera supernatanten och tvätta pärlorna en gång med tvättbuffertar en, två, tre och fyra i följd. Snurra rören i fem sekunder vid 7000 gånger G innan du inkuberar rören på magnetstället i en minut. Efter detta, ta bort supernatanten och lägg till nästa tvättbuffert.Efter den sista tvätten, snurra rören i fem sekunder på 7000 gånger G.Incubate rören på magnetstället i en minut. Ta bort supernatanten och ta upp pärlorna i 100 mikroliter elueringsbuffert en. Inkubera sedan rören på det roterande hjulet i 30 minuter.Därefter snurrar du kort rören och placerar dem på ett magnetiskt rack i en minut. Överför supernatanten till ett nytt 1,5-milliliterrör och tillsätt fyra mikroliter elueringsbuffert två. För att skapa inspänningsmixen en mikroliter av den savade kromatin med 99 mikroliter elueringsbuffert en och fyra mikroliter elueringsbuffert två.Sedan inkubera proverna i fyra timmar vid 65 grader Celsius med skakningar. Efter detta, tillsätt 100 mikroliter av 100%isopropanol till rören. Vortexa och snurra proverna i fem sekunder vid 7000 gånger G.Then lägga till 10 mikroliter av magnetiska pärlor till varje prov.Vortexa och inkubera proverna på ett roterande hjul i rumstemperatur i en timme. Därefter snurra rören kort och placera dem på en magnetisk rack i en minut. Aspirera supernatanten och resuspend pärlorna i 100 mikroliter av tvätt buffert en.Invertera rören för att blanda och inkubera dem i fem minuter på ett roterande hjul i rumstemperatur. Därefter centrifugera kort rören. Placera dem i ett magnetiskt rack i en minut, och använd en pipett för att ta bort supernatanten.Tillsätt sedan 100 mikroliter av tvättbuffert två. Invertera rören för att blanda och inkubera dem i fem minuter på ett roterande hjul i rumstemperatur. Efter detta centrifugerar kort rören och placerar dem i ett magnetiskt rack i en minut.Ta bort tvättbufferten två via aspiration och resuspend pärlorna i 55 mikroliter elueringsbuffert. För att elera det utfällda DNA inkuberas proverna i ett roterande hjul i rumstemperatur i 15 minuter. Efter detta snurra rören kort och placera dem i en magnetisk rack i en minut.Slutligen överför supernatanten till nya 1,5-milliliterrör. Detta protokoll utfördes först med Jurkat celler analysera LCK som en potentiell NFAT2 mål. Som framgår här, dokumenterades optimala resultat genom betydande anrikning av IL-2 positiva kontroll och LCK DNA.Suboptimal skjuvning eller saknad fixering kan leda till DNA av dålig kvalitet. Slutligen utfördes detta protokoll med primära mänskliga KLL celler med CD40L fungerar som den positiva kontrollen och LCK som experimentella målet. Som framgår av den starka anrikningen av LCK-DNA, är LCK ett direkt NFAT2-mål i primära mänskliga KLL-celler.Otillräcklig skjuvning vilket resulterar i dålig kvalitet DNA kan returnera suboptimala resultat. Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att fixering och ultraljudsbehandling steg är avgörande för framgången med denna metod och kan behöva justeras till cellerna som analyseras.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Infödda kromatin Immunoprecipitation använder murina hjärnan tumören Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Från patientmaterial sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Ett arbetsflöde för dataintegrering för att identifiera läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktioner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulär fraktionering av primära kroniska Lymfocytiska leukemiceller för att övervaka nukleär/Cytoplasmatisk protein handel

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analysera tumör och vävnad distribution av Target Antigen specifik terapeutisk antikropp

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...