Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Bu eser DFG tarafından desteklenen MU 3340/1-1 ve Deutsche Krebshilfe vermek 111134 (her ikisi de M.R.M. için layık) verin. Elke Malenke mükemmel teknik destek için teşekkür ediyoruz).

İnsan malzeme ile yapılan tüm deneylerde Tübingen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Yazılı onam örnekleri bu çalışma için katkıda bulunan tüm hastalardan elde edildi.
1. izolasyon ve stimülasyon Jurkat hücreleri
Not: iletişim kuralı en iyi duruma getirmek için NFAT2 yüksek düzeyde ifade etmek için bilinen Jurkat hücre satırını kullanın. Tüm adımlar laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.
<ol><li>RPMI s...

Başarılı bir çip tahlil yapmak kritik uygun bir antikor yelpazesi ve kesme işlemi25kromatin optimizasyonu adımlardır. ΑNFAT2 antikor seçimini bu protokolü geliştirilmesi sırasında özellikle zor olduğu ortaya çıktı. Birkaç αNFAT2 antikorlar piyasada bulunan ve western Blot için bu inşaat para cezası ve diğer uygulamaların çoğunluğu olmakla birlikte, klon 7A6 başarıyla ChIP7için kullanılan tek antikor yapıldı. Hatta sözde aynı 7A6 antikorla...

CD19, CD23 ve CD5 ayrı birikimi sergilenmesi olgun B ifade1hücreleri, Batı ülkelerinde erişkinlerde en sık görülen lösemi kronik lenfositik lösemi (CLL) temsil eder. Hastaların çoğunda uzun yıllar özel tedavi gerektiren değil bir tembel hastalığı kursu sergi. Buna ek olarak, bazı hastalarda acil tedavi müdahaleler bağışıklık-kemoterapi veya diğer hedefli tedaviler2,3ile gerektiren hızlı ilerleme göster. Nükleer faktör aktive T hücrelerinin (NFAT) transkripsiyon faktörleri çeşitli gelişim kontrol ve harekete geçirmek oluşum içinde çok sayıda hücre türleri4,5,6bir ailedir. Biz son zamanlarda overexpression ve anayasal NFAT2 CLL hücrelerin aktivasyonu hastaların tembel hastalığı7ile gösterdi. Burada, B hücre reseptörü stimülasyon anerji7adı verilen yanıt vermeyen bir durumuna düzenlemektedir. NFAT2 ve lenfosit özel protein Tirozin kinaz (LCK) organizatörü için bağlar LCK ifade insan hücrelerinde CLL, belirli kromatin immunoprecipitation tahlil düzenleyen göstermek için (ChIP) geliştirilen istihdam ve.
Çip transkripsiyon faktörleri gen ifade8' rolünü araştırmak için çeşitli teknikler biridir. Gen ifadesinin sıkıca çok karmaşık bir şekilde çeşitli düzenleyici kurumlar tarafından bu işlemi9,10,11,12' yeri doldurulamaz bir katılan transkripsiyon faktörleri ile orkestra. Zamansal ve mekansal bağlamda Gen ifadesinin düzenlenmesine transkripsiyon faktörleri çok sayıda türü (Örneğin, kalkınma ve farklılaşma)13,14,15'tespit edilmiştir, 16,17,18. Transkripsiyon faktörleri içeren karmaşık denetimi düzenekleri hataları patolojik süreçler kanser19,20de dahil olmak üzere çeşitli için yol açabilir. Bu nedenle, transkripsiyon faktörleri ve ilgili hedeflerine kimliği roman tedavi caddeleri21,22sunabilir. Bu ilginç alan araştırmak için çeşitli yöntemler çip, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan), çeşitli DNA açılan deneyleri ve muhabir-deneyleri8,11,12, gibi kullanılabilir 23 , 24.
Belirli bir transkripsiyon faktörü genom belirli bölgeleri ile etkileşim içinde vivo çip bir ideal tekniği25olduğunu göstermektir. Bu amaçla, DNA ve ilişkili proteinler canlı hücreler arasında UV ışınlama veya formaldehit (çapraz bağlı çip, XChIP) kullanarak çapraz bağlı. Bu adım daha iyi DNA ve protein kurtarma sözde yerli çip (NChIP)26içinde elde etmek için atlanır. DNA-protein kompleksleri daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) ve immunoprecipitated ilgi transkripsiyon faktörü karşı spesifik bir antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden parçalara sonication tarafından nın yaşadığı. İlişkili DNA parçalarının sonra saf ve PCR, moleküler klonlama ve sıralama ile karakterize. İmmunoprecipitated DNA analiz için microarrays (ChIP-on-Chip) veya yeni nesil sıralama (ChIP-Seq) alternatif tekniklerini kullanın.
Çip Gilmour tarafından tanıtılan ilk ve ne zaman onlar kullanılan UV 1984 Lis ışık kovalent kullandığında DNA ve yaşam bağlı proteinler bakteriler27. Hücre lizis ve bakteriyel RNA polimeraz immunoprecipitation bilinen genlerin belirli probları RNA polimeraz yoğunluğu ve in vivo dağıtım eşlemek için kullanılmıştır. Yöntemi daha sonra aynı müfettişler tarafından ökaryotik RNA polimeraz II Isı şok protein genlerinde Drosophila28tarihinde dağıtım analiz etmek için kullanıldı. XChIP tahlil daha fazla Varshavsky ve histon H4 Derneği Isı şok protein genler29,30ile çalışmaya cross-linking formaldehit ilk kullanan iş arkadaşlarınızla tarafından rafine. Doğal olarak sağlam epitopları yüzünden daha iyi bir DNA ve protein kurtarma avantajı taşıyan NChIP yaklaşım ve bu nedenle, daha fazla antikor özgüllük, ilk açıklanan Hebbes ve 198831meslektaşları tarafından.
Çip DNA-protein etkileşimleri analiz etmek için diğer teknikleri ile karşılaştırıldığında aslında, transkripsiyon faktörü gerçek etkileşim incelenen vivo içinde ve hiçbir sondalar olabilir veya yapay koşullar arabellekleri veya jeller tarafından oluşturulan avantajdır 8,11,12istihdam. ChIP yeni nesil sıralama ile birleştirerek, birden çok hedef aynı anda belirlenebilir.
Bu tekniğin büyük sınırlamalar olduğu gibi organizmalar25büyük ölçekli deneyleri kendi sınırlı uygulanabilirliği vardır. Fark gen ifade desenleri analiz de ilgili proteinler düşük seviyelerde sadece ya da dar zaman pencereleri sırasında gösterilir Eğer çip teknikleri kullanarak zor olabilir. Başka bir potansiyel olarak sınırlayıcı faktör çip11için uygun uygun bir antikor durumu olduğunu.
Burada sunulan çip Protokolü hedef genlerin transkripsiyon faktörü in vivo tanımlanması için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tarafından istihdam edilecek. Özellikle, yeni hedef genler CLL NFAT2 tanımlamak için hedefi oldu. Çip doğrudan NFAT2 bağlama organizatörü bölgelere farklı hedef genlerin insan CLL hasta hücrelerinde doğal koşullar altında göstermek için potansiyel nedeniyle seçildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Malign B hücre klonlar genişlemesi ile karakterize ve Batı ülkelerinde en sık görülen lösemi temsil eder. CLL hastaların çoğu hastalığın bir tembel seyrini yanı sıra bir anergic fenotip onların lösemi hücrelerinin dış uyarmaya yanıt vermeyen bir B hücre reseptörü atıfta göster. Biz son zamanlarda transkripsiyon faktörü NFAT2 anerji CLL içinde çok önemli bir regülatör olduğunu göstermiştir. Farklı hastalıkların bir transkripsiyon faktör rol analizinde büyük bir sorun, belirli hedef genlerin tanımlamasıdır. Aydınlatma meydana mekanizmaları ve potansiyel terapötik müdahaleler için çok önemli bu. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein-DNA etkileşimleri göstermek için klasik bir tekniktir ve bu nedenle, doğrudan hedef genlerin transkripsiyon faktörlerin memeli hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, çip doğrudan hedef gen NFAT2 insan CLL hücrelerinde, LCK tanımlamak için kullanıldı. DNA ve ilişkili proteinler formaldehit kullanarak çapraz ve daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) DNA parçaları içine sonication tarafından sheared. NFAT2 ile ilişkili çapraz bağlı DNA parçalarının çoğu o zaman seçime bağlı olarak bir αNFAT2 antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden immunoprecipitated. Arıtma sonra ilişkili DNA parçalarının nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yolu ile tespit edilir. DNA dizileri belirgin zenginleştirme ile genom NFAT2 vivo içindetarafından hedef bölgeleri temsil eder. DNA ve gerekli antikor seçimi uygun kesme için bu yöntemin uygulama başarılı özellikle çok önemli. Bu iletişim kuralı NFAT2 doğrudan etkileşim hedef genleri olan gösteri için idealdir. Büyük ölçekli deneyleri birden fazla transkripsiyon faktörleri bozulmamış canlıda hedef genlerin Analizi çip istihdam için zorluk onun büyük kısıtlamadır.

Şekil 1 CD19-FITC ve CD5-PE antikorlar ile boyama sonra gerçekleştirilen bir CLL hasta bir örnek Akış Sitometresi Analizi gösterir. Şekil 1a lenfositler, perdeleme CLL hastaların kan hücrelerinde çoğunluğu temsil eden gösterir. Şekil 1b gösterir CD19 oranı+/CD5+ CLL hücreleri, %89.03 Bu örnekte lenfositlerin temsil eder. CD19 oranı+/CD5-...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Bu yöntem, potansiyel terapötik müdahaleler geliştirmek için putatif hedef genlerin ve patojenik mekanizmaların belirlenmesi gibi onkoloji alanında önemli bilgilerin sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, NFAT2 ve diğer transkripsiyon faktörlerinin bilinen ve yeni hedef genlerle etkileşimini saptayabilmedir. Optimal fiksasyon ve kesme koşulları kurmak zor olduğundan genellikle bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek.1.5 mililitrelik bir tüpü %37 formaldehit mililitre ile doldurmaya başlamak için. Daha sonra başka bir 1.5 mililitrelik tüpü, beş mililitrelik bir tüpte 1,25 molar glisin mililitresi ve dört mililitre PBS doldurun. Daha sonra, hücrelerin uyarılmasından sonra metin protokolüne göre hücreleri döndürür ve hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alır ve tüpü buz dolu bir kutuya yerzein.Hücrelere 13,5 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Sonra oda sıcaklığında süspansiyon kuluçka. Bundan sonra, fiksasyon durdurmak için 1.25 molar glisin 57 mikrolitre ekleyin.Ve süspansiyonun oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Kuluçka periyodundan hemen sonra hücreleri buza yerve hücreleri 500 kez G'de santrifüj edin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Sonra supernatant aspire.Daha sonra hücreleri bir mililitre buz gibi PBS ile 200 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini beş mililitre likte bir tampon halinde, yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın. Sonra buz üzerine örnekleri koyun ve 10 dakika sallayarak onları kuluçka.Bundan sonra tüpleri 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Sonra dikkatle supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. Hücreleri beş mililitre likis tampon iki ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için homojenize.Sonra sallayarak 10 dakika boyunca buz üzerindeki hücreleri kuluçkaya yatırın. Kuluçka döneminden sonra tüpleri 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, 1X proteaz inhibitörü ile tampon bir kesme hücre pelet yeniden askıya.Sonra hücre süspansiyonuna 10 dakika kuluçkaya yat. Hava kabarcıkları oluşmamak için dikkat alarak sonicator tüpleri hücre süspansiyon 140 mikrolitre aktarın. Tüpleri yedi derece santigrat derecede odaklanmış bir ultrasonicator yerleştirin ve 10 ila 7 ve 1/2 dakika yamaç.Hücre süspansiyonuna 1.5 mililitrelik tüpler aktarın. Numuneleri 15, 700 kez G'de 10 dakika 4 santigrat dereceye kadar santrifüj edin ve süpernatant'ı yeni bir tüpte toplayın. İlk olarak, bir 1.5 mililitrelik tüp her yağış için protein A kaplı boncuk 20 mikrolitre hazırlayın.Boncukbir dakika için bir manyetik raf üzerinde yerleşmek için izin ve supernatant kaldırın. Daha sonra boncukları 40 mikrolitre 1X talaş tamponu ile yıkayın. Boncukbir dakika için bir manyetik raf üzerinde yerleşmek ve supernatant kaldırmak için izin verin.1X chIP tampon bir orijinal hacminde boncuk yeniden askıya önce bu yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın. Boncuklara BSA proteaz inhibitörü, 5X chIP tamponu ve ChIP-seq sınıfı su ekleyin. Sonra, yıkılmış kromatin ekleyin.NFAT2'yi yakalamak için 10 mikrogram anti-NFAT2 antikor ve kontrol olarak 2,5 mikrogram IgG antikor kullanın. Karışımları bir gecede dört santigrat derecede, altı RPM'de dönen bir tekerleküzerinde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün tüpleri 7,000 kez G'de beş saniye döndürün ve bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.Sonra supernatant aspirate ve yıkama tamponlar bir kez boncuk yıkama kayırken bir, iki, üç, ve dört ardışık. Tüpleri manyetik raftaki tüpleri bir dakika kuluçkaya yatırmadan önce 7000 kez G'de beş saniye döndürün. Bundan sonra, supernatant çıkarın ve sonraki yıkama tampon ekleyin.Son yıkamadan sonra tüpleri 7000 kez G.Incubate bir dakika boyunca manyetik raftaki tüpleri beş saniye döndürün. Supernatant çıkarın ve elüsyon tampon bir 100 mikrolitre boncuk almak. Daha sonra dönen tekerleküzerindeki tüpleri 30 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, kısaca tüplerspin ve bir dakika için bir manyetik raf üzerine yerleştirin. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve dört mikrolitre elüsyon tamponu iki ekleyin. Giriş kontrol oluşturmak için bir mikrolitre yıkıntMa kromatin ile 99 mikrolitre elütion tampon bir ve elüsyon tampon iki dört mikrolitre karışımı.Sonra numuneleri 4 saat boyunca 65 derecede sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tüplere% 100 isopropanol 100 mikrolitre ekleyin. Girdap ve 7000 kez G.Then her örnek için manyetik boncuk 10 mikrolitre ekleyin beş saniye boyunca örnekleri spin.Girdap ve bir saat oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde örnekleri kuluçka. Daha sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve bir dakika lığına manyetik bir rafa yerleştirin. Supernatant aspire ve yıkama tampon bir 100 mikrolitre boncuk resuspend.Tüpleri karıştırmak ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırmak için ters çevirin. Sonra, kısaca tüplersantrik. Bir dakika için bir manyetik raf yerleştirin ve supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın.Sonra yıkama tampon iki 100 mikrolitre ekleyin. Tüpleri karıştırmak ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırmak için ters çevirin. Bundan sonra, kısaca tüplersantrik ve bir dakika için bir manyetik raf yerleştirin.Aspirasyon yoluyla yıkama tampon ulaştırılması iki çıkarın ve elüsyon tampon 55 mikrolitre boncuk resuspend. Çökelmiş DNA'yı eleştirmek için numuneleri oda sıcaklığında dönen bir tekerleğe 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve bir dakika lığına manyetik bir rafa yerleştirin.Son olarak, yeni 1.5 mililitrelik tüpler için supernatant aktarın. Bu protokol ilk olarak Jurkat hücreleri ile potansiyel bir NFAT2 hedefi olarak LCK'yi analiz ederek gerçekleştirilmiştir. Burada gösterildiği gibi, il-2 pozitif kontrol ve LCK DNA'sının önemli ölçüde zenginleşmesi ile optimal sonuçlar belgelenmiştir.Suboptimal kesme veya eksik fiksasyon düşük kaliteli DNA yol açabilir. Son olarak, bu protokol cd40L pozitif kontrol ve Deneysel hedef olarak LCK hizmet veren birincil insan CLL hücreleri ile yapılmıştır. LCK DNA'sının güçlü zenginleşmesi ile gösterildiği gibi, LCK birincil insan CLL hücrelerinde doğrudan NFAT2 hedefidir.Yetersiz yamultma ile sonuçlanan yetersiz kaliteDE DNA, optimal olmayan sonuçları geri getirebilir. Bu yordamı denerken fiksasyon ve sonication adımları bu yöntemin başarısı için çok önemli olduğunu ve analiz edilen hücrelere ayarlanması gerekebilir hatırlamak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Fare Beyin tümör Neurospheres kullanarak yerel Kromatin Immunoprecipitation

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Kronik Lenfositik Lösemi içinde immünglobulin Gene dizi analizi: Sıra yoruma hasta malzemeden

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedefleyen İlaç Kombinasyonlarını Tanımlamak için Veri Entegrasyonu İş Akışı

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...