Name: adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

ونشكر بيرجاكي كريستينا، تونغ تاو والشمال أليسون من مركز الموارد بيويماجينج في جامعة روكفلر للمساعدة والدعم. ونشكر أيضا إكسيفياس قة تشو لتحرير الفيلم. وأيد هذا العمل بالبشرية الحدود العلوم برنامج المنظمة (PC).

وأجريت وفقا للإجراءات التي أقرتها لجنة الاستخدام في جامعة روكفلر ورعاية الحيوان مؤسسية رعاية الحيوان والتجريب.
1-إعداد الأنسجة
<ol><li>إجراء نضح intracardiac القياسية مع ~ 20 مل من 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية حتى تتم إزالة الدم تماما من الأنسجة.</li>
	<li>قم بالتبديل بير...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

أديبو--واضح هو أسلوب مباشر وقوى لإزالة الأنسجة الدهنية، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في إعداد مختبر عادية. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المقاصة على أساس مذيب مثل إيديسكو/11،إيديسكو +10،12، أديبو واضحة هو الأمثل خاصة لإزالة الأنسجة الدهنية وال...

وحتى وقت قريب، كان تصور الأنسجة الدهنية كمجموعة غير متبلور من الخلايا الدهنية. على مدى العقود القليلة الماضية، نمت فهمنا أكثر تطورا، مع الدهون من المعترف به الآن أن يكون جهازا معقدة التي تحتوي على أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية، والخلايا الليفية، والمفرج وإسقاطات العصب. التفاعلات بين هذه الخلايا الدهنية-المقيم وضوحاً آثار في الأنسجة الدهنية وفسيولوجيا العضوي والفيزيولوجيا المرضية1. على الرغم من أن الدراسات الناشئة قد متدهور أهمية الآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض التفاعلات، يتطلب فهم أكثر شمولاً التنميط الهيكلية موثوقة من الأنسجة كاملة في الأبعاد الثلاثة (3D).
معرفتنا الحالية مورفولوجيا الأنسجة الدهنية يستند إلى حد كبير على التحليل النسيجي لأقسام رقيقة (5 ميكرومترات) مع تصوير نسبيا عالية التكبير (أكثر من 10 X)2،3. غير أن هذا النهج قد عدة قيود كبيرة. هياكل الخيطية أولاً، معقدة مثل الأعصاب متعاطفة والمفرج، التي من المعروف أن تلعب أدواراً هامة في الدالة الدهنية4،5،،من67، يصعب تقييمها من خلال أقسام رقيقة. ثانيا، بسبب شكله غير متبلور على ما يبدو وعدم وجود ممثل الوحدات الهيكلية للتركيز على، من الصعب نقدر هياكل الأنسجة الدهنية التي تستند فقط إلى تلطيخ الباب. وثالثاً، قد الأنسجة الدهنية محتوى دهني مرتفع جداً، يخلق تحديات في الحصول على مقاطع المسلسل متسقة مناسبة للتعمير تشريحية ثلاثية الأبعاد، طريقة تقليدية المستخدمة في دراسة مورفولوجية الدماغ كله8. ونظرا لهذه العوامل، وهناك حاجة كبيرة لاتباع نهج كل جبل يمكن تقديم التصور ثلاثي الأبعاد لمستودع الدهنية كاملة بينما لا يزال تحقيق القرار الخلوية.
3D التصوير الحجمي للجهاز أكمله يمثل تحديا بسبب آثار obscuring مبعثر الخفيفة. ويأتي مصدرا رئيسيا تشتت الضوء في الأنسجة البيولوجية من الواجهات المائية الدهنية. على الرغم من أن الجهود الرامية إلى القضاء على مبعثر بإزالة الدهون كانت مستمرة لأكثر من قرن، كانت هناك عدد كبير من الابتكارات الأخيرة9. أحد هذه الأساليب إزالة الأنسجة المطورة حديثا تصوير 3D إيمونولابيلينج-تمكين أجهزة مسح مذيب (إيديسكو/إيديسكو +)10،11. بيد أن الأنسجة الدهنية يمثل تحديا خاصا نظراً للمستوى المرتفع من الدهون، ومن ثم، تعديلات إضافية إيديسكو/إيديسكو + البروتوكول المطلوبة لاستخراج الدهون الكامل بينما تحمي الأنسجة من الانهيار. يستخدم بروتوكول تعديل وضعنا، وتسمى الآن أديبو-واضحة، ديليبيديشن على الميثانول/الميثان من الأنسجة الدهنية لتحقيق الشفافية المثلى المناسبة ل التصوير الحجمي عالية الدقة12. نظراً ديليبيديشن خطوة إلى حد كبير يروي اندوجينوسلي أعرب عن الفلورسنت البروتينات مثل التجارة والنقل وطلب تقديم العروض، ويجب تحقيق التصور هذه البروتينات قبل إيمونولابيلينج. عموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسيطة وقوية لدراسة المنظمة مستوى الأنسجة من الخلايا الدهنية-المقيم، وتتبع نسب الخلايا السلف adipocyte، و morphogenesis الدهنية أثناء التطوير.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

الأنسجة الدهنية يلعب دوراً مركزياً في التوازن الطاقة وثيرموريجوليشن. وهو يتألف من أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية والليفية، والأوعية الدموية والعصب الإسقاطات. على الرغم من أن قد جرى تحديد السيطرة الجزيئية لتحديد نوع الخلية وكيف تتفاعل هذه الخلايا يزداد، فهم أكثر شمولاً لهذه الخلايا الدهنية-المقيم يمكن أن يتحقق بتصور التوزيع والهندسة المعمارية في جميع أنحاء النسيج كله. نهج إيمونوهيستوتشيميستري والفلوره الحالية لتحليل الأنسجة الدهنية تعتمد على مقاطع رقيقة جزءا لا يتجزأ من البارافين. ومع ذلك، التقاط المقاطع رقيقة سوى جزء صغير من النسيج؛ كنتيجة لذلك، يمكن أن يكون متحيزا الاستنتاجات التي توصل إليها بما هي جزء من الأنسجة ويتم تحليل. ولذلك وضعنا أنسجة الدهنية مسح تقنية، أديبو واضحة، للسماح التصور ثلاثي الأبعاد الشاملة لأنماط الجزيئية والخلوية في الأنسجة الدهنية كله. أديبو واضحة وقد تم تكييف من إيديسكو/إيديسكو +، مع التعديلات المحددة التي لإزالة الدهون المخزنة في الأنسجة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الأصلية تماما. بالاقتران مع ورقة الضوء الفلورية مجهرية، نبدي هنا استخدام الأسلوب أديبو واضحة للحصول على صور عالية الاستبانة الحجمي للأنسجة الدهنية أكملها.

أديبو--واضحة أعد الدهون كله يمكن تصويرها منصات في 3D لتحليل كيف تتأثر التفاعلات الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة في الولايات الهزيل والسمنة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة تحليل هيكل الدهنية العامة بجمع الإشارات أوتوفلوريسسينسي الأنسجة في قناة الأخضر. أظهرنا سابقا أن أوتوفلو...

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

سبب المحتوى الدهني المرتفع، قد تم الطعن في الأنسجة الدهنية تصور استخدام الأساليب التقليدية في غذائها. أديبو--واضح هو منديل مسح تقنية تسمح العلامات قوية وعالية الدقة التصوير الفلورسنت الحجمي للأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف الأساليب لإعداد نموذج المعالجة المسبقة وتلطيخ والمقاصة، والمتصاعدة للتصوير.

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Research

JoVE Journal

Biology

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

الكمية مقارنة رابطة الدول المستقلة التنظيم العنصر (لجنة المساواة العرقية) في الأنشطة المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-المعزوفة: المقاصة الأنسجة البيولوجية وطرق Immunolabeling للتصوير حجم

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

استكشاف بنية الأنسجة الدهنية من ميثيل ساليسيلات المقاصة والتصوير ثلاثي الأبعاد

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...