Name: adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Nous remercions Christina Pyrgaki, Tao Tong et Alison North de la Bioimaging Resource Center à l’Université Rockefeller pour assistance et soutien. Nous remercions également Xiphias Ge Zhu d’édition des films. Ce travail a été soutenu par le Human Frontier Science Program organisation (PC).

Expérimentation et protection des animaux ont été réalisés selon les procédures approuvées par la Commission institutionnelle animalerie et utilisation à l’Université Rockefeller.
1. préparation du tissu
<ol><li>Effectuer une perfusion intracardiaque standard avec environ 20 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C jusqu'à ce que le sang est complètement retiré du tissu.</li>
	<li>Lancez le perfusat à ~ 20 mL de solution de fixation (4 % paraformal...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

Adipo-Clear est une méthode simple et robuste pour dégager le tissu adipeux, qui peut être facilement effectué dans une configuration de laboratoire réguliers. En comparaison avec d’autres méthodes de nettoyage à base de solvants tels qu’iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear est particulièrement optimisé pour dégager le tissu adipeux et autres tissus à haute teneur en matières grasses. L’étape de délipidatio...

Jusqu'à tout récemment, le tissu adipeux a été conçu comme une collection amorphe de cellules graisseuses. Dans les dernières décennies, notre compréhension s’est développée plus sophistiquée, avec de la graisse, maintenant reconnue comme un organe complexe contenant différents types d’adipocytes, ainsi que les précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, les fibroblastes, la vascularisation et projections nerveuses. Interactions entre ces cellules résidentes adipeux ont des effets marqués sur le tissu adipeux et organismique physiologie et physiopathologie1. Bien que les nouvelles études ont démêlé importants mécanismes moléculaires de certaines interactions, une compréhension plus globale requiert un profilage structurelle fiable du tissu tout en trois dimensions (3D).
Nos connaissances actuelles de la morphologie du tissu adipeux est largement basée sur l’analyse histologique des sections minces (5 μm) avec l’imagerie relativement fort grossissement (plus de 10 X)2,3. Toutefois, cette approche présente plusieurs limites importantes. Tout d’abord, complexes de structures filamenteuses comme les nerfs sympathiques et le système vasculaire, qui sont connus pour jouer un rôle important dans le tissu adipeux fonction4,5,6,7, sont difficiles à évaluer par le biais de coupes minces. Deuxièmement, en raison de sa forme apparemment amorphe et le manque d’unités structurales représentatifs de se concentrer sur, il est difficile d’apprécier le tissu adipeux structures basées uniquement sur la section coloration. En troisième lieu, le tissu adipeux a une teneur très élevée en lipides, en créant des défis dans l’obtention des coupes sériées cohérentes qui se prêtent à une reconstruction anatomique 3D, une méthode conventionnelle utilisée pour étudier le cerveau entier morphologie8. Compte tenu de ces facteurs, il y a un grand besoin d’une approche toute monture qui peut fournir une visualisation 3D d’un dépôt de tissu adipeux ensemble tout en permettant la résolution cellulaire.
L’imagerie volumétrique 3D d’un organe entier est difficile en raison des effets masquant des nuages de points lumineux. Une source majeure de facteur de diffusion dans les tissus biologiques provient d’interfaces lipide aqueux. Bien que les efforts pour éliminer les nuages de points en supprimant les lipides ont été en cours pendant plus d’un siècle, on a un grand nombre de ces dernières innovations9. Une de ces méthodes nettoyage des tissus nouvellement développée est imagerie 3D compatible immunomarquage des organes cote de solvant (iDISCO / iDISCO +)10,11. Cependant, le tissu adipeux représente un défi particulier compte tenu de son niveau élevé de lipides et par conséquent, des modifications supplémentaires à l’iDISCO / iDISCO + protocole sont requis pour extraire complètement les lipides tout en protégeant le tissu de s’effondrer. Le protocole modifié, que nous avons mis au point, maintenant appelé Adipo-Clear, emploie méthanol/à base de dichlorométhane délipidation du tissu adipeux à une transparence optimale convenant à haute résolution d’imagerie volumétrique12. Parce que la délipidation étape désaltère exprimés en grande partie les protéines fluorescentes comme GFP et DP, visualisation de ces protéines doit être atteint par immunomarquage. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué pour étudier l’organisation tissulaire au niveau des cellules résidentes adipeux, traçage de la lignée de cellules progénitrices adipocytaire et morphogenèse adipeuse au cours du développement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Le tissu adipeux joue un rôle central dans l’homéostasie énergétique et la thermorégulation. Il est composé de différents types d’adipocytes, comme précurseurs adipocytaires, cellules immunitaires, fibroblastes, les vaisseaux sanguins et les projections nerveuses. Bien que le contrôle moléculaire de précision du type de cellule et de l’interaction de ces cellules ont été délimitées de plus en plus, une compréhension plus approfondie de ces cellules résidentes adipeux est possible en visualisant leur distribution et leur architecture tout au long du tissu entier. Approches existantes d’immunohistochimie et immunofluorescence pour analyser l’histologie adipeuse s’appuient sur des coupes minces de paraffine. Toutefois, des coupes minces ne capturent qu’une petite partie du tissu ; en conséquence, les conclusions peuvent être biaisées par quelle partie du tissu est analysée. Nous avons donc développé un technique de compensation Adipo-Clear, afin de permettre une visualisation en trois dimensions complète des modèles moléculaires et cellulaires dans les tissus adipeux tout le tissu adipeux. Adipo-Clear est une adaptation d’iDISCO / iDISCO +, avec des modifications spécifiques apportées à supprimer complètement les lipides stockés dans les tissus tout en préservant la morphologie tissulaire native. En combinaison avec la microscopie en fluorescence lumière-feuille, nous démontrons ici l’utilisation de la méthode Adipo-Clear pour obtenir des images haute résolution volumétriques d’un tissu adipeux ensemble.

Adipo-Clear préparé toute graisse tampons peuvent être photographiées en 3D pour analyser comment les interactions de tissu cellulaire et de morphologie sont affectées dans les États de maigres et obèses. Cette méthode peut être facilement appliquée pour analyser la structure adipeuse générale en recueillant le tissu autofluorescence signal dans le canal vert. Nous avons montré précédemment que l’autofluorescence signal en superpositions adipeuses favorablement avec peril...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

En raison de la teneur élevée en lipides, le tissu adipeux a été difficile à visualiser à l’aide des méthodes histologiques traditionnelles. Adipo-Clear est un tissu technique qui permet l’étiquetage robuste et une imagerie de fluorescence volumétrique du tissu adipeux de compensation. Nous décrivons ici les méthodes de préparation des échantillons, prétraitement, la coloration, la compensation et montage pour l’imagerie.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

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