Name: adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Christina Pyrgaki, Tao Tong und Alison North aus Bioimaging Resource Center an der Rockefeller University für Hilfe und Unterstützung. Wir danken auch Xiphias Ge Zhu zum Film bearbeiten. Diese Arbeit wurde von Human Frontier Science Programm Organisation (PC) unterstützt.

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss an der Rockefeller University durchgeführt.
(1) Gewebe-Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie standard intrakardialen Perfusion mit ~ 20 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C, bis das Blut aus dem Gewebe vollständig entfernt wird.</li>
	<li>Wechseln Sie die Perfusat zu ~ 20 mL Fixativ Lösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer) bei 4 ° C, bis de...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. 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S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

Adipo-Clear ist eine einfache und robuste Methode für das clearing von Fettgewebe, die leicht in eine reguläre Laboraufbau durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu anderen lösemittelhaltigen Clearing-Methoden wie iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear ist besonders optimiert für das clearing von Fettgewebe und andere Gewebe mit hohem Fettgehalt. Der delipidierung Schritt vollständig entfernt Lipide aus Fettgewebe, und dah...

Bis vor kurzem war Fettgewebe als eine amorphe Sammlung von Fettzellen konzipiert. In den vergangenen Jahrzehnten hat unser Verständnis mit Fett jetzt erkannt, um ein komplexes Organ, enthält verschiedene Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, das Gefäßsystem und Nerv Projektionen werden anspruchsvoller, gewachsen. Interaktionen zwischen diesen Fettgewebe-Resident-Zellen haben Auswirkungen auf Fettgewebe und organismal Physiologie und Pathophysiologie1ausgesprochen. Obwohl neue Studien wichtigere molekularen Mechanismen, die bestimmte Interaktionen entwirrt haben, erfordert ein umfassenderes Verständnis zuverlässige strukturelle Profilierung des gesamten Gewebes in drei Dimensionen (3D).
Unseren derzeitigen Kenntnissen von Fettgewebe Morphologie basiert größtenteils auf histologische Analyse von Dünnschliffen (5 μm) mit relativ hoher Vergrößerung Bildgebung (mehr als 10 X)2,3. Dieser Ansatz hat jedoch einige erhebliche Einschränkungen. Erste, komplizierte faserigen Strukturen wie sympathischen Nerven und das Gefäßsystem, die bekanntermaßen die adipösen Funktion4,5,6,7eine wichtige Rolle spielen, sind schwer zu bewerten durch dünne Abschnitte. Zweitens aufgrund seiner scheinbar amorphe Form und das Fehlen von repräsentativen strukturelle Einheiten zu konzentrieren, ist es schwierig, Fettgewebe Strukturen basierend nur auf Abschnitt Färbung zu schätzen wissen. Drittens, Fettgewebe hat einen sehr hohen Fettgehalt, schaffen Herausforderungen bei der Beschaffung konsequent Serienschnitte, die geeignet sind für 3D anatomische Rekonstruktion, einer konventionellen Methode verwendet, um ganze Gehirn Morphologie8zu studieren. Angesichts dieser Faktoren gibt es ein großer Bedarf für einen ganzen-Mount-Ansatz, der 3D-Visualisierung eines gesamten Fettgewebe-Depots und noch eine zelluläre Auflösung bieten kann.
Volumetrische 3D-Bildgebung eines ganzen Organs ist schwierig wegen der verhüllenden Auswirkungen der Lichtstreuung. Eine wichtige Quelle der Lichtstreuung in biologischen Geweben kommt von Lipid-wässrige Schnittstellen. Obwohl die Bemühungen um die Streuung zu beseitigen, indem Sie Lipide entfernen laufende für über ein Jahrhundert gewesen, gab es eine große Anzahl von jüngsten Innovationen9. Eine solche neu entwickelte Gewebe-Clearing-Methode ist Immunolabeling-fähigen 3D-Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO / iDISCO +)10,11. Fettgewebe stellt jedoch eine besondere Herausforderung dar, die aufgrund ihrer hohen Lipide, und daher zusätzliche Änderungen an der iDISCO / iDISCO + Protokoll sind erforderlich, um vollständig die Lipide extrahieren und schützt das Gewebe vor dem Kollaps. Das geänderte Protokoll, die, das wir entwickelt haben, jetzt genannt Adipo-Clear, beschäftigt Methanol/Dichlormethan-basierte delipidierung von Fettgewebe, geeignet für hochauflösende Volumetrische Bildverarbeitung12optimalen Transparenz zu erreichen. Da die delipidierung Schritt weitgehend Quenchen endogen ausgedrückt fluoreszierende Proteine wie GFP und RFP, muss Visualisierung solcher Proteine durch Immunolabeling erzielt werden. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um Gewebe-Organisation von Fettgewebe ansässige Zellen untersuchen Abstammung Rückverfolgung Adipocyte Vorläuferzellen und adipösen Morphogenese während der Entwicklung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Fettgewebe spielt eine zentrale Rolle im Energie-Homöostase und Thermoregulation. Es besteht aus verschiedenen Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven Projektionen. Obwohl die molekularen Steuerung der Zelle Typspezifikation und wie diese Zellen interagieren zunehmend abgegrenzt, ein umfassenderes Verständnis dieser Fettgewebe-Resident-Zellen lässt sich durch die Visualisierung ihrer Verteilung und Architektur durch das ganze Gewebe. Bestehenden Immunohistochemistry und Immunfluoreszenz Ansätze für adipöse Histologie analysieren setzen auf Paraffin-eingebetteten Dünnschliffe. Dünnschliffe erfassen jedoch nur einen kleinen Teil des Gewebes; Infolgedessen können die Schlussfolgerungen voreingenommen sein, durch welchen Teil des Gewebes analysiert wird. Daher haben wir ein Fettgewebe, clearing-Technik, Adipo-Clear, um umfassende dreidimensionale Visualisierung der molekularen und zellulären Muster in ganze Fettgewebe zu ermöglichen. Adipo-Clear wurde von iDISCO / iDISCO +, mit spezifischen Änderungen gemacht, um vollständig zu entfernen die Lipid unter Beibehaltung der nativen Gewebe Morphologie im Gewebe gespeichert. In Kombination mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie zeigen wir hier die Verwendung von der Adipo-Clear-Methode, um hochauflösende volumetrischen Bilder von einer gesamten Fettgewebe zu erhalten.

Adipo-Clear bereit ganze Fett Pads abgebildet werden können, in 3D zu analysieren, wie Gewebe Morphologie und zellulären Interaktionen in den mageren und fettleibigen Staaten betroffen sind. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um allgemeine adipösen Struktur zu analysieren, durch das Sammeln von Gewebe Autofluoreszenz Signal in den grünen Kanal. Wir haben bereits gezeigt, dass die Autofluoreszenz Signal in adipösen Überlagerungen günstig mit Perilipin Färbung, eine häufi...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Research

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