Name: adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

אנו מודים כריסטינה שממוקמים טאו טונג, אליסון צפון, מרכז המשאבים Bioimaging באוניברסיטת רוקפלר לקבלת סיוע ותמיכה. אנו מודים גם Xiphias ג ' נרל אלקטריק ז'ו לעריכת הסרט. עבודה זו נתמכה על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הארגון (PC).

טיפול בבעלי חיים וניסוי בוצעו על פי הנהלים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה ב אוניברסיטת רוקפלר.
1. רקמות הכנה
<ol><li>לבצע זלוף intracardiac רגיל ~ 20 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עד שהדם יוסר לחלוטין הרקמה.</li>
	<li>לעבור את perfusate ~ 20 מ"ל של פתרון מקבע (4% paraformaldehyde (PFA...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

Adipo-ברור היא שיטה פשוטה וחזק שהבהרת רקמת שומן, אשר ניתן בקלות לבצע התקנה במעבדה רגילה. לעומת שיטות ניקוי ממס מבוסס אחרות כגון iDISCO / iDISCO10,11,12, פנוי Adipo ממוטבת במיוחד לניקוי רקמת שומן ורקמות אחרות עם תכולת שומן גבוהה. הצעד delipidation לחלוטין מסיר ש...

עד לאחרונה, רקמת שומן היה יזום של כמו אוסף אמורפי של תאי שומן. במהלך העשורים האחרונים, ההבנה שלנו גדלה מתוחכמים יותר, עם שומן שהוכר להיות איבר מורכבים המכילים סוגים שונים של adipocytes, כמו גם סימנים מקדימים adipocyte, תאים חיסוניים, fibroblasts, להערכת ו עצבים תחזיות. אינטראקציות בין תאים אלה שוכנות שומן יש מבטאים את ההשפעות על רקמת שומן, הפיזיולוגיה organismal, פתופיזיולוגיה1. למרות מחקרים המתעוררים יש פרם חשוב המנגנונים המולקולריים שבבסיס אינטראקציות מסוימות, הבנה מקיפה דורש פרופילים מבניים אמין של הרקמה כולו בתלת מימד (3D).
הידע הנוכחי שלנו של רקמת שומן מורפולוגיה מבוססת במידה רבה על ניתוח היסטולוגית סעיפים דקים (5 μm) עם הדמיה ההגדלה גבוהה יחסית (יותר מ 10 X)2,3. עם זאת, גישה זו יש מספר מגבלות משמעותיות. מבנים filamentous הראשון, מורכבות כגון העצבים הסימפתטית, להערכת את, אשר ידועים תפקיד חשוב הפונקציה אדיפוז4,5,6,7, שקשה להעריך באמצעות סעיפים דקים. שנית, בשל צורתה לכאורה אמורפי ואת חוסר נציג יחידות המבניים להתמקד, קשה להעריך את רקמת שומן מבנים המבוססת רק על סעיף מכתים. שלישית, רקמת שומן יש תוכן שומנים בדם גבוהה מאוד, יצירת אתגרים בהשגת עקבי מקטעים טורי המתאימים לטיפול שיקום אנטומי תלת-ממד, שיטה המקובלת ללמוד כל המוח מורפולוגיה8. בהינתן הגורמים הללו, יש צורך בגישה כולה-הר זה יכול לספק לוויזואליזציה תלת-ממדית של דיפו אדיפוז כולו תוך השגת עדיין את הרזולוציה הסלולר.
נפחי הדמיה ממוחשבת של איבר שלם הוא מאתגר בשל ההשפעות טשטוש של פיזור אור. המקור העיקרי של פיזור אור ברקמות ביולוגיות נובע ממשקים השומנים-מימית. למרות מאמצי ההכחדה של פיזור על-ידי הסרת שומנים כבר מתמשך עבור מעל למאה שנה, היו מספר רב של החידושים האחרונים9. אחת השיטות ניקוי רקמות פיתח כזה היא מאופשר immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של איברים הממס-והפנים (iDISCO / iDISCO +)10,11. עם זאת, רקמת שומן מהווה אתגר מסוים נתון רמה גבוהה של שומנים, ולכן, שינויים נוספים iDISCO / iDISCO + פרוטוקול נדרשים באופן מלא תמצית ליפידים תוך הגנה על הרקמה מפני קריסה. פרוטוקול ששונה שפיתחנו, כעת נקרא Adipo-נקי, מעסיקה מבוססת על מתנול/דיכלורומתאן delipidation של רקמת שומן כדי להשיג שקיפות אופטימלית מתאים דימות ברזולוציה גבוהה הנפחי12. כי delipidation צעד בעיקר מרווה endogenously הביע פלורסנט חלבונים כמו GFP ו- RFP, ויזואליזציה של חלבונים כזאת חייבת להיות מושגת על ידי immunolabeling. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט וחזק יכול להיות מיושם ללמוד רקמות ברמת הארגון של תאי שומן-תושב, עקיבה השושלת adipocyte ובתאים, מורפוגנזה אדיפוז במהלך הפיתוח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

רקמת שומן ממלאת תפקיד מרכזי אנרגיה הומאוסטזה ומתת הומיאותרמיות. הוא מורכב מסוגים שונים של adipocytes, וכן סימנים מקדימים adipocyte תאים חיסוניים, fibroblasts, כלי דם, עצבים תחזיות. למרות שליטה מולקולרית של התא סוג מפרט ואת האינטראקציה תאים אלה יש כבר יותר ויותר התחום, הבנה מקיפה יותר של תאים אלה שוכנות שומן יכולה להיות מושגת דמיין שלהם הפצה ואדריכלות לאורך כל הרקמה שלם. אימונוהיסטוכימיה קיימות גישות immunofluorescence לנתח היסטולוגיה אדיפוז להסתמך על סעיפים פרפין-מוטבע דק. עם זאת, חלקים דקים ללכוד רק חלק קטן של רקמה; כתוצאה מכך המסקנות עלולים להיות מוטים על ידי ניתוח מה החלק של רקמות. לכן פיתחנו של רקמת שומן פינוי טכניקה, Adipo-נקי, להתיר ויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה דפוסי מולקולרית, תאית ברקמות adipose שלם. Adipo-ברור היה ממאמרו של iDISCO / iDISCO +, עם שינויים מסוימים שבוצעו כדי להסיר לחלוטין את השומנים מאוחסן ברקמות תוך שמירה על מורפולוגיה רקמה מקורית. בשילוב עם מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, נדגים כאן את השימוש בשיטת Adipo פנוי כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה הנפחי של רקמת שומן כולו.

פנוי Adipo מוכן כל שומן רפידות יכול לדימות תלת-ממד כדי לנתח כמה אינטראקציות סלולרי ומורפולוגיה רקמות מושפעות בארה ב רזה והשמנה. בשיטה זו ניתן להחיל בקלות כדי לנתח מבנה אדיפוז כללי על ידי איסוף האות autofluorescence רקמות בערוץ ירוק. אנחנו בעבר הראו כי autofluorescence את אות בכיסויי אדיפוז...

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

בשל התכנים שומנים גבוהה בדם, מאתגרת רקמת שומן להמחיש היסטולוגית בשיטות מסורתיות. Adipo-ברור הוא רקמה פינוי טכניקה המאפשרת תיוג חזקים, דימות ברזולוציה של פלורסנט הנפחי של רקמת שומן. כאן, אנו מתארים את שיטות הכנת הדוגמא, רעלני, מכתים, ניקוי של הרכבה עבור הדמיה.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Research

JoVE Journal

Biology

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...