Name: immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en SBIR grant (1R44EY027654-01A1).

Alle procedurer med mus blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendes af children's Hospital Oakland Research Institute dyrs pleje og brug udvalg og levet op til foreningen for forskning i Vision og oftalmologi (ARVO) redegørelse for brug af dyr i oftalmologiske og vision forskning.
1. væv forberedelse til immunfarvning
<ol><li>Aflive C57 BL/6J mus på embryonale dag (E) 16, postnatal dag (P) 0, P15 og P90 af kuldioxid (CO2) efterfulgt af halshugning (E16 og P0 mus).</li>
	<li>Umiddelbart enucleate mus øjne punkteret med 29G 1/2 nål på den dorsale side af øjet. Inkuber i 5 minutter (min) i 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbufferet saltopløsning (1 x PBS) pH 8,0 ved stuetemperatur.</li>
	<li>For at øjet kopper fra P0, P15 og P90, dissekere ud hornhinden og linse med fine oftalmologiske saks, mens øjnene er i 4% PFA. Bemærk: Spring dette trin for E16 øjne som øjnene er for lille.</li>
	<li>Fix øje kopper (P0, P15 og P90) og de hele øjne (E16) i 4% PFA i 20 min. ved stuetemperatur. Derefter vaskes øje kopper og hele øjne to gange i 1 mL af 1 x PBS i 10 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Cryoprotect øjet kopper og hele øjne i 1xPBS, pH 8,0 indeholdende 10% saccharose i 1 time. Holde i 20% saccharose i 1 x PBS i 1 time og derefter mætte i 30% saccharose i 1 x PBS natten over ved 4 ° C.</li>
	<li>Den næste dag, integrere øje kopper og hele øjnene i optimal opskæring temperatur sammensatte (OLT), (500 µL) i cryomolds, snap-fryse i et bad med tøris/ethanol og opbevares ved-80 ° C.</li>
	<li>Fjern skimmelsvampe med integrerede øje kopper og hele øjne fra-80 ° C og lad Blandingen henstår til-20 ° C i 1 time før cryosectioning.</li>
	<li>Skære retinal tværsnit (12 µm tykt) parallel med temporonasal akse gennem synsnerven hovedet ved hjælp af en kryostaten ved-20 ° C.</li>
	<li>Montere retinal sektioner på mikroskop slides53 og opbevares ved-80 ° C.</li>
</ol>2. immunfarvning med 5-mC og 5-hmC antistoffer
<ol><li>Omringe de retinale sektioner monteret på dias med en hydrofobe barriere pen. Hydrofobe barriere pen reducerer mængden af antistof forpligtet til at plette væv.</li>
	<li>Vaske de retinale sektioner med 200 µL 1 x PBS i 10 min.</li>
	<li>Permeabilize de retinale sektioner med 200 µL af 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS (PBS-T) i 10 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Denaturere retinal sektioner for 30 min med 200 µL af frisklavet 2 N saltsyre (HCl) i 1 x PBS i et 37 ° C inkubator. Bemærk: Omhyggelig titrering af HCl behandling er nødvendig for at optimere 5mC signal.</li>
	<li>Altid omfatte biologiske flergangsbestemmelser (3-4) mens optimering 5mC signal54. Bemærk: Vi gjorde antigen hentning på 4 tid point (15 min, 30 min, 1 og 2 h) og fundet 30 min inkubation er optimal for 5mC signal. Længere inkubering med HCl nedbryder struktur af kerner fører til manglende evne til at lokalisere 5mC signal til kernen.</li>
	<li>Efter denaturering, neutralisere retinal sektioner ved at tilføje 100 µL af 0,1 M Tris-HCl (pH 8.3) på retinal sektioner i 10 min.</li>
	<li>Inkuber sektioner i 500 µL af blokering løsning (5% preimmune normale ged serum i 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.</li>
	<li>Efter blokering, tilføje anti-5mC; anti-5hmC antistoffer fortyndet 1: 500 i blokerende løsning til de retinale sektioner.</li>
	<li>Inkuber retinal sektioner natten over ved 4 ° C i fugtigt kammer.</li>
	<li>Den næste dag vask, retinal afsnit 3 gange (10-15 min. hver gang) med 0,1% PBS-T og derefter inkuberes i blokerende løsning med de tilsvarende sekundære antistoffer (ged anti-kanin og ged anti-mus IgG, fortyndet; 1:1000), der indeholder DAPI (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) løsning (1 µg/mL) ved stuetemperatur i 1 time i blokerende løsning. Bemærk: Undgå tørring af sektioner i alle faser af immunodetection.</li>
	<li>Vaske dias tre tid med 1 mL 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Efter den sidste vask, montere sektioner med vandig montering medium under en coverslip og forsegle med farveløs neglelak.</li>
</ol>3. Konfokal Immunohistokemi
<ol><li>Orientere sektioner for at få den retinale pigment epitel side af optik cup altid vender en måde (f.eks. op) til konsistens.</li>
	<li>Udføre billedoptagelse af immunostained retinal sektioner på 63 X (forstørrelse af en mål linse) med 2 X eller 3 X zoom.</li>
	<li>Generere flere optiske dele af hver valgte billede (z-stakke) i alle 3 kanaler (rød, grøn og blå, RGB) bruger 0,35 µm-trin. NOTE: Den endelige forstørrelse af modellen visualiseret på 10-20 X (forstørrelse af en mål linse) vil være 63 X, henholdsvis, når kombineret med en (typisk anvendte) 10 X okulær linsen. Visualisere komprimeret optisk stakken for at finde 5mC og 5hmC signalet</li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

DNA methylering og hydroxymethylation er dynamisk og reversible DNA ændringer, som modulatethe bred vifte af biologiske mekanismer i en udvikling såvel som i postmitotic celler. Her, vi beskriver en reproducerbar teknik til påvisning af 5mC og 5hmC DNA ændringer i situ ved immunhistokemiske teknik (ved hjælp af anti-5mC og anti-5hmC antistoffer) i PARAFORMALDEHYD-fast frosne dele af musen nethinden, og give retningslinjer for at forbedre og standardisere resultaterne, især når man sammenligner flere forskellige enheder. Vi tidligere brugte denne metode til at afgrænse 5mC ændringer i mus nethinden med retina-specifikke målretning af Dnmt1, Dnmt3a og Dnmt3b DNA methyltransferase gener, og rapporterede de (forventede) udtømning af 5mC mærker i deres nethinder7 .
Den kritiske trin i 5mC immunhistokemisk påvisning er optimering af behandlingen af histologiske sektioner med HCl: mindre end 15 min forbehandling ikke forventes at producere reproducerbare resultater, mens overdreven behandling med HCl ødelægger den nukleare arkitektur. Vi fandt bedst resultat efter 30 min inkubation med HCl. Vi anbefaler altid at bruge frisk fortyndet HCl og frisklavet 4% PFA løsning for DNA denaturering og retinal væv fiksering.
Du kan foretage fejlfinding af resultater, anbefaler vi for at omfatte tre biologiske replikater mens optimering 5mC signal. Mens hver enkelt sæt kan immunhistokemisk farvning generere lidt forskellige resultater (mere eller mindre lyse heterochromatic regioner), som forventes i immunhistokemisk metode, 5mC og 5hmC nukleare fordeling inden for de enkelte sæt sektioner er forventes at være meget reproducerbar, for så længe protokollen er fulgt.
Denne teknik har også begrænsning som vi konsekvent observeret variation i 5mC distribution i fotoreceptor cellekerner inden for samme afsnit. Vi fandt nogle kerner viste stærk 5mC signal, mens tilstødende cellekerner viste ingen 5mC signal. Dette er på grund af begrænsninger i demaskering 5mC antigen af HCl behandling i frosne sektioner.
Betydningen af denne teknik gør det muligt for 5mC lokalisering uden DNase og proteinase K behandling fører til bedre bevarelse af chromocenters. Denne teknik er forventes at arbejde effektivt på alle sektioner fra alle hvirveldyr dyrevæv, transporterer 5mC, 5hmC mærker og behandles med en lignende tilgang, ikke kun mus nethinden, for så længe protokollen er fulgt.

Epigenetiske regulering af udvikling og postmitotic homeostase af musen nethinden er et spændende område for forskning, som lover at bringe en roman forståelse af biologiske mekanismer styrer retinogenesis og celle skæbne bestemmelse, celle type-specifikke metabolisk funktion samt celle patologier, celledød og regenerering1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. kromatin gennemgår dynamiske ændringer i udvikling, samt i svar på variable eksterne signaler om det er stress, metabolisk eller celle død stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. i mus kerner, kromatin er opdelt i aktive euchromatin og inaktive heterochromatin6,19,20. Interphase kerne, euchromatin er bosat i regionen indre af kernen boer heterochromatin linjer nukleare periferien og nucleolus. Dette mønster kaldes konventionelle og er meget bevaret i eukaryoter. Derimod har stang kerner i nataktive dyr som mus og rotter omvendt mønster hvor kernen er besat af heterochromatin i centrum omringet af euchromatin danner de yderste shell6,18, 20. Ved fødslen har stang cellekerner konventionelle nukleare arkitektur. Inversion af stang cellekerner opstår under udvikling af ombygning af konventionelle nukleare arkitektur. Under denne proces, perifere heterochromatin adskiller fra nukleare periferien og chromocenters smelter sammen til at danne en enkelt chromocenter i byens kerne6,18.
Genomisk DNA methylering deltager i at kontrollere lokale kromatin kropsbygning21. DNA methylering opstår ved 5' position cytosin rester af CpG dinucleotides, der er beriget i regionen promotor af mange gener i mus genomer22,23,24,25,26 samt i intergenic og intron regioner, som bærer regulerende elementer27. Methylering af CpG øer i proksimale initiativtagere21,24 og CpG sekvenser i gen smagsforstærkere27,28 er vigtig for reguleringen af den dynamiske tilstand af bivalent kromatin, som indeholder mange udviklingsmæssige gener/transskription faktorer spiller vigtig rolle i udviklingen, kræft og aldring29,30,31,32,33,34 . Tre DNA methyltransferases (DNMTs) deltage i DNA methylering under musen udvikling35. Alle tre DNMTs udtrykkes under musen retinal udvikling36 og nethinden-specifikke ændringer i Dnmt gener indvirkning retinal udvikling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) er den oxidative produkt af 5-methylcytosine (5mC) demetylering. Tre ti-elleve translokation (TET) enzymer deltage i 5mC demetylering37,38,39. Hydroxymethyl-C ændring er beriget med projektledere, gen organer og intergenic genomiske sekvenser i rig-gen og aktivt transskriberede regioner27,40.
Der er en bred vifte af beskrevne metoder til bestemmelse af skiftende DNA methylering mønstre i celler41,42,43,44,45,46, nogle af dem gør det muligt kvantificere globale ændringer af DNA methylering mens andre fokuserer på nøjagtige ændringer i CpG-rige regioner inden for initiativtagerne og smagsforstærkere. Metoder til påvisning og kvantificering af 5hmC blev også rapporteret47, herunder af Immunhistokemi13. Immunhistokemiske teknikker, hvorved robust overvågning af 5mC og 5hmC ændringer i kerner for at udvikle og postmitotic celler, er meget informativt for skildrer kromatin dynamics i situ som svar på eksterne eller interne ændringer påvirker cellerne4,13,48,49. Denne tilgang er dog tilbøjelig til at undervurdere DNA methylering og hydroxymethylation ændringer på grund af tekniske vanskeligheder forbundet med påvisning af cytosin ændringer i histologiske præparater. Dette er fordi det upolære DNA baser, herunder 5mC og 5hmC-ændret cytosin, er skjult i midten af dobbelt-strenget DNA helix50, og kræver demaskering. Dette er særligt udfordrende i frosne histologiske præparater, som kan hurtigt miste oplysende organisation af den oprindelige væv når hårde behandling anvendes.
Musen nethinden er en fremragende model for dissekere bidrag af DNA methylering neurale udvikling og postmitotic homeostase. Der er kun 6 typer for neuroner (stang og kegle fotoreceptorer, amacrine, bipolar, vandret og ganglion celler), én glial celletype (Muller glia) og en neuroepithelial celle type (retinale pigment epitel)51. Retinal celletyper blev rapporteret at have forskellige mønstre af DNA methylering18,19, som for nylig er blevet undersøgt på enkelt-base opløsning1,5,9,12. Vi har for nylig rapporteret Immunhistokemi ansøgning at afgrænse 5mC mønster af distribution inden for kerner af retinale celler og ændringer i kerner af voksen mus nethinden, hvor alle tre DNA methyltransferases er blevet fjernet af betingede målretning 7. i forhold til en række rapporter, hvor tilstedeværelsen af DNA methylering i retinale celler kunne betragtes kun som en positiv eller negativ signal i hypermethylated celler undergår apoptose, vores tilgang aktiveret afsløre specifikke kromatin ordning inden for de retinale cellekerner, som vi og flere grupper rapporterede og drøftet tidligere5,6,7,18,19,36 , 52. her, vi beskriver immunhistokemiske (IHC) teknik til påvisning af 5mC og 5hmC i frosne PARAFORMALDEHYD-fast histologiske snit i detaljer samt vise de data, som vi var i stand til at reproducere fra vores oprindelige betænkning7 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29G1/2 ULTRA-FINE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissor</td>
			<td>Fine Science tools, Inc.&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>RPICORP.com</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide Superfrost plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N HCl</td>
			<td>VWR analytical&#160;</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mC</td>
			<td>Genway Biotech&#160;</td>
			<td>GWB-BD5190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5hmC</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaminB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab16048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-225-1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-585-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRM HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>388114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

Epigenetik af retinal udvikling er en velundersøgte forskningsområde, som lover at bringe et nyt niveau af forståelse om mekanismerne af en lang række menneskelige retinal degenerative sygdomme og lokalisere nye behandlingsmetoder. Den nukleare arkitektur af musen nethinden er organiseret i to forskellige mønstre: konventionelle og omvendt. Konventionelle mønster er universel hvor heterochromatin er lokaliseret til periferien af kernen, mens active euchromatin er bosat i den nukleare interiør. Derimod er omvendt nukleare mønster unik for voksen stang fotoreceptor cellekerner, hvor heterochromatin lokaliserer til den nukleare center, og euchromatin er placeret i den nukleare periferien. DNA methylering er overvejende observeret i chromocenters. DNA methylering er en dynamisk kovalente ændring på cytosin restkoncentrationer (5-methylcytosine, 5mC) af CpG dinucleotides, der er beriget med regionerne promotor af mange gener. Tre DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A og DNMT3B) deltage i methylering af DNA under udvikling. Afsløre 5mC med immunhistokemiske teknikker er meget udfordrende, bidrage til variation i resultaterne, som alle DNA-baser herunder 5mC modificeret baser er skjult i dobbelt-strenget DNA helix. Detaljeret afgrænsning af 5mC fordeling under udvikling er imidlertid meget informativ. Her, vi beskriver en reproducerbar teknik til robust immunhistokemisk påvisning af 5mC og en anden epigenetiske DNA markør 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), som colocalizes med den "åbne", transcriptionally aktive kromatin i udviklingen og postmitotic musen nethinden.

At fastlægge fordelingen af 5-methylcytosine (5mC) og 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) under retinal udvikling og i postmitotic nethinden, vi immunostained C57BL/6J mus retinal afsnit fra E16, P0, P15 og P90 med antistoffer specifikke for 5mC og 5hmC.
Ved E16 var 5mC farvning stærk i chromocenters af cellekerner mens svage pletter blev observeret i de hele cellekerner (figur 1a). 5hmC farvning var begrænset til cellekerner og var fraværende fra chromocenters (figur 1b).
I P0 nethinden, var 5mC signal lokaliseret til chromocenters af cellekerner og nukleare periferien (figur 2a, pil og pilespids). Vi har også observeret svag farvning af 5mC mellem chromocenters af cellekerner. 5hmC signal var stærkt tilstede i cellekerner med undtagelse af chromocenters (figur 2b). Vi fandt flere kerner farves med 5mC og 5hmC i indre neuroblast lag (INBL) (figur 2 c, stiplede linje)
I P15 nethinden fandt vi stærk farvning af 5mC og 5hmC i ydre nukleare lag (ger), inderste nukleare lag (INL) og ganglion cellelag (GCL) (figur 3). I ger. (stang fotoreceptorer) var 5mC signalet til stede i chromocenters af cellekerner og nukleare periferien (tal 3a-3 c, 3 g). 5hmC signal blev fundet i de hele cellekerner med undtagelse af chromocenters (tal 3d-3f). Transmissions elektronmikroskopi gjort på P15 nethinden viser fordelingen af heterochromatic domæner i stang cellekerner svarer til fundet med 5mC antistof signal (figur 3 h og 3i).
5mC farvning i INL og GCL var stærk i chromocenters af cellekerner og svage pletter blev også observeret i hele cellekerner (tal 3j-3 l og 3r-3t). I modsætning til 5mC, blev 5hmC signalet lokaliseret til de hele cellekerner undtagen chromocenters INL og GCL (tal 3 m-3o og 3u-3w). Vi observerede stærk 5hmC signal i periferien af GCL cellekerner.
I voksen stang fotoreceptorer var 5mC signal begrænset til chromocenter og nukleare periferien af cellekerner (tal 4a-4 c), mens 5hmc signal var begrænset til den nukleare periferien (tal 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figur 1. Lokalisering af 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine i mus nethinden på embryonale dag 16. Immunfarvning af C57BL/6J nethinden med antistoffer mod 5mC (rød, en) og 5hmC (grønne, b). På E16 er 5mC signal meget stærk i chromocenters af cellekerner og også til stede i de hele cellekerner på meget lavere niveau. 5hmC farvning var udelukkende begrænset til cellekerner. Panelet c repræsenterer fusionerede 5mC og 5hmC billede. Kerner er counterstained med DAPI (blå, c). Mellemværker repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billederne. Skalalinjen: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Figur 2. Immunhistokemisk farvning af 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine i mus nethinden på postnatal dag 0. Immunolabeling af C57BL/6J nethinden med antistoffer mod 5mC (rød, en) og 5hmC (grønne, b). I P0 nethinden er 5mC og 5hmC til stede i både ydre neuroblast lag (ONBL) og indre neuroblast lag (INBL). en) 5mC signal er kraftigt til stede i chromocenters (pil) og nukleare periferien af cellekerner (pilespids). Svage farvning af 5mC er også observeret i mellem chromocenters af cellekerner. b) 5hmC farvning er begrænset til cellekernen og stærkt signal er observeret i INBL (stiplede linje i panelet c). Panelet c repræsenterer fusionerede 5mC og 5hmC billede. Kerner er counterstained med DAPI (blå, c). Mellemværker repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billederne. Skalalinjen: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Figur 3. 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine distribution i mus nethinden på postnatal dag 15. Immunfarvning af C57BL/6J nethinden med anti-5mC og 5hmC antistoffer (a-g, j-y). I ydre nukleare lag (ger) (stang fotoreceptorer), 5mC signal (rød, en) normalt falder sammen med chromocenters af cellekerner (pilespids, b) og også lokaliserer til nukleare periferien (pil, b). Panelet b (rød) og c (grå) repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billedet en. 5hmC signal (grønne, d) er begrænset til de hele cellekerner bortset fra chromocenters. Panelet e (grøn) og f (grå) repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billedet d. Panel g repræsenterer fusionerede 5mC og 5hmC billede. Kerner er counterstained med DAPI. Panelet h og jeg er transmissions-elektronmikroskop billede af fotoreceptor kerner på postnatal dag 15 viser fordelingen af heterochromatic domæner. Sort pilespids i panelet Hansen peger på enkelt stang fotoreceptor atomkernen forstørret i panelet i. røde pilehoveder i panelet jeg pege heterochromatic domæner inden for stang fotoreceptor kerne, mens røde pile peger heterochromatin i den nukleare periferien. INL (j-q) og GCL cellekerner (r-y), det 5mC signal (rød) er lokaliseret til chromocenters i periferien og svage pletter er også fundet i resten af cellekerner. Panelet k (røde) og jeg (grå) repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billedet Jørgensen. 5hmC farvning (grøn) i INL og GCL cellekerner er begrænset til hele cellekernen. Bemærk stærke 5hmC farvning i nukleare periferien af GCL celler. Panelet Pedersen og x repræsenterer fusionerede 5mC og 5hmC billede mens panel q og y repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billede p og x henholdsvis. Kerner er counterstained med DAPI. Skalalinjen: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Figur 4. 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine distribution i stang fotoreceptor kerner af C57BL/6J mus nethinden på postnatal dag 90. 5mC farvning (rød, en) er kraftigt til stede i chromocenter af cellekerner og også svagt nutid i den nukleare periferien. Panelet b (rød) og c (grå) repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billedet en. 5hmC farvning (grønne, d) er udelukkende begrænset til nukleare periferien Panel e (grøn) og f (grå) repræsenterer forstørrelse af område vises med stjerne i billedet d. Panel g repræsenterer fusionerede 5mC og 5hmC billede mens panel h er forstørrelse af område vises med Asterisk i billedet g. kerner er counterstained med DAPI (blå). Skalalinjen: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunhistokemisk påvisning af 5-Methylcytosine og 5-Hydroxymethylcytosine i at udvikle og Postmitotic mus nethinden

Formålet med denne rapport er at beskrive protokollen for robust immunhistokemisk påvisning af epigenetiske markører, 5-methylcytosine (5mC) og 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) i at udvikle og postmitotic musen nethinden.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Konfokal Imaging af Udvikling Arabidopsis Blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion og koronale skive forberedelse for at udvikle mus hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Udarbejdelsen af perifere olfaktoriske væv for at udvikle molekylære og immunhistokemisk analyse i Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering af ultrastrukturelle neuroplasticitet parametre efter i Utero transduktion af udvikle mus hjernen og rygmarven

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...