Name: immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en SBIR grant (1R44EY027654-01A1).

Alle prosedyrer med mus ble utført i henhold til protokoller godkjent av Children's Hospital Oakland Research Institute dyr omsorg og bruk komité og overholdt foreningen for i visjon og Oftalmologi (ARVO) uttalelse for bruk dyr i ophthalmica og visjon forskning.
1. vev forberedelse til immunostai-
<ol><li>Euthanize C57 BL/6J mus på embryonale dagen (E) 16, postnatal dag (P) 0, P15 og P90 av karbondioksid (CO2) etterfulgt av halshogging (E16 og P0 mus).</li>
	<li>Umiddelbart enucleate musen øyne punktert med 29G 1/2 p på dorsal side av øyet. Inkuber i 5 minutter (min) i 1 mL av 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat-bufret saltvann (1 x PBS) pH 8.0 ved romtemperatur.</li>
	<li>For å gjøre øye kopper fra P0, P15 og P90, dissekere ut hornhinnen og objektiv med fine ophthalmica saks mens øyne er på 4% PFA. Merk: Hopp over dette trinnet for E16 øyne som øynene er for liten.</li>
	<li>Fikse øye koppene (P0, P15 og P90) og hele øynene (E16) i 4% PFA for 20 min ved romtemperatur. Deretter vaskes øye kopper og hele øyne to ganger i 1 mL 1 x PBS i 10 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Cryoprotect kopper og hele øyne i 1xPBS, pH 8.0 inneholder 10% sukrose i 1 time. Holde 20% sukrose i 1 x PBS i 1 time og deretter mette i 30% sukrose i 1 x PBS overnatting på 4 ° C.</li>
	<li>Neste dag, legge ned øye koppene og hele øynene i optimal kutte temperatur sammensatte (oktober), (500 µL) i cryomolds snapin-fryse i tørris/etanol badekar og lagre på-80 ° C.</li>
	<li>Fjerne formene med innebygd øye kopper og hele øyne fra-80 ° C og la equilibrate til 20 ° C i 1 time før og kryosnitt.</li>
	<li>Kutte retinal tverrsnitt (12 µm tykk) parallell temporonasal aksen gjennom synsnerven hodet med en kryostaten på 20 ° C.</li>
	<li>Montere retinal deler på mikroskopet lysbilder53 og butikk på-80 ° C.</li>
</ol>2. Immunostaining med 5-mC og 5-hmC antistoffer
<ol><li>Omslutter delene retinal montert på lysbilder med en hydrofobe barriere. Hydrofobe barriere pennen reduserer volumet av antistoff kreves stain vevet.</li>
	<li>Vask retinal delene gang med 200 µL av 1 x PBS i 10 min.</li>
	<li>Permeabilize retinal avsnittene med 200 µL på 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS (PBS-T) i 10 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Denature retinal seksjoner for 30 min med 200 µL av ferske 2 N (HCl) saltsyre i 1 x PBS i en 37 ° C inkubator. Merk: Forsiktig titrering HCl behandling er nødvendig for å optimalisere 5mC signalet.</li>
	<li>Alltid inkludere biologiske replikat (3-4) mens optimalisere 5mC signal54. Merk: Vi gjorde antigen henting på 4 tidspunkt (15 min, 30 min, 1 h og 2t) og funnet 30 min incubation er optimal for 5mC signal. Lengre inkubasjon med HCl forringer strukturen i kjerner fører til manglende evne til å lokalisere 5mC signal til kjernen.</li>
	<li>Etter rødsprit, nøytralisere retinal inndelinger ved å legge til 100 µL av 0.1 M Tris-HCl (pH 8.3) på netthinnen seksjoner for 10 min.</li>
	<li>Inkuber avsnittene i 500 µL av blokkering løsning (5% preimmune normal geit serum på 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) 1t ved romtemperatur i en fuktighet kammer.</li>
	<li>Etter blokkering, legger du til anti-5mC; anti-5hmC antistoffer utvannet 1:500 i blokkering løsning retinal delene.</li>
	<li>Inkuber retinal deler overnatting på 4 ° C i luftfuktighet kammer.</li>
	<li>Neste dag vask, netthinnen deler 3 ganger (10-15 minutter hver gang) med 0,1% PBS-T og deretter Inkuber i blokkering løsning med tilsvarende sekundære antistoffer (geit anti-kanin og geit anti-musen IgG, utvannet; 1:1000), som inneholder DAPI (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) løsning (1 µg/mL) ved romtemperatur 1t i blokkering løsning. Merk: Unngå tørking av inndelingene under alle faser av immunodetection.</li>
	<li>Vask lysbildene tre tid med 1 mL av 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Etter siste vask, montere delene med vandig montering medium under en dekkglassvæske og forsegle med fargeløs neglelakk.</li>
</ol>3. AC confocal Immunohistochemistry
<ol><li>Plasser delene har siden netthinnens pigment epitel i optikk Cup alltid møter en måte (f.eks opp) for konsistens.</li>
	<li>Utfører image fange immunostained retinal deler på 63 X (forstørrelse av et linsen) med 2 X eller 3 X zoom.</li>
	<li>Generere flere optiske deler av hvert valgte bilde (z-stabler) i alle 3 kanaler (rød, grønn og blå, RGB) bruker 0,35 µm-trinn. Merk: Siste forstørrelsen av en visualisert på 10-20 X (forstørrelse av et linsen) vil være 63 X, henholdsvis, kombinert med en (vanligvis brukt) 10 X okulær linsen. Visualisere komprimert optisk stabelen for å finne 5mC og 5hmC signalet</li>
</ol>

Forfatterne ikke avsløre.

DNA metylering og hydroxymethylation er dynamisk og reversibel DNA modifikasjoner, der modulatethe variert spekter av biologiske mekanismer i en utvikling så vel som i postmitotic celler. Her beskriver vi en reproduserbar teknikk for å oppdage 5mC og 5hmC DNA endringer i situ av immunohistochemical teknikk (med anti-5mC og anti-5hmC antistoffer) i paraformaldehyde-fast frosne deler av musen netthinnen, og gir retningslinjer for forbedring og standardisering resultatene, særlig når sammenlignende flere forskjellige eksemplarer. Vi tidligere brukte denne metoden til å avgrense 5mC endringer i musen netthinnen med retina-spesifikke målretting av Dnmt1, Dnmt3a og Dnmt3b DNA methyltransferase gener, og rapporterte (forventede) uttømming av 5mC merker i deres Netthinne7 .
Det kritiske trinnet i 5mC immunohistochemical gjenkjenning er optimalisering av behandling av histologiske seksjoner med HCl: mindre enn 15 min forbehandling ikke forventes å produsere reproduserbar resultater, mens overdreven behandling med HCl ødelegger kjernefysiske arkitektur. Vi fant resultatet etter 30 min incubation med HCl. Vi anbefaler å alltid bruke fersk utvannet HCl og nystekte 4% PFA løsning for DNA rødsprit og retinal vev fiksering.
Feilsøk resultatene, anbefaler vi for å ta tre til fire biologiske gjentak mens optimalisere 5mC signal. Mens hver enkelt sett med kan immunohistochemical flekker generere litt forskjellige resultater (mer eller mindre lys heterochromatic områder), som forventes i immunohistochemical metoden, 5mC og 5hmC kjernefysiske distribusjon i enkelte settet deler forventes å være svært reproduserbare, for så lenge protokollen etterfølges.
Denne teknikken har også begrensning som observerte vi konsekvent variasjon i 5mC distribusjon i photoreceptor celle kjerner i samme inndeling. Vi fant noen kjerner viste sterke 5mC signalet mens nabocelle kjerner viste ingen 5mC signal. Dette skyldes begrensninger i avsløre 5mC antigen av HCl behandling i frosne snitt.
Betydningen av denne teknikken kan 5mC lokalisering uten DNase og proteinasen K behandling fører til bedre bevaring av chromocenters. Denne teknikken er forventet å arbeide robust på noen deler av virveldyr dyr vev, bærer 5mC, 5hmC merker, og behandlet med en lignende tilnærming, ikke bare mus netthinnen, for så lenge protokollen etterfølges.

Epigenetic regulering av utvikling og postmitotic homeostase av musen netthinnen er et spennende område av forskning, som lover å bringe en ny forståelse av biologiske mekanismer som styrer retinogenesis og celle skjebne besluttsomhet, celle type-spesifikk Metabolsk funksjon som cellen patologi, celledød og gjenfødelse1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. chromatin gjennomgår dynamiske endringer i utvikling, samt svar på variabel eksterne signaler stress, metabolske eller celle død stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. i musen kjerner, chromatin er delt inn i aktive euchromatin og inaktive heterochromatin6,19,20. Interphase kjernen ligger euchromatin i området indre kjernen mens heterochromatin linjer kjernefysiske periferi og kjerne. Dette mønsteret kalles konvensjonelle og er svært bevart i eukaryoter. I kontrast, har rod atomkjerner i nattaktive dyr som mus og rotten invertert mønster der kjernen er okkupert av heterochromatin i midten omringet av euchromatin danner den ytterste shell6,18, 20. Ved fødselen har rod kjerner konvensjonelle kjernefysiske arkitektur. Inversjon av rod kjerner oppstår under utviklingen av ombygging av konvensjonelle kjernefysiske arkitektur. Under denne prosessen eksterne heterochromatin skiller fra kjernefysiske periferien og chromocenters smelter sammen for å danne en enkelt chromocenter i sentrum av kjernen6,18.
Genomic DNA metylering deltar i kontrollerende lokale chromatin konformasjon21. DNA metylering oppstår ved 5' cytosine rester av CpG dinucleotides som er beriket i regionen arrangøren av mange gener i musen genomer22,23,24,25,26 så vel som i intergenisk og intron regioner, som bærer regulatoriske elementer27. Metylering av CpG øyer i proksimale arrangører21,24 og CpG sekvenser i genet enhancers27,28 er viktige i å regulere dynamisk staten bivalent chromatin, som inneholder mange utviklingsmessige gener/transkripsjonsfaktorer spille viktig rolle i utviklingen, kreft og aldring29,30,31,32,33,34 . Tre DNA methyltransferases (DNMTs) delta i DNA metylering under musen utvikling35. Alle tre DNMTs uttrykkes i musen retinal utvikling36 og retina-spesifikke endringer i Dnmt gener innvirkning retinal utvikling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) er oksidativt produktet av 5-methylcytosine (5mC) demethylation. Tre ti-elleve translokasjon (TET) enzymer delta i 5mC demethylation37,38,39. Hydroxymethyl-C endring er beriket i arrangører, gene organer og intergenisk genomisk sekvenser fra gene rik og aktivt transkribert regioner27,40.
Det er et utvalg av beskrevet tilnærminger for å bestemme skiftende DNA metylering mønstre i celler41,42,43,44,45,46, hvorav aktivering kvantifisere globale endringer av DNA metylering mens andre fokuserer på nøyaktig endringer i CpG-rike regioner i arrangørene og enhancers. Metoder for å oppdage og kvantifisering av 5hmC ble også rapportert47, inkludert immunohistochemistry13. Immunohistochemical teknikker, som aktiverer robuste overvåking av 5mC og 5hmC endringer i kjerner for å utvikle og postmitotic celler, er veldig informativ for skildre chromatin dynamics i situ svar på eksterne eller interne endringer påvirker celler4,13,48,49. Men er denne tilnærmingen liggende å undervurdere DNA metylering og hydroxymethylation endringer på grunn av tekniske problemer, tilknyttet oppdage cytosine endringer i histologiske forberedelser. Dette er fordi upolart DNA baser, inkludert 5mC og 5hmC endret cytosine, er skjult i midten av double-strandet DNA helix50, og krever avsløre. Dette er spesielt utfordrende i frosne histologiske preparater, som kan raskt miste informativ organiseringen av den opprinnelige vev når hard behandling brukes.
Musen netthinnen er en utmerket modell å dissekere bidrag av DNA metylering neural utvikling og postmitotic homeostase. Det er bare 6 typer nerveceller (stang og membran fotoreseptorer, amacrine, bipolar, horisontale og ganglion celler), en glial celle type (Muller glia) og en neuroepithelial celle type (netthinnens pigment epitel)51. Netthinnen celletyper ble rapportert å ha ulike mønstre for DNA metylering18,19, som nylig har blitt studert single-base oppløsning1,5,9,12. Vi har nylig rapportert immunohistochemistry søknad å skildre 5mC mønsteret for distribusjon i kjerner av netthinnen celler og endringer i kjerner i voksen mus netthinnen, hvor alle tre DNA methyltransferases er fjernet av betinget målretting 7. i forhold til en rekke rapporter, der tilstedeværelse av DNA metylering i netthinnen celler kan ses kun som et positivt eller negativt signal i hypermethylated cellene gjennomgår apoptose, vår tilnærming aktivert oppdage bestemte chromatin ordningen i netthinnen celle kjerner, som vi flere grupper rapportert og diskutert tidligere5,,6,,7,,18,,19,,36 , 52. her beskriver vi immunohistochemical (IHC) teknikken av registrere 5mC og 5hmC i frosne paraformaldehyde-fast histologiske delene i detaljene samt vise dataene, som vi var i stand til å reprodusere fra vår opprinnelige rapporten7 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29G1/2 ULTRA-FINE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissor</td>
			<td>Fine Science tools, Inc.&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>RPICORP.com</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide Superfrost plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N HCl</td>
			<td>VWR analytical&#160;</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mC</td>
			<td>Genway Biotech&#160;</td>
			<td>GWB-BD5190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5hmC</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaminB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab16048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-225-1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-585-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRM HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>388114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

Epigenetics retinal utvikling er en godt studert forskningsfelt, som lover å bringe et nytt nivå av forståelse om mekanismer av en rekke menneskelige netthinnens degenerative sykdommer og finne nye behandlingsmetoder. Musen netthinnen kjernefysiske arkitektur er ordnet i to ulike mønstre: konvensjonelle og omvendt. Konvensjonelle mønster er universell der heterochromatin er lokalisert til utkanten av kjernen, mens aktive euchromatin ligger i kjernefysiske interiøret. Derimot er invertert kjernefysiske mønsteret unik for voksen rod photoreceptor celle kjerner hvor heterochromatin regionaliserer til kjernefysiske senter, og euchromatin befinner seg i kjernefysiske periferien. DNA metylering er overveiende observert i chromocenters. DNA metylering er en dynamisk kovalente modifikasjon på cytosine rester (5-methylcytosine, 5mC) av CpG dinucleotides som er beriket i regionene arrangøren av mange gener. Tre DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A og DNMT3B) delta i metylering DNA under utvikling. Oppdage 5mC med immunohistochemical teknikker er svært utfordrende, bidra til variasjon i resultatene, som alle DNA baser inkludert 5mC endret baser er skjult i double-strandet DNA-helix. Imidlertid er detaljert avgrensning av 5mC distribusjon under utviklingen veldig informativ. Her beskriver vi en reproduserbar teknikk for robust immunohistochemical påvisning av 5mC og en annen epigenetic DNA markør 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), som colocalizes med den "åpne", transcriptionally aktive chromatin i utviklingen og postmitotic musen netthinnen.

Å fastslå fordelingen av 5-methylcytosine (5mC) og 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) under retinal utvikling og i postmitotic netthinnen, vi immunostained C57BL/6J musen retinal delen fra E16, P0, P15 og P90 med antistoffer spesifikke 5mC og 5hmC.
Ved E16 var den 5mC flekker sterk i chromocenters av cellen kjerner mens svake flekker ble observert i hele cellen kjerner (figur 1a). Den 5hmC flekker var begrenset til celle kjerner og var borte fra chromocenters (figur 1b).
I P0 netthinnen, var 5mC signalet lokalisert til chromocenters av cellen kjerner og kjernefysiske periferi (figur 2a, pil og pilspiss). Vi har også observert svake flekker av 5mC mellom chromocenters av cellen kjerner. 5hmC signalet var sterkt i cellen kjerner unntatt chromocenters (figur 2b). Vi fant flere kjerner er farget med 5mC og 5hmC i indre neuroblast lag (INBL) (figur 2 c, prikket linje)
I P15 netthinnen fant vi sterke flekker av 5mC og 5hmC i ytre kjernefysiske lag (bare), indre kjernefysiske laget (INL) og ganglion celle lag (GCL) (Figur 3). I bare (rod fotoreseptorer) var 5mC signalet i chromocenters av cellen kjerner og kjernefysiske periferi (tall 3a-3 c, 3 g). 5hmC signalet ble funnet i hele cellen kjerner unntatt chromocenters (tall 3d-3f). Overføring elektronmikroskop gjort på P15 netthinnen viser fordelingen av heterochromatic domener i stang celle kjerner lignende som med 5mC antistoffer signal (tall 3 h og 3i).
Den 5mC flekker i INL og GCL var sterk chromocenters av cellen kjerner og svake flekker ble også observert i hele cellen kjerner (tall 3j-3 l og 3r-3t). I motsetning til 5mC, var 5hmC signalet lokalisert til hele cellen kjerner unntatt chromocenters INL og GCL (tall 3 m-3o og 3u-3w). Vi observerte sterk 5hmC signal i utkanten av GCL celle kjerner.
I voksen rod fotoreseptorer var 5mC signalet begrenset til chromocenter og kjernefysiske periferien av cellen kjerner (tall 4a-4 c) mens 5hmc signalet var begrenset til kjernefysiske periferien (tall 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figur 1. Lokalisering av 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine i musen netthinnen på embryonale dag 16. Immunostaining av C57BL/6J netthinnen med antistoffer mot 5mC (rød a) og 5hmC (grønn, b). Ved E16 er 5mC signalet veldig sterkt i chromocenters av cellen kjerner og også finnes i hele cellen kjerner på mye lavere. 5hmC flekker var utelukkende begrenset til celle kjerner. Panelet c representerer flettede 5mC og 5hmC bilde. Kjerner er counterstained med DAPI (blå, c). Insets representerer forstørrelsen av området som vises med stjerne i bildene. Skala bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Figur 2. Immunohistochemical farging av 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine i musen netthinnen på postnatal dag 0. Immunolabeling av C57BL/6J netthinnen med antistoffer mot 5mC (rød a) og 5hmC (grønn, b). I P0 netthinnen finnes 5mC og 5hmC i både ytre neuroblast lag (ONBL) og indre neuroblast lag (INBL). a) 5mC er sterkt til stede i chromocenters (pil) og kjernefysiske periferien av cellen kjerner (pilspiss). Svake flekker av 5mC er også observert i mellom chromocenters av cellen kjerner. b) 5hmC flekker er begrenset til cellekjernen og sterkt signal er observert i INBL (stiplet linje i panelet c). Panelet c representerer flettede 5mC og 5hmC bilde. Kjerner er counterstained med DAPI (blå, c). Insets representerer forstørrelsen av området som vises med stjerne i bildene. Skala bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Figur 3. 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine distribusjon i musen netthinnen på postnatal dag 15. Immunostaining av C57BL/6J netthinnen med anti-5mC og 5hmC antistoffer (a-g, j-y). I ytre kjernefysiske lag (bare) (rod fotoreseptorer), 5mC signal (rødt, a) vanligvis faller sammen med chromocenters av cellen kjerner (pilspiss, b) og også regionaliserer til kjernefysiske periferien (pilen, b). Panelet b (rød) og c (grå) representerer forstørrelse av vises med stjernen i bildet en. 5hmC signalet (grønn, d) er begrenset til hele cellen kjerner bortsett fra chromocenters. Panelet e (grønn) og f (grå) representerer forstørrelsen av området som vises med stjerne i bildet d. panelet g representerer flettede 5mC og 5hmC bilde. Kjerner er counterstained med DAPI. Panelet h og jeg er overføring elektronmikroskop bildet av photoreceptor kjerner på postnatal dag 15 viser fordelingen av heterochromatic domener. Svart pilspissen i panelet h peker til enkelt rod photoreceptor kjernen forstørret i panelet i. røde pilspisser i panelet jeg peke på heterochromatic domener i rod photoreceptor kjernen mens røde piler peker til heterochromatin i kjernefysiske periferien. INL (j-q) og GCL celle kjerner (r-y), 5mC signalet (rød) er lokalisert til chromocenters i periferien og svake flekker er også oppdaget i resten av cellen kjerner. Panelet k (rød) og jeg (grå) representerer forstørrelsen av området som vises med stjerne i bildet j. Den 5hmC flekker (grønn) i INL og GCL celle kjerner er begrenset til hele cellekjernen. Merk sterk 5hmC farging i kjernefysiske utkanten av GCL celler. Panelet p og x representerer flettede 5mC og 5hmC bilde mens panelet q og y representerer forstørrelse av vises med stjernen i bildet p og x henholdsvis. Kjerner er counterstained med DAPI. Skala bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Figur 4. 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine distribusjon i rod photoreceptor kjerner C57BL/6J musen netthinnen på postnatal dag 90. Den 5mC flekker (rød, en) er sterkt i chromocenter i celle kjerner og også svakt stede i kjernefysiske periferien. Panelet b (rød) og c (grå) representerer forstørrelse av vises med stjernen i bildet en. Den 5hmC flekker (grønn, d) er utelukkende begrenset til kjernefysiske periferi panelet e (grønn) og f (grå) representerer forstørrelse av vises med stjerne i bildet d. panelet g representerer flettede 5mC og 5hmC bilde mens panelet h er forstørrelse av vises med stjerne i bildet g. kjerner er counterstained med DAPI (blå). Skala bar: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemical påvisning av 5-Methylcytosine og 5-Hydroxymethylcytosine i utviklingen og Postmitotic musen netthinnen

Målet med denne rapporten er å beskrive protokollen for robust immunohistochemical påvisning av epigenetic markører, 5-methylcytosine (5mC) og 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) i utviklingen og postmitotic musen netthinnen.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Confocal Imaging av Developing Arabidopsis blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Disseksjon og koronale del forberedelse for å utvikle musen hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Forbereder utvikle perifere Olfactory vev for molekylær og Immunohistochemical analyse i Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering av Ultrastructural Neuroplasticity parametere etter i Utero signaltransduksjon utvikle musen hjernen og ryggmarg

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...