Name: immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett SBIR bidrag (1R44EY027654-01A1).

Alla förfaranden med möss utfördes i enlighet med protokoll godkänts av barnens sjukhus Oakland forskningsinstitut djurens skötsel och användning kommittén och anslöt sig till förbundet för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmologiska och vision forskning.
1. vävnad förberedelse för immunfärgning
<ol><li>Euthanize C57 BL/6J möss på embryonala dag (E) 16, postnatal dag (P) 0, P15 och P90 av koldioxid (CO2) följt av halshuggning (E16 och P0 möss).</li>
	<li>Omedelbart enucleate mus ögon punkteras med 29G 1/2 nål på ryggsidan av ögat. Inkubera i 5 minuter (min) i 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbuffrad koksaltlösning (1 x PBS) pH 8,0 i rumstemperatur.</li>
	<li>För att göra ögat koppar från P0, P15 och P90, dissekera ut hornhinnan och linsen med fina oftalmologiska sax medan ögonen i 4% PFA. Obs: Hoppa över detta steg för E16 ögon som ögon är för små.</li>
	<li>Fixa ögat kopparna (P0, P15 och P90) och hela ögonen (E16) i 4% PFA i 20 min i rumstemperatur. Sedan tvätta ögat koppar och hela ögonen två gånger i 1 mL 1 x PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Cryoprotect ögat koppar och hela ögon i 1xPBS, pH 8,0 innehållande 10% sackaros i 1 timme. Hålla i 20% sackaros i 1 x PBS i 1 timme och sedan mätta i 30% sackaros i 1 x PBS över natten vid 4 ° C.</li>
	<li>Nästa dag, bädda in ögat kopparna och hela ögonen i optimal styckning temperatur förening (ULT), (500 µL) i cryomolds, snapin-frysa i badkar torris/etanol och lagra vid-80 ° C.</li>
	<li>Ta bort formarna med inbäddade ögat koppar och hela ögon från-80 ° C och temperera vid-20 ° C i 1 timme innan kryosnitt.</li>
	<li>Skär retinal tvärsnitt (12 µm tjock) parallellt med temporonasal axeln genom synnerven huvudet med en kryostat vid-20 ° C.</li>
	<li>Montera retinal sektioner på mikroskopet diabilder53 och förvaras vid-80 ° C.</li>
</ol>2. immunfärgning med antikroppar mot 5-mC och 5-hmC
<ol><li>Omringa avsnitten retinal monterad på bilder med en hydrofoba barriär penna. Hydrofoba barriär pennan minskar mängden antikroppar krävs att färga vävnaden.</li>
	<li>Tvätta i näthinnans avsnitt en gång med 200 µL 1 x PBS i 10 min.</li>
	<li>Permeabilize avsnitten retinal med 200 µL 0,1% Triton x-100 i 1 x PBS (PBS-T) under 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Denature retinal sektioner för 30 min med 200 µL nygjorda 2 N saltsyra (HCl) syra i 1 x PBS i en 37 ° C inkubator. Obs: Noggrann titrering av HCl behandling behövs för att optimera signalen 5mC.</li>
	<li>Inkludera alltid biologiska replikat (3-4) samtidigt som den optimerar 5mC signal54. Obs: Vi gjorde antigen retrieval 4 tidpunkter (15 min, 30 min, 1 och 2 h) och hittade 30 min inkubering är optimalt för 5mC signal. Längre inkubation med HCl försämrar strukturen av atomkärnor leder till oförmåga att lokalisera 5mC signal till kärnan.</li>
	<li>Efter denaturering, neutralisera retinal avsnitt genom att lägga till 100 µL 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3) på retinal sektioner i 10 min.</li>
	<li>Inkubera i avsnitt i 500 µL av blockerande lösning (5% preimmune normala get serum i 0,1% Triton x-100 i 1 x PBS) för 1 h i rumstemperatur i en fuktkammare.</li>
	<li>Efter blockering, lägga till anti-5mC; anti-5hmC antikroppar utspädd 1: 500 blockera lösning till avsnitten retinal.</li>
	<li>Inkubera retinal sektioner över natten vid 4 ° C i fuktkammare.</li>
	<li>Nästa dag tvätten, retinal avsnitten 3 gånger (10-15 min varje gång) med 0,1% PBS-T och sedan Inkubera i blockering lösning med motsvarande sekundära antikroppar (get anti-kanin och get antimus IgG, utspädd; 1: 1000), som innehåller DAPI (4', 6 - diamidin-2-fenylindol) lösning (1 µg/mL) vid rumstemperatur för 1 h i blockering lösning. Obs: Undvik torkning av sektioner under alla stadier av immunodetection.</li>
	<li>Tvätta bilderna tre tiden med 1 mL 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Efter den sista tvättningen, montera avsnitten med aqueous monteringsmedium under ett täckglas och försegla med färglös nagellack.</li>
</ol>3. confocal immunohistokemi
<ol><li>Orient avsnitten om du vill ha den retinal pigment epitel sidan av optic koppen alltid inför ett sätt (t.ex. upp), för konsekvens.</li>
	<li>Utföra bildfångst immunostained retinal avsnitt 63 X (förstoring av en objektiv) med 2 X eller 3 X zoom.</li>
	<li>Generera flera optiska delar av varje vald bild (z-stackar) i alla 3 kanaler (rött, grönt och blått, RGB) med 0,35 µm steg. Obs: Slutliga förstoringen av provexemplar visualiseras på 10-20 X (förstoring av en objektiv) kommer att vara 63 X, respektive, i kombination med en (vanligtvis begagnad) 10 X okularlinsen. Visualisera komprimerade optiska stack för att leta upp 5mC och 5hmC signalen</li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

DNA-metylering och hydroxymethylation är dynamisk och reversibel DNA ändringar, som modulatethe olika sorters biologiska mekanismer i en utveckla såväl som i postmitotic celler. Här, vi beskriver en reproducerbar teknik för att upptäcka 5mC och 5hmC DNA ändringar i situ genom immunhistokemisk teknik (med anti-5mC och anti-5hmC antikroppar) i PARAFORMALDEHYD-fasta frusna snitt av mus näthinnan, och ge riktlinjer för att förbättra och standardisera resultaten, särskilt när man jämför flera olika exemplar. Vi tidigare använt denna metod för att avgränsa 5mC förändringar i mus näthinnan med retina-specifika inriktning av Dnmt1, Dnmt3a och Dnmt3b DNA methyltransferase gener, och rapporterade (förväntade) utarmning av 5mC märken i deras näthinnor7 .
Det kritiska steget i 5mC immunhistokemisk detektion är optimering av behandling av histologiska sektioner med HCl: mindre än 15 min förbehandling inte förväntas ger reproducerbara resultat, medan överdriven behandling med HCl förstör kärn arkitektur. Vi hittade bästa resultat efter 30 min inkubation med HCl. Vi rekommenderar att alltid använda färskt utspädd HCl och nygjorda 4% PFA lösning för DNA denaturering och retinala vävnad fixering.
Felsök resultat, rekommenderar vi för att inkludera tre till fyra biologiska replikat samtidigt optimera 5mC signal. Medan varje uppsättning kan immunhistokemisk färgning generera något olika resultat (mer eller mindre ljusa heterochromatic regioner), vilket förväntas i immunhistokemisk metod, 5mC och 5hmC nukleära fördelning inom den enskilda av avsnitt förväntas vara mycket reproducerbara, för så länge protokollet följs.
Denna teknik har också begränsning som vi konsekvent övervakat variabilitet i 5mC fördelning i ljusmätare cellkärnor i samma avsnitt. Vi hittade vissa kärnor som visade stark 5mC signal medan angränsande cellkärna visade ingen 5mC signal. Detta beror på begränsningar i Demaskering 5mC antigen av HCl behandling i frusna snitt.
Betydelsen av denna teknik kan 5mC lokalisering utan DNAS och proteinas K behandling leder till bättre bevarande av chromocenters. Denna teknik är förväntas arbeta kraftfullt om alla delar från alla ryggradsdjur djurvävnader, bärande 5mC, 5hmC märken, och behandlas med ett liknande angreppssätt, inte bara musen näthinnan, för så länge protokollet följs.

Epigenetisk reglering av utveckling och postmitotic homeostas av mus näthinnan är ett spännande område för forskning, som lovar att föra en ny förståelse för biologiska mekanismer som styr retinogenesis och cell öde bestämning, cell typspecifika metabolisk funktion samt cell patologier, celldöd och förnyelse1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. kromatin genomgår dynamiska förändringar i utveckling, liksom svar på variabeln externa signaler om det är stress, metaboliska eller cell death stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. i mus kärnor, kromatin delas in i aktiv euchromatin och inaktiva Heterokromatin6,19,20. Interphase kärnan, euchromatin är bosatt i regionen inre kärnan medan Heterokromatin fodrar den nukleära periferi och nucleolus. Detta mönster kallas konventionella och är starkt bevarad i Eukaryoter. Däremot har rod kärnor i nattaktiva djur som mus och råtta inverterad mönster där kärnan är ockuperat av Heterokromatin i mitten omgiven av euchromatin bildar den yttersta skal6,18, 20. Vid födseln har rod atomkärnor konventionell nukleär arkitekturen. Inversion av rod atomkärnor uppstår under utvecklingen av ombyggnad av konventionell nukleär arkitekturen. Under denna process, perifer Heterokromatin separerar från kärntekniska periferin och chromocenters smälter samman för att bilda en enda chromocenter i centrera av nucleus6,18.
Genomiskt DNA-metylering deltar i styra lokala kromatin konformation21. DNA-metylering sker vid 5' position cytosin rester av CpG dinucleotides som är berikad i regionen arrangören av många gener i mus genomen22,23,24,25,26 liksom i intergenic och intron regioner, som bära reglerande element27. Metylering av CpG öar i proximala initiativtagare21,24 och CpG sekvenser i gen enhancers27,28 är viktiga i regleringen av den dynamiska delstaten bivalent kromatin, som innehåller många utvecklingsmässiga gener/transkriptionsfaktorer spelar viktig roll i utveckling, cancer och åldrande29,30,31,32,33,34 . Tre DNA-metyltransferaser (DNMTs) delta i DNA-metylering under musen utveckling35. Alla tre DNMTs uttrycks under musen retinal utveckling36 och retina-specifika ändringar i Dnmt gener påverkar näthinnans utveckling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) är en oxidativ produkt av 5-metylcytosin (5mC) demetylering. Tre tio-elva translokation (TET) enzymer delta i 5mC demetylering37,38,39. Hydroxymetyl-C ändring anrikas i initiativtagare, gen organ och intergenic genomsekvenser inom genen rikt och aktivt transkriberas regioner27,40.
Det finns en mängd av beskrivs metoder för att fastställa förändrade DNA metylering mönster i celler41,42,43,44,45,46, några av dem gör det möjligt kvantifiera globala förändringar av DNA metylering medan andra fokuserar på exakta förändringar i CpG-rika regioner inom initiativtagare och smakförstärkare. Metoder för påvisande och kvantifiering av 5hmC var också rapporterade47, inklusive av immunhistokemi13. Immunhistokemiska tekniker, vilket aktiverar robust övervakning av 5mC och 5hmC förändringar i kärnor för att utveckla och postmitotic celler, är mycket informativ för avgränsar kromatin dynamics i situ svar på yttre eller inre förändringar påverkar de celler4,13,48,49. Men är detta synsätt benägna att underskatta DNA-metylering och hydroxymethylation förändringar på grund av tekniska svårigheter, i samband med att upptäcka cytosin ändringar i histologiska preparat. Detta beror på att nonpolar DNA-baser, inklusive 5mC och 5hmC-modifierade cytosin, döljs i center av dubbelsträngat DNA helix50, och kräver demaskerar. Detta är speciellt utmanande i frysta histologiska preparat, som kan snabbt förlora informativ organisation av den ursprungliga vävnaden när hårda behandling tillämpas.
Mus näthinnan är en utmärkt modell att dissekera bidraget av DNA metylering neural utveckling och postmitotic homeostas. Det finns bara 6 typer av nervceller (rod och konen fotoreceptorer, amakrina, bipolär, horisontell och ganglion celler), en glial celltyp (Muller glia) och en neuroepithelial cell typ (pigmentepitelet)51. Retinal celltyper rapporterades ha distinkta mönster av DNA metylering18,19, som nyligen har studerats vid singel-base resolution1,5,9,12. Vi rapporterade nyligen immunhistokemi för att avgränsar 5mC mönster av fördelning inom atomkärnor av näthinnans celler och förändringar i kärnan av vuxen mus näthinnan, där alla tre DNA-metyltransferaser har tagits bort av villkorlig inriktning 7. vår metod jämfört med ett antal rapporter, där närvaron av DNA-metylering i näthinnans celler kan ses bara som en positiv eller negativ signal i hypermethylated celler som genomgår apoptos, och aktiverat upptäcka särskilda kromatin arrangemang inom de retinala cellkärna, som vi och flera grupper rapporterade och diskuterats tidigare5,6,7,18,19,36 , 52. här, vi beskriver den immunhistokemiska (IHC) tekniken för att upptäcka 5mC och 5hmC i frusna PARAFORMALDEHYD-fasta histologiska snitt i Detaljer såväl som visar data, som vi har kunnat återge från vårt ursprungliga betänkande7 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29G1/2 ULTRA-FINE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissor</td>
			<td>Fine Science tools, Inc.&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>RPICORP.com</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide Superfrost plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N HCl</td>
			<td>VWR analytical&#160;</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mC</td>
			<td>Genway Biotech&#160;</td>
			<td>GWB-BD5190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5hmC</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaminB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab16048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-225-1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-585-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRM HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>388114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

Epigenetiken retinal utveckling är en väl studerat forskningsfält, som lovar att sätta en ny nivå av förståelse om mekanismerna bakom en mängd mänskliga retinala degenerativa sjukdomar och peka ut nya behandlingsmetoder. Nukleära arkitekturen av mus näthinnan är organiserad i två olika mönster: konventionella och inverterad. Konventionella mönster är universell där Heterokromatin är lokaliserad till periferin av kärnan, medan aktiva euchromatin är bosatt i det nukleära inre. Däremot är inverterad nukleära mönster unikt för de vuxna rod ljusmätare cellkärnor där Heterokromatin lokaliserar till nukleära center, och euchromatin är bosatt i nukleära peripheryen. DNA-metylering är huvudsakligen observeras i chromocenters. DNA-metylering är en dynamisk kovalent modifiering på cytosin rester (5-metylcytosin, 5mC) av CpG dinucleotides som är berikad med Regionkommittén arrangören av många gener. Tre DNA-metyltransferaser (DNMT1, DNMT3A och DNMT3B) delta i metylering av DNA under utveckling. Upptäcka 5mC med immunhistokemiska tekniker är mycket utmanande, bidrar till variation i resultat, som alla DNA-baser inklusive 5mC modified baser är dolda inom dubbelsträngat DNA spiralen. Detaljerad beskrivning av 5mC fördelning under utveckling är dock mycket informativ. Här, vi beskriver en reproducerbar teknik för robust immunhistokemisk detektion av 5mC och en annan epigenetisk DNA markör 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), som colocalizes med ”öppna”, transcriptionally aktivt kromatinet i utvecklingen och postmitotic mus näthinnan.

Att bestämma fördelningen av 5-metylcytosin (5mC) och 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) under retinal utveckling och i postmitotic näthinna, vi immunostained C57BL/6J mus retinal avsnitt från E16, P0, P15 och P90 med specifika antikroppar till 5mC och 5hmC.
Vid E16 var 5mC färgningen stark i chromocenters av cellkärnorna medan svag färgning observerades i hela cellkärnor (figur 1a). 5hmC färgningen var begränsad till cellkärna och var frånvarande från chromocenters (figur 1b).
I P0 näthinna, var 5mC signalen lokaliserad till chromocenters av cellkärnor och nukleära periferi (figur 2a, pilen och pilspets). Vi observerade även svag färgning av 5mC mellan chromocenters av cellen atomkärnor. 5hmC signalen var starkt närvarande i cellkärnorna utom chromocenters (figur 2b). Vi hittade fler kärnor färgas med 5mC och 5hmC i inre neuroblast lager (INBL) (figur 2 c, streckad linje)
I P15 näthinnan fann vi stark färgning av 5mC och 5hmC i yttre nukleära lagret (v), inre nukleära lagret (INL) och ganglion celllagrar (GCL) (figur 3). I Onlinekanaler (rod fotoreceptorer) var 5mC signalen närvarande i chromocenters av cellkärnor och nukleära periferi (siffror 3a-3 c, 3 g). 5hmC signalen hittades i de hela cellkärnorna utom chromocenters (siffror 3d-3f). Den transmissionselektronmikroskopi gjort på P15 näthinnan visar fördelningen av heterochromatic domäner i rod cellkärnan liknande som finns med 5mC antikropp signal (figur 3 h och 3i).
5mC färgningen i INL och GCL var stark i chromocenters av cellen atomkärnor och svag färgning observerades också i hela cellkärnan (siffror 3j-3 l och 3r-3t). I motsats till 5mC, var 5hmC signalen lokaliserad till de hela cellkärnorna utom chromocenters INL och GCL (siffrorna 3 m-3o och 3u-3w). Vi observerade starka 5hmC signal på peripheryen av GCL cellkärnor.
I adult rod fotoreceptorer var 5mC signalen begränsad till chromocenter och nukleära peripheryen av cell atomkärnor (figurerna 4a-4 c) medan 5hmc signal var begränsad till nukleära periferin (figurerna 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figur 1. Lokalisering av 5-metylcytosin och 5-hydroxymethylcytosine i mus näthinnan på embryonala dag 16. Immunfärgning av C57BL/6J näthinnan med antikroppar mot 5mC (röd, a) och 5hmC (grön, b). Vid E16 är 5mC signal mycket stark i chromocenters av cellkärna och också närvarande i hela cellkärnor på mycket lägre nivå. 5hmC färgning begränsades endast till cellkärna. Panel c representerar sammanslagna 5mC och 5hmC bild. Kärnorna är counterstained med DAPI (blå, c). Inläggningar representerar förstoring av området visas med asterisk i bilder. Skalstapeln: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Figur 2. Immunhistokemisk färgning av 5-metylcytosin och 5-hydroxymethylcytosine i mus näthinnan på postnatal dag 0. Immunolabeling av C57BL/6J näthinnan med antikroppar mot 5mC (röd, a) och 5hmC (grön, b). I P0 näthinnan är 5mC och 5hmC närvarande i både yttre neuroblast (ONBL) och inre neuroblast skikt (INBL). (a) 5mC signal är starkt närvarande i chromocenters (pil) och nukleära peripheryen av cell atomkärnor (pilspets). Svag färgning av 5mC har också observerats mellan chromocenters av cellkärnor. (b) 5hmC färgning är begränsad till cellkärnan och stark signal observeras i INBL (streckad linje i panel c). Panel c representerar sammanslagna 5mC och 5hmC bild. Kärnorna är counterstained med DAPI (blå, c). Inläggningar representerar förstoring av området visas med asterisk i bilder. Skalstapeln: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Figur 3. 5-metylcytosin och 5-hydroxymethylcytosine fördelning i mus näthinnan på postnatal dag 15. Immunfärgning av C57BL/6J näthinnan med anti-5mC och 5hmC antikroppar (a-g, j-y). I yttre nukleära lagret (Onlinekanaler) (rod fotoreceptorer), 5mC signalen (röd, a) oftast sammanfaller med chromocenters av cellen atomkärnor (pilspets, b) och också lokaliserar till nukleära periferin (pil, b). Panel b (röd) och c (grå) representerar förstoring av området visas med asterisk i bilden en. 5hmC signalen (gröna, d) är begränsad till de hela cellkärnorna utom chromocenters. Panelen e (grön) och f (grå) representerar förstoring av området visas med asterisk i bild d. Panel g står för sammanfogad 5mC och 5hmC bild. Kärnorna är counterstained med DAPI. Panelen h och jag är överföring elektronmikroskop bild av ljusmätare kärnor på postnatal dag 15 visar fördelningen av heterochromatic domäner. Svart pilspets i panelen h pekar på enda stav ljusmätare nucleus förstoras i panelen i. röda pilspetsar i panelen pekar till heterochromatic domäner inom rod ljusmätare nucleus medan röda pilarna pekar på Heterokromatin nukleära periferi. I INL (j-q) och GCL cellkärna (r-y), 5mC signalen (röd) är lokaliserad till chromocenters som är närvarande i periferin och svag färgning upptäcks också i resten av cellen atomkärnor. Panelen k (röd) och jag (grå) representerar förstoring av området visas med asterisk i bild j. 5hmC färgningen (grön) i INL och GCL cellkärnan är begränsad till hela cellkärnan. Observera stark 5hmC färgning i nukleära peripheryen av GCL celler. Panelen p och x representerar sammanslagna 5mC och 5hmC bild medan panelen q och y representerar förstoring av området visas med asterisk i bild p och x respektive. Kärnorna är counterstained med DAPI. Skalstapeln: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Figur 4. 5-metylcytosin och 5-hydroxymethylcytosine fördelning i rod ljusmätare kärnor av C57BL/6J mus näthinnan på postnatal dag 90. 5mC färgningen (röd, en) är starkt närvarande i chromocenter av cellkärnor och också svagt närvarande i nukleära peripheryen. Panel b (röd) och c (grå) representerar förstoring av området visas med asterisk i bilden en. 5hmC färgningen (gröna, d) begränsas enbart till nukleära periferin Panel e (grön) och f (grå) representerar förstoring av området visas med asterisk i bild d. Panel g står för sammanfogad 5mC och 5hmC bild medan panelen h är förstoringen av området visas med asterisk i bilden g. kärnor är counterstained med DAPI (blå). Skalstapeln: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunhistokemisk detektion av 5-metylcytosin och 5-Hydroxymethylcytosine utveckla och Postmitotic mus näthinnan

Syftet med denna rapport är att beskriva protokollet för robust immunhistokemisk detektion av epigenetiska markörer, 5-metylcytosin (5mC) och 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) i utvecklingen och postmitotic mus näthinnan.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelat super-upplösning och elektronmikroskopi för att lösa Protein lokalisering i zebrafiskar näthinna

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion och koronalt Slice förberedelse att utveckla mus hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Förbereda utveckla perifera Olfactory vävnad för molekylär och immunhistokemisk analys i Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Bedömning av ultrastrukturella neuroplasticitet parametrar efter i Utero transduktion i utvecklingsländer mus hjärnan och ryggmärgen

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion av Drosophila Pupp näthinnan för immunohistokemi, västra analys och RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...