Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Undersøgelsen blev støttet af Academy of Finland (grant nummer 297886), programmet Human reservedele af Tekes, finsk finansiering agentur for teknologi og Innovation, den finske øje og væv Bank Foundation og den finske Kulturfond. Forfatterne vil gerne takke de biomedicinske laboranter Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt og Outi Heikkilä for fremragende teknisk bistand og bidrag til cellekultur. Professor Katriina Aalto-Setälä er anerkendt for at levere den hiPSC linje bruges og BioMediTech Imaging Core facilitet for at levere udstyr til fluorescens imaging.

Universitetet i Tampere er godkendt af den nationale myndighed for Medicolegal anliggender Finland (Dnro 1426/32/300/05) til at gennemføre forskning på menneskelige embryoner. Instituttet har også støttende sætninger af det etiske udvalg af bydelen Pirkanmaa Hospital til at udlede, kultur, og skelne menneskelige stamceller linier (Skottman/R05116) og anvende hiPSC linjer i oftalmologiske forskning (Skottman/R14023). Ingen nye cellelinjer blev udledt til denne undersøgelse.
Bemærk: Proto...

<ol>
	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology,+disease+and+treatment.">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions.">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li><li>Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+induction+promotes+corneal+epithelial+cell+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).</li><li>Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Det forventede resultat af denne protokol er den succesfulde og robust generation af LESCs fra en enkelt cellesuspension af FF hPSC inden for ca. 3,5 uger. Som hornhindens epitel udvikler sig fra overfladen ectoderm29, det første trin i protokollen tager sigte på styring hPSCs mod denne afstamning. En kort 24 h induktion med at omdanne vækst faktor beta (TGF-β) antagonist SB-505124 og bFGF bruges til at fremkalde ectodermal differentiering, efterfulgt af 48 h mesodermale BMP-4 stikord til at s...

Gennemsigtig hornhinden ved okulær overflade giver lys til at indtaste nethinden og indeholder størstedelen af øjets refraktive magt. Det yderste lag, Strata hornhindens epitel, er løbende regenereres ved limbal epitelial stamceller (LESCs). LESCs er bosat i den basale lag af limbal nicher på corneoscleral junction1,2. LESCs mangler specifikke og unikke markører, så deres identifikation kræver en mere omfattende analyse af en række formodede markører. Epitelial transskription faktor p63 og især N-terminalt afkortet udskrift af den alpha isoform af p63 (ΔNp63α), er blevet foreslået som en relevant positiv LESC markør3,4. Asymmetriske fordeling af LESCs mulighed at selv forny, men også producere afkom, der vandrer centripetally og anteriorly. Som cellerne fremskridt mod hornhindens overflade de gradvist mister deres stemness og endelig uhelbredeligt differentiere til overfladiske planocellulære celler, der er løbende tabt fra hornhindens overflade.
Skade på nogen af de hornhinde lag kan føre til svære synshandicap, og hornhinde defekter er således en af de førende årsager til tab af synet på verdensplan. I limbal stamceller mangel (LSCD), er limbus ødelagt af sygdommen eller traumet, der fører til conjunctivalization og mattering af hornhindens overflade og efterfølgende tab af vision5,6. Celle substitutionsterapi ved hjælp af autologe eller allogene limbal grafts tilbyder en behandlingsstrategi for patienter med LSCD4,7,8,9. Men høst autologe transplantater bærer en risiko for komplikationer til det raske øje, og donorvæv er en mangelvare. Humane pluripotente stamceller (hPSCs), specifikt menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og menneskeligt inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), kan tjene som en ubegrænset kilde til klinisk relevante celletyper, herunder hornhindens epitel celler. HPSC-afledte LESCs (hPSC-LESCs) repræsenterer derfor et attraktivt nye celle kilde for okulær celleudskiftnings.
Traditionelt, har både udifferentierede hPSC kultur metoder og deres differentiering protokoller til LESCs stolet på brug af udefinerede feeder celler, animalsk sera, konditioneret medier eller fostervand membraner10,11, 12 , 13 , 14 , 15. for nylig, indsats mod sikrere celleterapi har bedt om at søge efter mere standardiseret og xeno-fri kultur og differentiering protokoller. Som følge heraf er flere definerede og xeno-gratis metoder til langtidskulturer af udifferentierede hPSCs nu kommercielt tilgængelige16,17,18. Som et kontinuum, styret differentiering protokoller bygger på molekylære stikord til at guide hPSCs til hornhindens epitel skæbne har været for nylig indført19,20,21,22, 23. Endnu bruges mange af disse protokoller enten udefineret, feeder baseret hPSCs som udgangsmateriale eller komplekse, xenogene vækstfaktor cocktails for differentiering.
Formålet med denne protokol er at give en robust, optimeret, xeno- og feeder-fri hPSC kultur metode og efterfølgende differentiering til hornhinde LESCs. Éncellelag kultur af pluripotente hPSCs på laminin-521 (LN-521) matrix i definerede, albumin-fri hPSC medium (specielt vigtigt 8 Flex) giver mulighed for hurtig produktion af homogene råvare til differentiering. Derefter en simpel to-trins differentiering strategi guider hPSCs mod overfladen ectodermal skæbne i suspension, efterfulgt af vedhængende differentiering til LESCs. En celle population hvor > 65% express ΔNp63α er opnået inden for 24 dage. Xeno - og feeder-fri protokol er blevet testet med flere hPSC linjer (både hESCs og hiPSCs), uden krav til celle linje specifikke optimering. Protokoller for weekend-free vedligeholdelse, passaging, cryostoring og hPSC-LESC fænotyper beskrevet her aktiverer produktionen af store partier af højkvalitative LESCs for klinisk eller forskning formål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Hornhinde limbal epitelial stamceller (LESCs) er ansvarlig for løbende fornyelse af hornhindens epitel, og dermed opretholde hornhinde homøostase og visuel klarhed. Humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte LESCs giver en lovende celle kilde for hornhinde celleudskiftnings. Udefineret, xenogene kultur og differentiering betingelser forårsage variation i forskningsresultater og hindre den kliniske oversættelse af hPSC-afledte therapeutics. Denne protokol indeholder en reproducerbar og effektiv metode til hPSC-LESC differentiering på xeno- og feeder celle-fri betingelser. For det første tjener éncellelag kultur af udifferentierede hPSC på rekombinant laminin-521 (LN-521) og definerede hPSC medium som et fundament for robust produktion af høj kvalitet råvare til differentieringer. For det andet giver en hurtig og enkel hPSC-LESC differentiering metode LESC populationer på kun 24 dage. Denne metode omfatter en fire-dages overflade ectodermal induktion i suspension med små molekyler, efterfulgt af vedhængende kultur fase på LN-521/kollagen IV kombination matrix i definerede hornhindens epitel differentiering medium. Cryostoring og udvidede differentiering yderligere renser cellen befolkningen og gør det muligt for bank af celler i store mængder til celleterapi. De deraf følgende høj kvalitet hPSC-LESCs give en potentiel roman behandlingsstrategi for hornhindens overflade genopbygning at behandle limbal stamceller mangel (LSCD).

Fra hPSCs til hPSC-LESCs
Hele processen fra inducere differentiering af FF hPSCs til cryostoring hPSC-LESCs tager omkring 3,5 uger. Skematisk oversigt over metoden differentiering fremhæver dens vigtigste skridt er præsenteret i figur 1A. Figur 1B viser typiske morfologier af cellepopulationer i forskellige faser af protokollen. De fremlagte data er fremstillet med Regea...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Denne protokol indfører en simpel to-trins metode til skelne hornhinde limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller på xeno- og feeder celle-fri kultur betingelser. Metoderne celle kultur præsenteres her aktiverer omkostningseffektive, omfattende produktion af klinisk kvalitet celler gælder for hornhinde celle terapi brug.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Denne protokol indførte en defineret feeder celle fri metode til at differentiere hornhinde limbale epitel stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller. Limbal epitel stamceller er ansvarlige for at forny hornhinden epitel i det sunde øje. Skader på disse celler fører til en tilstand kendt som limbal stamcellemangel, og til tab af hornhinde klarhed.De cellekulturmetoder, der vises her, muliggør effektiv produktion af limbale epitelstamceller til fremtidige majscelleerstatningsbehandlinger. Til at begynde, passage og vedligeholde feeder fri menneskelige pluripotent stamcellekultur som skitseret i tekstprotokollen. Sørg for kun at bruge menneskelige pluripotente stamceller af høj kvalitet som udgangsmateriale til differentiering.Når du er klar til at fremkalde embryoid kropsdannelse, varme alle de nødvendige materialer og reagenser til stuetemperatur i en laminar flow hætte. Løsriv feeder fri menneskelige pluripotente stamceller til suspensionen ved at tilføje 500 mikroliter af xeno gratis trypsin EDTA til hver brønd. En inkubering ved 37 grader Celsius, med 5% CO2.Efter tre minutter fjernes cellerne fra inkubatoren, og cellemorfologien kontrolleres for at bestemme den optimale fase for fjernelse af trypsin. Overhold omhyggeligt cellerne for at bestemme det optimale tidspunkt at fjerne xeno gratis tryspin EDTA, når cellerne er rundet op, men ikke har løsrevet helt. På det optimale tidspunkt skal du fjerne xeno gratis trypsin EDTA fra cellerne.Tilføj defineret trypsinhæmmer og forsigtigt pipette til at frigøre cellerne. Encellesuspensionen opsamres i et centrifugerør på 50 milliliter. Centrifuge ved 300g i fem minutter.Fjern derefter supernatanten, og resuspend cellerne i en milliliter kultur medium. Efter optælling af cellerne, distribuere to til tre millioner celler i tre milliliter basal induktion medium suppleret med fem mikromolar blebbistatin til hver brønd af en lav vedhæftet fil seks godt plade. Inkuber natten over ved 37 grader Celsius med 5% CO2.Den næste dag, kontrollere kvaliteten af embryoid organer under et mikroskop. Fjern mediet, og erstatte det med tre milliliter basal induktion medium suppleret med 10 mikromolar SB-505124 og 50 nanogram pr milliliter af menneskelige grundlæggende glasfiber vækstfaktor. Fortsæt inkubering ved 37 grader Celsius med 5% CO2.De følgende to dage fjernes mediet, og det erstattes med tre milliliter basal induktionsmedium suppleret med 25 nanogram pr. milliliter knoglemorfogenetisk protein fire. Fortsæt derefter inkubationen ved hjælp af de tidligere betingelser. På dag fire, forberede en blanding af 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter Laminin-521, og fem mikrogram per kvadratcentimeter af menneskelige placenta kollagen type fire, fortyndet i DPBS indeholder calcium to og magnesium to ioner.Ved hjælp af denne blanding, pels de 100 millimeter væv kultur retter til overholdelse differentiering i den samlede belægning volumen på fem milliliter pr fad. Forsegle pladerne, og gemme dem på fire grader Celsius natten over. På dag fem, varm alle de nødvendige materialer og reagenser til stuetemperatur i en laminar flow hætte.Derefter fjernes belægningsopløsningen, og der tilsættes 10 milliliter forvarmt differentieringsmedium til hver skål. Ved hjælp af en pipette, overføre embryoid organer fra en enkelt plade godt på tværs af to til tre væv kultur retter. Derefter forsigtigt ryste hver kultur parabol til jævnt distribuere embryoid organer.Vedligehold cellerne i klæbende kultur ved 37 grader Celsius med 5% CO2 i de næste to og en halv til tre uger, og sørg for at erstatte mediet med 10 milliliter frisk differentiering medium tre gange om ugen. Brug et fasekontrastmikroskop til regelmæssigt at kontrollere cellerne for fremkomsten af korrekt epitelmorfologi. Til at begynde, forvard alle de nødvendige materialer og reagenser til stuetemperatur i en laminar flow hætte, bortset fra kryopræservering medium, som bør være forkølet.Dernæst løsrive den menneskelige pluripotente stamceller afledt limbale epitel stamceller til enkelt celle suspension ved at tilføje xeno fri trypsin EDTA og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% CO2. Efter fem minutter fjernes cellerne fra inkubatoren, og cellemorfologien kontrolleres for at bestemme den optimale fase for fjernelse af trypsin. Overhold omhyggeligt cellerne for at bestemme det optimale tidspunkt at fjerne xeno gratis trypsin EDTA, når cellerne er rundet op, men ikke har løsrevet helt.På det optimale tidspunkt fjernes xeno-fri trypsin EDTA fra cellerne, og cellerne tages af som beskrevet tidligere. Efter optælling af cellerne, centrifuge dem ved 300g i fem minutter. Inspirer mediet, og resuspend cellerne i forkølet xeno fri kryopræservering medium.Ved hjælp af en pipette overføres enkeltcellesuspensionen til kryorør, så hvert kryorør indeholder mellem 500.000 til en million celler i en milliliter kryopræserveringsmedium. Rørene anbringes i en frysebeholder. Inden for fem minutter, overføre dem til en fryser på negative 80 grader Celsius for natten opbevaring.Den næste dag, overføre rørene til flydende kvælstof til langtidsopbevaring. Før optøning af cellerne, pels alle nødvendige retter og plade brønde med en blanding af fem mikrogram per kvadratcent centimeter menneskelige placenta kollagen type fire, og 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter LM-521, og pre-varm alle de nødvendige materialer og reagenser til stuetemperatur i laminar flow hætte. Dernæst skal du fjerne belægningsopløsningen fra skålene og pladedybene og tilsæt den passende mængde forvarte differentieringsmedium.Tilsæt forvarmt differentieringsmedium til et 15 milliliter konisk rør. Tø cellerne hurtigt op til stuetemperatur. Når cellesuspensionen er optøet, overføres den straks til det koniske centrifugerør.Centrifuge ved 300g i fem minutter. Inspirer mediet, og resuspend cell pellet i differentiering medium for at fjerne enhver kryopræservering medium. Plade cellerne på forbelagte retter i differentiering medium ved en tæthed på 40, 000 til 50, 000 celler per kvadratcentimeter.Vedligehold cellerne ved 37 grader Celsius ved 5% CO2, der erstatter differentieringsmediet tre gange om ugen. På Laminin-521 danner de udifferentierede foderautomater frie menneskelige pluripotente stamceller først forskellige kolonier med skarpe kanter, som smelter sammen til homogene monolag ved sammenløb. Dyrkning i basal induktionsmedium suppleret med fem mikromolar blebbistatin i 24 timer typisk producerer en suspension af stramme, regelmæssige embryoid organer i forskellige størrelser, mens embryoid kroppen morfologi bør ikke ændre sig dramatisk under overfladen ectodermal induktion i suspension, koloniale udvækst ses at dukke op kort efter embryoid organer er belagt på kollagen type fire og Laminin-521 kombination matrix i differentiering medium.Inden for 21 til 25 dage efter differentiering danner cellerne sammenløbet homogene lag med polygonal morfologi, der er typisk for epitelceller. Cellerne kan derefter kryo opbevares til senere brug, da levedygtighed og morfologi er velbevaret efter optøning. På dag 24 af differentiering, langt de fleste af cellerne udtrykt parret boks protein, PAX6, den vigtigste regulator af øjet udvikling, samt p63 alpha, den bredt anerkendte LESC markør.Delta Np63 er coexpressed i de fleste af de p63 alfa positive celler, bekræfter den mest hornhinde specifikke delta Np63 alfa positiv celle fænotype. Andre markører er udtrykt i en del, mens andre er målbart på dette punkt, hvilket indikerer differentiering har udviklet sig mod den unipotente limbale epitel forfædre, men terminaldifferentiering i modne hornhinde epitelceller har endnu ikke fundet sted. I gennemsnit genererer hver udifferentieret feeder fri menneskelige pluripotente stamceller 0,7 celler ved dag 25.Mindst 65% delta Np63 alfa positiv cellepopulation kan forventes af dag 24. Kryopræservering yderligere renser cellepopulationen. Samlet set er de metoder, der præsenteres her, relativt enkle, men der er et par kritiske punkter til succes.Høj kvalitet af udgangsmaterialet er afgørende, samt blide, flydende cellekultur teknikker i almindelighed. Denne protokol giver robuste midler til at producere limbale epitel stamceller til kliniske anvendelser, samt til forskellige forskningsformål. Desuden kan metoden let ændres til differentiering af retinale pigment epitelceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering af pluripotente stamceller til NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreatisk progenitorer

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiering af humane pluripotente stamceller til trofoblastceller

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering af humane pluripotente stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Forbigående behandling af humane pluripotente stamceller med DMSO for at fremme differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...