Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

L’étude a été financée par l’Académie de Finlande (numéro de licence 297886), le programme des pièces de rechange humaine de Tekes, l’Agence finlandaise de financement pour la technologie et l’Innovation, le œil finlandais et Tissue Bank Foundation et la Fondation culturelle finlandaise. Les auteurs remercient les techniciens de laboratoire biomédical Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt et Outi Heikkilä excellente assistance technique et de la contribution à la culture cellulaire. Professeur Katriina Aalto-Setälä est reconnu pour prévoyant la fourniture d’équipements pour l’imagerie de fluorescence de la hiPSC ligne utilisée et BioMediTech Imaging Core facility.

Université de Tampere a l’approbation de l’autorité nationale pour les affaires médico-légales Finlande (Dnro 1426/32/300/05) de mener des recherches sur les embryons humains. L’Institut a également des déclarations de soutien du Comité éthique du District hospitalier de Pirkanmaa dérivent, culture, et de différentier les lignées de CSEh (Skottman/R05116) et d’utiliser les lignes de hiPSC dans la recherche ophtalmique (Skottman/R14023). Aucune nouvelles lignées de cellules ont été calculées pour ce...

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	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Le résultat escompté de ce protocole est la génération réussie et robuste de LESCs d’une suspension monocellulaire de hPSC FF environ 3,5 semaines. Comme l’épithélium cornéen se développe à partir de l’ectoderme de surface29, la première étape du protocole vise à hPSCs vers cette lignée de direction. Une induction courte 24h avec transformation antagoniste du facteur de croissance bêta (TGF-β) SB-505124 et bFGF sont utilisés pour induire la différenciation ectodermique, sui...

La cornée transparente à la surface oculaire permet à la lumière d’entrer dans la rétine et fournit la majorité du pouvoir de réfraction de le œil. La couche la plus externe, l’épithélium cornéen stratifié, est continuellement régénérée par les cellules souches épithéliales limbique (LESCs). Les LESCs se trouvent dans la couche basale des niches limbique à la jonction de corneoscleral1,2. LESCs n’ont pas des marqueurs spécifiques et uniques, donc leur identification nécessite une analyse plus approfondie d’un ensemble de marqueurs putatifs. Épithéliales transcription factor p63 et surtout en position N-terminale tronquée transcription de l’isoforme alpha de p63 (ΔNp63α), a été proposé comme une pertinente positive LESC marqueur3,4. Une répartition asymétrique des LESCs permet à se renouveler, mais également produire la progéniture qui migrent de façon centripète et vers l’avant. Comme les cellules des progrès vers la surface de la cornée ils progressivement perdre leurs stemness et enfin faire la différence en phase terminale à des cellules malpighiennes superficielles qui sont constamment perdus de la surface de la cornée.
Dommages à l’une des couches cornéens peuvent mener à la déficience visuelle grave, et défauts cornéens sont donc une des principales causes de cécité dans le monde entier. Dans insuffisance limbique des cellules souches (LSCD), le limbe est détruite par une maladie ou un traumatisme qui mène à conjunctivalization et opacification de la surface de la cornée et la perte de vision5,6. Thérapie de remplacement de cellules à l’aide de greffes limbique autologues ou allogéniques propose une stratégie thérapeutique pour les patients atteints LSCD4,7,8,9. Toutefois, récolte des greffes autologues porte un risque de complications à le œil sain et tissu du donneur est en bref l’approvisionnement. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), spécifiquement les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), peut servir comme une source illimitée de types de cellules cliniquement pertinents, y compris les cellules épithéliales cornéennes. Par conséquent, LESCs dérivé de hPSC (hPSC-LESCs) représentent une source de cellule nouveau attrayant pour la thérapie de remplacement de cellules oculaires.
Traditionnellement, des méthodes de culture hPSC indifférencié et leurs protocoles de différenciation à LESCs sont sont appuyés sur l’utilisation de cellules nourricières indéfini, sérums animaux, milieux conditionnés ou membranes amniotiques10,11, 12 , 13 , 14 , 15. récemment, les efforts vers des produits de thérapie cellulaire plus sûrs ont incité la recherche de plusieurs protocoles standardisés et xeno sans la culture et de la différenciation. Par conséquent, plusieurs méthodes définies et xeno-gratuit pour les cultures à long terme des hPSCs indifférencié sont maintenant disponibles dans le commerce16,17,18. Comme un continuum, différenciation dirigée en s’appuyant sur de hPSCs sort épithéliale cornéenne, les repères moléculaires des protocoles ont été récemment introduits19,20,21,22, 23. Encore bon nombre de ces protocoles utilisés soit hPSCs chargeur basé indéfini, comme matériau, ou des cocktails complexes, xénogéniques facteur de croissance pour la différentiation de départ.
Le but du présent protocole est de fournir un robuste et optimisé, xeno- et méthode de culture exempte d’alimentation hPSC et différenciation ultérieure à LESCs cornéens. Culture monocouche de pluripotentes hPSCs sur laminin-521 (LN-521) matrice dans un milieu défini, sans albumine hPSC (notamment essentiels 8 Flex) permet la production rapide de matière homogène de différenciations. Par la suite, un simple, stratégie de différenciation en deux étapes Guide hPSCs vers la surface ectodermique sort en suspension, suivie de différenciation adhérente à LESCs. Une population de cellules où > 65 % express ΔNp63α est obtenue dans les 24 jours. La xéno - et chargeur-un protocole d’entente a été testé avec plusieurs lignes de hPSC (CSEh et hiPSCs), sans aucune obligation pour l’optimisation spécifique de la cellule ligne. Les protocoles pour le week-end-gratuit maintenance, passage, cryostoring et hPSC-LESC phénotypage décrits ici permettent la production d’importants lots de qualité LESCs pour clinique ou des fins de recherche.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Cellules souches épithéliales limbique cornée (LESCs) sont responsables de la renouveler en permanence l’épithélium cornéen et maintenant ainsi l’homéostasie cornéenne et une clarté visuelle. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-LESCs dérivées fournissent une source prometteuse de la cellule pour la thérapie de remplacement de cellules cornéennes. Conditions de culture et de la différenciation indéfinies, xénogéniques provoquent des variations dans les résultats de la recherche et entravent la traduction clinique de produits thérapeutiques dérivés de hPSC. Ce protocole prévoit une méthode reproductible et efficace pour la différenciation hPSC-LESC conditions xeno - et chargeur acellulaire. Tout d’abord, culture monocouche de hPSC indifférenciée sur recombinant laminin-521 (LN-521) et moyen défini hPSC sert de base pour une production robuste de haute qualité de matière première pour des différenciations. Deuxièmement, une méthode de différenciation rapide et simple hPSC-LESC donne des populations LESC en seulement 24 jours. Cette méthode comprend une induction surface ectodermique de quatre jours en suspension avec des petites molécules, suivie par phase de culture adhérent sur matrice de combinaison de LN-521/collagène IV dans un milieu défini différenciation épithéliale cornéenne. Cryostoring prolongée différenciation purifie la population cellulaire et permet aux banques de cellules de grandes quantités de produits de thérapie cellulaire. Les qualité qui en résulte hPSC-LESCs fournissent une stratégie de nouveau traitement potentiel pour la reconstruction de surface cornéenne traiter l’insuffisance limbique des cellules souches (LSCD).

De hPSCs à hPSC-LESCs
L’ensemble du processus d’induire la différenciation de FF hPSCs à cryostoring hPSC-LESCs prend environ 3,5 semaines. Figure 1 aprésente un aperçu schématique de la méthode de différenciation mettant en évidence ses principales étapes. Figure 1 b montre une morphologie typique des populations de cellules dans les différentes phases du p...

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Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Ce protocole a introduit une méthode définie sans cellule d’alimentation pour différecier les cellules souches épithéliales limbales cornéeles des cellules souches pluripotentes humaines. Les cellules souches épithéliales limbales sont responsables du renouvellement de l’épithélial cornéen dans l’œil sain. Les dommages à ces cellules mènent à une condition connue sous le nom d’insuffisance limbale de cellules souches, et à la perte de clarté cornéenne.Les méthodes de culture cellulaire présentées ici permettent une production efficace de cellules souches épithéliales limbales pour les futures thérapies de remplacement des cellules cornéeles. Pour commencer, passer et maintenir la culture de cellules souches pluripotentes humaines libres comme décrit dans le protocole de texte. Assurez-vous d’utiliser uniquement des cellules souches pluripotentes humaines de haute qualité comme matériau de départ pour les différenciations.Lorsqu’il est prêt à induire la formation du corps embryoïde, réchauffer tous les matériaux nécessaires et les reagents à la température ambiante dans une hotte d’écoulement laminaire. Détachez les cellules souches pluripotentes humaines libres de la mangeoire à la suspension en ajoutant 500 microlitres de trypsine libre xéno EDTA à chaque puits. Une incubation à 37 degrés Celsius, avec 5% de CO2.Après trois minutes, retirez les cellules de l’incubateur et vérifiez la morphologie cellulaire pour déterminer la phase optimale pour l’ablation de la trypsine. Observez attentivement les cellules pour déterminer le moment optimal pour enlever l’EDTA sans tryspin xeno, lorsque les cellules se sont arrondies, mais ne se sont pas détachées complètement. Au moment optimal, retirez la trypsine xéno libre EDTA des cellules.Ajouter l’inhibiteur défini de la trypsine et la pipette doucement pour détacher les cellules. Recueillir la suspension à cellule unique dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Centrifugeuse à 300g pendant cinq minutes.Ensuite, retirez le surnatant et resuspendez les cellules en un millilitre de milieu de culture. Après compter les cellules, distribuer deux à trois millions de cellules en trois millilitres de milieu d’induction basale complété par cinq blebbistatin micromolaire à chaque puits d’un faible attachement six plaque de puits. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.Le lendemain, vérifiez la qualité des corps embryoïdes au microscope. Retirez le milieu et remplacez-le par trois millilitres de milieu d’induction basale complétés par 10 micromolaires SB-505124 et 50 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance de fibre de verre de base humain. Continuer à couver à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.Les deux jours suivants, retirez le milieu et remplacez-le par trois millilitres de milieu d’induction basale, complétés par 25 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénétique osseuse quatre. Ensuite, continuez l’incubation en utilisant les conditions précédentes. Le quatrième jour, préparer un mélange de 0,5 microgramme par centimètre carré de Laminin-521, et cinq microgrammes par centimètre carré de collagène placentaire humain de type quatre, dilué dans DPBS contenant du calcium deux et du magnésium deux ions.À l’aide de ce mélange, enrober les plats de culture tissulaire de 100 millimètres pour une différenciation adhérente dans un volume total de revêtement de cinq millilitres par plat. Sceller les plaques et les conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le cinquième jour, réchauffer tous les matériaux et les réacoleurs nécessaires à température ambiante dans un capot d’écoulement laminaire.Après cela, retirez la solution de revêtement et ajoutez 10 millilitres de différenciation préchauffée moyenne à chaque plat. À l’aide d’une pipette, transférer les corps embryoïdes d’une seule plaque à travers deux à trois plats de culture tissulaire. Ensuite, secouez doucement chaque plat de culture pour répartir uniformément les corps embryoïdes.Maintenir les cellules en culture adhérente à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pour les deux prochaines semaines et demie à trois semaines, en s’assurant de remplacer le milieu par 10 millilitres de milieu de différenciation frais trois fois par semaine. Utilisez un microscope à contraste de phase pour vérifier régulièrement les cellules pour l’émergence d’une morphologie épithéliale correcte. Pour commencer, préchauffer tous les matériaux et les réamen nécessaires à la température ambiante dans un capot d’écoulement laminaire, à l’exception du milieu de cryopréservation, qui doit être pré-refroidi.Ensuite, détachez les cellules souches pluripotentes humaines dérivées des cellules souches épithéliales limbales à la suspension d’une seule cellule en ajoutant de la trypsine EDTA sans xéno et en couveant à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Après cinq minutes, retirez les cellules de l’incubateur et vérifiez la morphologie cellulaire pour déterminer la phase optimale pour l’ablation de la trypsine. Observez attentivement les cellules pour déterminer le moment optimal pour enlever la trypsine libre xéno EDTA, lorsque les cellules se sont arrondies, mais ne se sont pas détachées complètement.Au moment optimal, retirez la trypsine libre xéno EDTA des cellules, et détachez les cellules comme décrit précédemment. Après avoir compté les cellules, centrifugez-les à 300g pendant cinq minutes. Aspirez le milieu et réutilisez les cellules dans un milieu de cryopréservation libre xéno pré-refroidi.À l’aide d’une pipette, transférer la suspension à cellule unique en cryo-tubes pour que chaque cryo-tube contienne entre 500 000 et un million de cellules dans un millilitre de milieu de cryopréservation. Placer les tubes dans un contenant de congélation. Dans les cinq minutes, les transférer dans un congélateur à 80 degrés Celsius négatifs pour l’entreposage pendant la nuit.Le lendemain, transférer les tubes dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Avant de décongeler les cellules, enrober tous les plats et puits d’assiette nécessaires d’un mélange de cinq microgrammes par centimètre carré de collagène placentaire humain de type quatre, et de 0,5 microgramme par centimètre carré de LM-521, et préchauffer tous les matériaux et réagencés nécessaires à la température ambiante dans le capot d’écoulement laminaire. Ensuite, retirez la solution de revêtement des plats et des puits d’assiette et ajoutez le volume approprié de milieu de différenciation préchauffé.Ajouter le milieu de différenciation préchauffé à un tube conique de 15 millilitres. Décongeler les cellules rapidement à température ambiante. Une fois décongelée, transférer immédiatement la suspension cellulaire dans le tube de centrifugeuse conique.Centrifugeuse à 300g pendant cinq minutes. Aspirer le milieu, et résusquer la pastille cellulaire dans le milieu de différenciation pour enlever n’importe quel milieu de cryopréservation. Plaquez les cellules sur des plats précoated dans le milieu de différenciation à une densité de 40.000 à 50.000 cellules par centimètre carré.Maintenir les cellules à 37 degrés Celsius à 5% de CO2, en remplaçant le milieu de différenciation trois fois par semaine. Sur Laminin-521, les cellules souches pluripotentes humaines libres de haute qualité indifférenciées forment d’abord des colonies distinctes avec des bords tranchants, qui se fondent à des monocouches homogènes au confluent. La culture dans le milieu basal d’induction, complétée avec cinq blebbistatin micromolar pendant 24 heures produit typiquement une suspension des corps embryoïdes serrés et réguliers de différentes tailles, alors que la morphologie embryoïde de corps ne devrait pas changer de façon spectaculaire pendant l’induction ectodermale de surface dans la suspension, la excroissance coloniale est vue pour apparaître peu de temps après que les corps embryoïdes soient plaqués sur le type quatre de collagène et la matrice de combinaison laminin-521 dans le milieu de différenciation.Dans les 21 à 25 jours suivant la différenciation, les cellules forment des couches homogènes confluentes, avec morphologie polygonale, typique des cellules épithéliales. Les cellules peuvent ensuite être cryo stockées pour une utilisation ultérieure, car la viabilité et la morphologie sont bien conservées après la décongélation. Au jour 24 de la différenciation, la grande majorité des cellules ont exprimé la protéine appariée de boîte, PAX6, le régulateur principal du développement d’oeil, aussi bien que l’alpha de p63, le marqueur largement reconnu de LESC.Delta Np63 est coexprimé dans la plupart des cellules alpha positives p63, confirmant le phénotype cellulaire alpha positif alpha np63 le plus spécifique à la cornée. D’autres marqueurs sont exprimés en partie, tandis que d’autres sont indétectables à ce stade, indiquant que la différenciation a progressé vers les progéniteurs épithéliales limbaux unipotents, mais la différenciation terminale en cellules épithéliales cornéelles matures n’a pas encore eu lieu. En moyenne, chaque chargeur indifférencié exempt de cellules souches pluripotentes humaines génère 0,7 cellules au jour 25.Au moins 65% delta Np63 alpha population de cellules positives peuvent être attendus au jour 24. La cryopréservation purifie davantage la population cellulaire. Dans l’ensemble, les méthodes présentées ici sont relativement simples, mais il y a quelques points critiques à réussir.La haute qualité du matériau de départ est essentielle, ainsi que les techniques douces et fluides de culture cellulaire en général. Ce protocole fournit des moyens robustes de produire des cellules souches épithéliales limbales pour des applications cliniques, ainsi qu’à diverses fins de recherche. En outre, la méthode peut être facilement modifiée pour la différenciation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Recherche

Biologie du développement

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d&#39;un système de transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Traitement transitoire des cellules souches pluripotentes humaines avec DMSO pour promouvoir la différenciation

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...