Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Die Studie wurde unterstützt durch die Akademie von Finnland (Grant-Nummer 297886), das menschliche Ersatzteile-Programm von Tekes, Finnish Funding Agency für Technologie und Innovation, die finnische Augen- und Gewebe-Bank-Stiftung und der finnischen Kulturstiftung. Die Autoren danken die biomedizinischen Laboranten Outi Melin, Hanna Pekkanen und Emma Vikstedt Outi Heikkilä für hervorragende technische Unterstützung und Beitrag zur Zellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä ist anerkannt für die Bereitstellung der HiPSC Linie verwendet und BioMediTech Imaging Core Facility für die Bereitstellung von Ausrüstung für die Fluoreszenz-Bildgebung.

Universität Tampere hat die Genehmigung der Nationalbehörde für rechtsmedizinische Angelegenheiten Finnland (Dnro 1426/32/300/05), Forschung an menschlichen Embryonen zu betreiben. Das Institut hat auch unterstützende Aussagen der Ethik-Ausschuß des Landkreises Pirkanmaa Krankenhaus ableiten, Kultur, und differenzieren hESC Linien (Skottman/R05116) und HiPSC Linien in Augenheilkunde (Skottman/R14023) zu verwenden. Keine neuen Zell-Linien wurden für diese Studie abgeleitet.
Hinweis: Die b...

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	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. 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J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche und robuste Generation der LESCs aus einer einzigen Zelle Aussetzung der FF hPSC innerhalb von ca. 3,5 Wochen. Hornhaut-Epithel von der Oberfläche Ektoderm29entwickelt, soll der erste Schritt des Protokolls Lenkung hPSCs gegenüber dieser Linie. Eine kurze 24 h Induktion mit Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β)-Antagonist SB-505124 und bFGF werden verwendet, um ektodermalen Differenzierung, gefolgt von 48 h mesodermalen BMP-4 C...

Die durchsichtige Hornhaut an der Augenoberfläche ermöglicht Licht in die Netzhaut und die Mehrheit der Brechkraft des Auges. Die äußerste Schicht, die geschichtete Hornhaut-Epithel wird kontinuierlich vom limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) regeneriert. Die LESCs befinden sich in der basalen Schicht der limbischen Nischen an der Corneoscleral Kreuzung1,2. LESCs fehlen spezifische und einzigartige Marker, so dass ihre Identifikation eine umfassendere Analyse eines Satzes von vermeintlichen Marker erfordert. Epitheliale Transkription Faktor p63 und vor allem N-Terminal verkürzten Abschrift der alpha Isoform von p63 (ΔNp63α), wurde vorgeschlagen, als eine entsprechende positive LESC Marker3,4. Asymmetrische Teilung der LESCs ermöglicht es ihnen, selbst zu erneuern, sondern auch produzieren nachkommen, die centripetally und anterior zu migrieren. Wie die Zellen die Fortschritte in Richtung der Hornhautoberfläche sie allmählich verlieren ihre Stemness und schließlich unheilbar differenzieren zu oberflächlichen Plattenepithelzellen, die kontinuierlich von der Hornhautoberfläche verloren gehen.
Schäden die Hornhautschichten kann zu schweren Sehbehinderungen führen und Hornhaut Mängel sind somit eine der häufigsten Todesursachen weltweit Verlust der Sehkraft. Im limbischen Stammzell-Mangel (LSCD) ist der Limbus zerstört, durch Krankheit oder Trauma führt zu Conjunctivalization und getrübten der Hornhautoberfläche und folgenden Verlust von Vision5,6. Handy-Ersatz-Therapie mit autologen oder allogenen limbisches Transplantate bietet eine Behandlungsstrategie für Patienten mit LSCD4,7,8,9. Jedoch Ernte autologe Transplantate birgt ein Risiko von Komplikationen für das gesunde Auge und Spendergewebe ist Mangelware. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), spezifisch humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), kann als eine unbegrenzte Quelle von klinisch relevante Zelltypen, einschließlich der Hornhaut Epithelzellen dienen. HPSC abgeleitet LESCs (hPSC-LESCs) stellen daher eine attraktive neue Zelle Quelle für okuläre Zellersatztherapie.
Bisher haben die undifferenzierte hPSC Kulturmethoden und ihrer Differenzierung Protokolle zum LESCs über den Einsatz von undefinierten Feeder-Zellen, tierischen Seren, konditionierte Medien oder amniotic Membranen10,11, verlassen 12 , 13 , 14 , 15. vor kurzem Bemühungen in Richtung sicherer Zelle Therapie Produkte haben dazu veranlasst, die Suche nach mehr standardisierte und Xeno-freie Kultur und Differenzierung-Protokolle. Infolgedessen sind mehrere definierte und Xeno-freie Methoden für langfristige Kultur der undifferenzierten hPSCs jetzt handelsüblichen16,17,18. Als ein Kontinuum, gezielte Differenzierung, die Protokolle unter Berufung auf molekulare Signale zu hPSCs Hornhaut epithelialen Schicksal führen in letzter Zeit haben19,20,21,22eingeführt, 23. Doch verwendet viele dieser Protokolle entweder nicht definiert, Feeder-basierte hPSCs als ab Material oder komplexe, xenogene Wachstumsfaktor Cocktails zur Differenzierung.
Dieses Protokoll soll eine robuste, optimierte, Xeno bieten- und Feeder-freie hPSC Kultur-Methode und anschließende Differenzierung zu Hornhaut LESCs. Monolayer Kultur der pluripotenten hPSCs auf Laminin-521 (LN-521) Matrix in definierten, Albumin-freie hPSC Medium (speziell wichtig 8 Flex) ermöglicht schnelle Herstellung von homogenen Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Danach führt eine einfache zweistufige Differenzierungsstrategie hPSCs in Richtung Oberfläche ektodermalen Schicksal in der Schwebe, gefolgt von anhaftenden Differenzierung zu LESCs. Eine Zellpopulation wo express > 65 % ΔNp63α wird innerhalb von 24 Tagen gewonnen. Das Xeno und Feeder-frei-Protokoll wurde mit mehreren hPSC Linien (hESC und HiPSCs), ohne jede Anforderung für Zelle Linie gezielte Optimierung getestet. Die Protokolle für Wochenende-freie Wartung, Passagierung, Cryostoring und hPSC LESC Phänotypisierung hier beschriebenen ermöglichen die Produktion von Großserien von qualitativ hochwertigen LESCs für klinische oder wissenschaftliche Zwecke.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) sind verantwortlich für das Hornhaut-Epithel kontinuierlich erneuert und damit die Aufrechterhaltung Hornhaut Homöostase und visuelle Klarheit. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete LESCs bieten eine viel versprechende Zelle Quelle für Hornhaut Zellersatztherapie. Undefiniert, xenogene Kultur und Differenzierung Bedingungen verursachen Variation in Forschungsergebnisse und behindern die klinische Übersetzung hPSC abgeleitet Therapeutika. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und effiziente Methode für hPSC LESC Differenzierung unter Xeno und Feeder zellfreie Bedingungen. Erstens dient Monolayer Kultur der undifferenzierten hPSC auf rekombinante Laminin-521 (LN-521) und definierte hPSC Medium als Grundlage für stabile Produktion von qualitativ hochwertige Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Zweitens ergibt eine schnelle und einfache hPSC LESC Differenzierung Methode LESC Populationen in nur 24 Tagen. Diese Methode beinhaltet eine viertägige Oberfläche ektodermalen Induktion in der Schwebe mit kleinen Molekülen, gefolgt von anhaftenden Kultur Phase auf LN-521/Kollagen IV Kombination Matrix in definierten Hornhaut epithelialen Differenzierung Medium. Cryostoring und erweiterte Differenzierung weiter reinigt die Zellpopulation und Banken der Zellen in großen Mengen für Zelle Therapie Produkte ermöglicht. Die daraus resultierende qualitativ hochwertige hPSC-LESCs bieten eine potenzielle neue Behandlungsstrategie für Hornhaut Flächenrückführung, limbisches Stammzell-Mangel (LSCD) zu behandeln.

Von hPSCs, hPSC-LESCs
Der gesamte Prozess von Induktion Differenzierung der FF hPSCs, Cryostoring hPSC-LESCs dauert ca. 3,5 Wochen. Schematische Übersicht über die Differenzierung-Methode, die Hervorhebung der wichtigsten Schritte ist in Figur 1Apräsentiert. Abbildung 1 b zeigt typische Morphologien der Zell-Populationen in verschiedenen Phasen des Protokolls. Die vorge...

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Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Dieses Protokoll führte eine definierte zellfreie Methode zur Differenzierung von kornealen limbalen Epithelstammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen ein. Limbalepitheliale Stammzellen sind verantwortlich für die Erneuerung des Hornhautepithels im gesunden Auge. Schäden an diesen Zellen führen zu einem Zustand, der als limbaler Stammzellmangel bekannt ist, und zum Verlust der Hornhautklarheit.Die hier gezeigten Zellkulturmethoden ermöglichen eine effiziente Produktion von limbalepitheliaalen Stammzellen für zukünftige Hornhautzellersatztherapien. Um die im Textprotokoll beschriebene zu beginnen, zu durchgehen und zu pflegen, wird die zubringerfreie menschliche pluripotente Stammzellkultur beibehalten. Achten Sie darauf, nur hochwertige menschliche pluripotente Stammzellen als Ausgangsmaterial für Differenzierungen zu verwenden.Wenn Sie bereit sind, die embryoide Körperbildung zu induzieren, wärmen Sie alle benötigten Materialien und Reagenzien auf Raumtemperatur in einer laminaren Strömungshaube. Lösen Sie den Feeder freie menschliche pluripotente Stammzellen auf die Suspension, indem Sie 500 Mikroliter xeno freies Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzufügen. Eine Inkubation bei 37 Grad Celsius, mit 5% CO2.Entfernen Sie nach drei Minuten die Zellen aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Zellmorphologie, um die optimale Phase für die Trypsinentfernung zu bestimmen. Beobachten Sie die Zellen sorgfältig, um die optimale Zeit zu bestimmen, um den xeno freien Tryspin EDTA zu entfernen, wenn die Zellen aufgerundet haben, aber nicht vollständig abgetrennt haben. Zum optimalen Zeitpunkt entfernen Sie die xeno freie Trypsin EDTA aus den Zellen.Fügen Sie definierte Trypsin-Inhibitor und sanft Pipette, um die Zellen zu lösen. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 300g für fünf Minuten.Entfernen Sie dann den Überstand, und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Kulturmedium wieder aus. Nach dem Zählen der Zellen, verteilen Sie zwei bis drei Millionen Zellen in drei Milliliter nbisceinem Induktionsmedium, ergänzt mit fünf mikromolaren Blebbistatin, an jeden Brunnen einer niedrigen Aufsatz-Sechs-Well-Platte. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 inkubieren.Überprüfen Sie am nächsten Tag die Qualität der embryoiden Körper unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Medium, und ersetzen Sie es durch drei Milliliter Basalinduktionsmedium ergänzt mit 10 Mikromolar SB-505124 und 50 Nanogramm pro Milliliter des menschlichen Basis-Glasfaser-Wachstumsfaktors. Bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 weiter inkubieren.Entfernen Sie in den folgenden zwei Tagen das Medium und ersetzen Sie es durch drei Milliliter Basalinduktionsmedium, ergänzt durch 25 Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein vier. Fahren Sie dann mit den vorherigen Bedingungen fort. Am vierten Tag eine Mischung aus 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter Laminin-521 und fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter menschlichem Plazentakollagen Typ 4 zubereiten, verdünnt in DPBS, die Kalzium zwei und Magnesium zwei Ionen enthalten.Mit dieser Mischung beschichten Sie die 100 Millimeter Gewebekulturschalen zur haftenden Differenzierung im Gesamtbeschichtungsvolumen von fünf Millilitern pro Schale. Versiegeln Sie die Teller und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius über Nacht. Am fünften Tag alle benötigten Materialien und Reagenzien in einer laminaren Durchflusshaube auf Raumtemperatur erwärmen.Danach entfernen Sie die Beschichtungslösung und fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes Differenzierungsmedium zu jeder Schale hinzu. Mit einer Pipette die embryoiden Körper von einer einzigen Platte gut über zwei bis drei Gewebekulturgerichte übertragen. Dann schütteln Sie vorsichtig jedes Kulturgericht, um die embryonalen Körper gleichmäßig zu verteilen.Halten Sie die Zellen in der anhaftenden Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 für die nächsten zweieinhalb bis drei Wochen, stellen Sie sicher, das Medium durch 10 Milliliter frische Differenzierung Medium dreimal pro Woche zu ersetzen. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop, um die Zellen regelmäßig auf die Entstehung einer korrekten Epithelmorphologie zu überprüfen. Zunächst sollten alle benötigten Materialien und Reagenzien in einer laminaren Durchflusshaube auf Raumtemperatur vorgewärmt werden, mit Ausnahme des Kryokonservierungsmediums, das vorgekühlt werden sollte.Als nächstes lösen Sie die menschliche pluripotente Stammzelle abgeleitet elimbal epitheliale Stammzellen zu einzelzellierSuspension durch Zugabe von xeno freien Trypsin EDTA und Inkubation bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2. Entfernen Sie nach fünf Minuten die Zellen aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Zellmorphologie, um die optimale Phase für die Trypsinentfernung zu bestimmen. Beobachten Sie die Zellen sorgfältig, um die optimale Zeit zu bestimmen, um die xeno freie Trypsin EDTA zu entfernen, wenn die Zellen aufgerundet haben, aber nicht vollständig abgetrennt haben.Entfernen Sie zum optimalen Zeitpunkt die xenofreie Trypsin-EDTA aus den Zellen, und lösen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben. Nach dem Zählen der Zellen zentrieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300g. Das Medium ansaugen und die Zellen in vorgekühltem xeno freiem Kryokonservierungsmedium wieder aussetzen.Mit einer Pipette die einzellige Suspension in Kryoröhren übertragen, so dass jedes Kryorohr zwischen 500.000 und einer Million Zellen in einem Milliliter Kryokonservierungsmedium enthält. Legen Sie die Rohre in einen Gefrierbehälter. Innerhalb von fünf Minuten, übertragen Sie sie in einen Gefrierschrank bei negativen 80 Grad Celsius für die Nachtlagerung.Am nächsten Tag die Rohre zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff übertragen. Vor dem Auftauen der Zellen alle benötigten Geschirre und Tellerbrunnen mit einer Mischung aus fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter menschlichem Plazentakollagen Typ vier und 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter LM-521 beschichten und alle benötigten Materialien und Reagenzien auf Raumtemperatur in der laminaren Strömungshaube vorwärmen. Als nächstes entfernen Sie die Beschichtungslösung aus den Tellern und Tellerbrunnen und fügen Sie das entsprechende Volumen des vorgewärmten Differenzierungsmediums hinzu.Fügen Sie ein vorgewärmtes Differenzierungsmedium zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu. Tauen Sie die Zellen schnell auf Raumtemperatur. Nach dem Auftauen die Zellsuspension sofort in das konische Zentrifugenrohr übertragen.Zentrifuge bei 300g für fünf Minuten. Saugen Sie das Medium, und setzen Sie das Zellpellet in Differenzierungsmedium, um jedes Kryokonservierungsmedium zu entfernen. Die Zellen in Differenzierungsmedium mit einer Dichte von 40 000 bis 50 000 Zellen pro Quadratzentimeter auf vorbeschichtete Schalen aufteilen.Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2, ersetzen Sie das Differenzierungsmedium dreimal pro Woche. Bei Laminin-521 bilden die undifferenzierten, hochwertigen, pluripotenten Stammzellen zunächst unterschiedliche Kolonien mit scharfen Kanten, die bei zusammenfließen. Das Kultivieren in einem basalen Induktionsmedium, ergänzt durch fünf Mikromolar-Blebbistatin für 24 Stunden, erzeugt in der Regel eine Suspension von engen, regelmäßigen embryoiden Körpern unterschiedlicher Größe, während sich die embryoiden Körpermorphologie während der ektodermalen Oberflächeninduktion in der Suspension nicht dramatisch ändern sollte, das koloniale Auswuchs tritt bald nach der Präzisierung der embryoiden Körper auf die Kollagen-Typ-4 und die Laminin-521-Kombination in der Differenzierungs-Kombination.Innerhalb von 21 bis 25 Tagen nach der Differenzierung bilden die Zellen konfluente homogene Schichten mit polygonaler Morphologie, die typisch für Epithelzellen ist. Die Zellen können dann kryo für die spätere Verwendung gespeichert werden, da Lebensfähigkeit und Morphologie nach dem Auftauen gut erhalten sind. Am 24. Tag der Differenzierung exprimierte die überwiegende Mehrheit der Zellen gepaartes Boxprotein, PAX6, den wichtigsten Regulator der Augenentwicklung, sowie p63 alpha, den weithin anerkannten LESC-Marker.Delta Np63 wird in den meisten p63 alpha-positiven Zellen koexprimiert und bestätigt den hornartartreichsten Delta-Np63-Alpha-positiven Zellphänotyp. Andere Marker werden teilweise exprimiert, während andere an dieser Stelle nicht nachweisbar sind, was darauf hindeutet, dass die Differenzierung in Richtung der einpotenten limbalen Epitheliden-Vorläufer fortschritten, aber die terminale Differenzierung in reife Hornhautepithelzellen ist noch nicht eingetreten. Im Durchschnitt erzeugt jede undifferenzierte Feederfreie menschliche pluripotente Stammzelle 0,7 Zellen pro Tag 25.Mindestens 65%Delta Np63 alpha positive Zellpopulation kann bis Tag 24 erwartet werden. Die Kryokonservierung reinigt die Zellpopulation weiter. Insgesamt sind die hier vorgestellten Methoden relativ einfach, aber es gibt einige kritische Punkte für den Erfolg.Eine hohe Qualität des Ausgangsmaterials ist ebenso wichtig wie schonende, fließende Zellkulturtechniken im Allgemeinen. Dieses Protokoll bietet robuste Mittel zur Herstellung von limbalepitheliaalen Stammzellen für klinische Anwendungen sowie für verschiedene Forschungszwecke. Darüber hinaus kann die Methode leicht zur Differenzierung von retinalen Pigmentepithelzellen modifiziert werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Transiente Behandlung von humanen pluripotenten Stammzellen mit DMSO zur Förderung der Differenzierung

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...