Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Lo studio è stato sostenuto dell'Accademia di Finlandia (concessione numero 297886), il programma di pezzi di ricambio umani di Tekes, l'agenzia finlandese di finanziamento per la tecnologia e l'innovazione, l'occhio finlandese e Tissue Bank Foundation e la Fondazione culturale finlandese. Gli autori ringraziano i tecnici di laboratorio biomedico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä per assistenza tecnica eccellente e contributo alla coltura delle cellule. Professor Katriina albanese è riconosciuto per fornire il hiPSC linea utilizzata e BioMediTech Imaging Core facility per la fornitura di apparecchiature per l'imaging di fluorescenza.

Università di Tampere ha l'approvazione dell'autorità nazionale per gli affari medicolegali Finlandia (Dnro 1426/32/300/05) per condurre una ricerca sugli embrioni umani. L'Istituto ha anche dichiarazioni di sostegno del comitato etico del quartiere ospedaliero Pirkanmaa derivare, cultura, e differenziare le linee di hESC (Skottman/R05116) e di utilizzare linee hiPSC nella ricerca oftalmica (Skottman/R14023). Nessun nuove linee di cellule sono state derivate per questo studio.
Nota: Il proto...

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	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology,+disease+and+treatment.">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. 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A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Il risultato previsto del presente protocollo è la generazione robusta e di successo di LESCs da una sospensione unicellulare di FF hPSC entro circa 3,5 settimane. Come epitelio corneale si sviluppa dalla superficie ectoderma29, il primo passo del protocollo mira a sterzo hPSCs verso questo lignaggio. Un'induzione di breve 24h con trasformazione di fattore di sviluppo beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF sono utilizzati per indurre la differenziazione ectodermica, seguita da spunto di BMP-4...

La cornea trasparente sulla superficie oculare permette alla luce di entrare la retina e fornisce la maggior parte del potere refrattivo dell'occhio. Lo strato più esterno, l'epitelio cornea stratificato, è continuamente rigenerato con le cellule staminali epiteliali limbal (LESCs). Il LESCs risiedono nello strato basale delle nicchie limbal al corneoscleral giunzione1,2. LESCs mancano marcatori specifici e unici, quindi la loro identificazione richiede un'analisi più ampia di una serie di markers putativi. P63 di fattore di trascrizione epiteliale e soprattutto N-terminalmente troncato trascrizione dell'isoforma alfa di p63 (ΔNp63α), è stato proposto come un rilevante positivo LESC segnapunti3,4. Divisione asimmetrica di LESCs permette loro di auto-rinnovarsi, ma anche produrre progenie che migrano centripeto e anteriormente. Come le cellule procede verso la superficie cornea hanno gradualmente perdere loro staminalità e infine terminalmente differenziare a cellule squamose superficiali che vengono continuamente perse dalla superficie cornea.
Danno ad uno qualsiasi degli strati corneali può portare a grave deficit visivo, e i difetti corneali sono dunque una delle principali cause di perdita di visione in tutto il mondo. Nella mancanza limbal della cellula formativa (LSCD), il limbus è distrutto da malattia o trauma che porta a conjunctivalization e opacizzazione della superficie corneale e la conseguente perdita di visione5,6. Terapia di sostituzione cellulare usando gli innesti limbal autologhi o allogenici offre una strategia di trattamento per i pazienti con LSCD4,7,8,9. Tuttavia, raccolta innesti autologhi sopporta un rischio di complicazioni per l'occhio sano e tessuto erogatore scarseggia. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), in particolare cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), può servire come una fonte illimitata di cellule clinicamente rilevanti, comprese quelle cellule epiteliali corneali. HPSC-derivato LESCs (hPSC-LESCs) rappresentano quindi una fonte interessante di cellulare nuovo per terapia sostitutiva delle cellule oculari.
Tradizionalmente, sia i metodi di coltura hPSC indifferenziato ed i loro protocolli di differenziazione di LESCs hanno fatto affidamento sull'uso di cellule di alimentatore indefinito, sieri animali, terreni condizionati o membrane amniotiche10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, gli sforzi verso prodotti di terapia cellulare più sicuri hanno spinto alla ricerca di più protocolli standardizzati e xeno-libero Cultura e differenziazione. Di conseguenza, diversi metodi definiti e privo di xeno per coltura a lungo termine di hPSCs indifferenziato ora sono commercialmente disponibili16,17,18. Come un continuum, differenziazione diretto protocolli basandosi su indizi molecolare per guidare l'hPSCs al destino epiteliale cornea sono stati recentemente introdotti19,20,21,22, 23. Ancora molti di questi protocolli utilizzati entrambi hPSCs alimentatore basata indefinita, come materiale, o fattore di crescita del complesso, xenogeniche cocktail per differenziazione di partenza.
Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un robusto, ottimizzato, xeno- e metodo di coltura hPSC privo di alimentatore e successiva differenziazione di LESCs corneale. Cultura dello strato monomolecolare di pluripotent hPSCs il laminin-521 (LN-521) matrice in mezzo hPSC definito, privo di albumina (in particolare essenziale 8 Flex) permette la rapida produzione di materiale omogeneo partenza per differenziazioni. Da allora in poi una semplice strategia di differenziazione in due fasi guide hPSCs verso la superficie ectodermico destino in sospensione, seguita da differenziazione aderente a LESCs. Una popolazione di cellule dove > 65% express ΔNp63α è ottenuta entro 24 giorni. Il protocollo privo di xeno e alimentatore è stato testato con diverse linee di hPSC (hESC e hiPSCs), senza alcun requisito per ottimizzazione specifica cella linea. I protocolli per il week-end senza manutenzione, passaggio, cryostoring e hPSC-LESC phenotyping qui descritte consentono la produzione di grandi lotti di LESCs di alta qualità per cliniche o scopi di ricerca.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Le cellule staminali epiteliali limbal corneale (LESCs) sono responsabili per rinnovare continuamente l'epitelio corneale e mantenendo così l'omeostasi cornea e la chiarezza visiva. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-derivata LESCs forniscono una promettente fonte di cellule per terapia sostitutiva delle cellule corneali. Indefinito, xenogeniche cultura e differenziazione condizioni causano variazione nei risultati di ricerca e ostacolano la traslazione clinica terapeutica hPSC-derivato. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile ed efficiente per il differenziamento di hPSC-LESC in condizioni senza cellula xeno - e alimentatore. In primo luogo, cultura dello strato monomolecolare di hPSC indifferenziato il ricombinante laminin-521 (LN-521) e definito hPSC medio costituisce la base per la produzione di robusta di alta qualità materiale di partenza per differenziazioni. In secondo luogo, un metodo di differenziazione rapida e semplice hPSC-LESC produce popolazioni LESC in soli 24 giorni. Questo metodo include un'induzione superficie ectodermica di quattro giorni in sospensione con piccole molecole, seguita dalla fase di coltura aderente sulla matrice di combinazione di LN-521/collagene IV nel mezzo di differenziazione epiteliale corneale definiti. Cryostoring e differenziazione estesa ulteriormente purifica la popolazione delle cellule e consente bancari delle cellule in grande quantità per i prodotti di terapia cellulare. La risultante hPSC-LESCs di alta qualità forniscono una potenziale strategia di trattamento novello per la ricostruzione della superficie corneale per il trattamento di mancanza limbal della cellula formativa (LSCD).

Da hPSCs a hPSC-LESCs
L'intero processo dall'induzione della differenziazione di hPSCs FF a cryostoring hPSC-LESCs prende circa 3,5 settimane. Descrizione schematica del metodo differenziazione evidenziando i passi chiavi è presentato in Figura 1A. Figura 1B Mostra morfologie tipiche delle popolazioni di cellule in diverse fasi del protocollo. I dati presentati sono otten...

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Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Questo protocollo ha introdotto un metodo definito privo di cellule feeder per differenziare le cellule staminali epiteliali limbali corneali dalle cellule staminali pluripotenti umane. Le cellule staminali epiteliali limbali sono responsabili del rinnovo dell'epiteliale corneale nell'occhio sano. Il danno a queste cellule porta a una condizione nota come carenza di cellule staminali limbali e alla perdita di chiarezza corneale.I metodi di coltura cellulare qui mostrati consentono una produzione efficiente di cellule staminali epiteliali limbali per future terapie sostitutive delle cellule corneali. Per iniziare, passare e mantenere l'alimentatore libero coltura di cellule staminali pluripotenti umane come delineato nel protocollo di testo. Assicurarsi di utilizzare solo cellule staminali pluripotenti umane di alta qualità come materia prima per le differenziazioni.Quando è pronto a indurre la formazione del corpo embrionale, riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare. Staccare le cellule staminali pluripotenti umane libere dall'alimentatore alla sospensione aggiungendo 500 microlitri di EDTA di tripina senza xeno ad ogni pozzo. Un'incubazione a 37 gradi Celsius, con 5%CO2.Dopo tre minuti, rimuovere le cellule dall'incubatore e controllare la morfologia cellulare per determinare la fase ottimale per la rimozione della tripina. Osservare attentamente le cellule per determinare il tempo ottimale per rimuovere l'EDTA tryspin senza xeno, quando le cellule si sono arrotondate per eccesso, ma non si sono staccate completamente. Al momento ottimale, rimuovere l'EDTA di tripina senza xeno dalle cellule.Aggiungere l'inibitore della tripside definita e pipettare delicatamente per staccare le cellule. Raccogliere la sospensione a cella singola in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Centrifuga a 300g per cinque minuti.Quindi, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura. Dopo aver contato le cellule, distribuire da due a tre milioni di cellule in tre millilitri di mezzo di induzione basale integrati con cinque blebbistatina micromolare ad ogni pozzo di un basso attacco sei piastre di pozzo. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.Il giorno dopo, controlla la qualità dei corpi embrioidi al microscopio. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con tre millilitri di mezzo di induzione basale integrati con 10 micromolari SB-505124 e 50 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita umano di base in fibra di vetro. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.I due giorni seguenti, rimuovere il mezzo e sostituirlo con tre millilitri di mezzo di induzione basale, integrati con 25 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro. Quindi, continua l'incubazione usando le condizioni precedenti. Il quarto giorno, preparare una miscela di 0,5 microgrammi per centimetro quadrato di Laminin-521 e cinque microgrammi per centimetro quadrato di collagene placentare umano di tipo quattro, diluito in DPBS contenente calcio due e magnesio due ioni.Utilizzando questa miscela, rivestire i piatti di coltura tissutale da 100 millimetri per una differenziazione aderente nel volume totale del rivestimento di cinque millilitri per piatto. Sigillare i piatti e conservarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Il quinto giorno, riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare.Successivamente, rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 10 millilitri di mezzo di differenziazione pre-riscaldato ad ogni piatto. Utilizzando una pipetta, trasferire i corpi embrionale da un singolo piatto ben attraverso due o tre piatti di coltura tissutale. Quindi, scuoti delicatamente ogni piatto di coltura per distribuire uniformemente i corpi embrioidi.Mantenere le cellule in coltura aderente a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per le prossime due settimane e mezzo o tre settimane, assicurandosi di sostituire il mezzo con 10 millilitri di mezzo di differenziazione fresco tre volte a settimana. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase per controllare regolarmente le cellule per l'emergere di una corretta morfologia epiteliale. Per iniziare, pre-riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa di flusso laminare, ad eccezione del mezzo di crioconservazione, che dovrebbe essere pre-refrigerato.Successivamente, staccare le cellule staminali epiteliali limbali derivate dalla cellula pluripotente umana alla sospensione a singola cellula aggiungendo EDTA di tripina senza xeno e incubando a 37 gradi Celsius con il 5%CO2. Dopo cinque minuti, rimuovere le cellule dall'incubatore e controllare la morfologia cellulare per determinare la fase ottimale per la rimozione della tripina. Osservare attentamente le cellule per determinare il tempo ottimale per rimuovere l'EDTA di tripina senza xeno, quando le cellule si sono arrotondate per eccesso, ma non si sono staccate completamente.Nel momento ottimale, rimuovere l'EDTA di tripina senza xeno dalle cellule e staccare le cellule come descritto in precedenza. Dopo aver contato le cellule, centrifugarle a 300 g per cinque minuti. Aspirare il mezzo e rimorsipare le cellule in mezzo di crioconservazione senza xeno pre-refrigerato.Utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione a cella singola in criotubi in modo che ogni criotubo contenga da 500.000 a un milione di cellule in un millilitro di mezzo di crioconservazione. Posizionare i tubi in un contenitore di congelamento. Entro cinque minuti, trasferirli in un congelatore a -80 gradi Celsius per la conservazione notturna.Il giorno successivo, trasferire i tubi in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine. Prima di scongelare le cellule, rivestire tutti i piatti e i pozzi di piastra necessari con una miscela di cinque microgrammi per centimetro quadrato di collagene placentare umano di tipo quattro e 0,5 microgrammi per centimetro quadrato di LM-521 e pre-riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente nel cappuccio di flusso laminare. Successivamente, rimuovere la soluzione di rivestimento dai piatti e dai pozzali di piastra e aggiungere il volume appropriato del mezzo di differenziazione preri warmed.Aggiungere il mezzo di differenziazione preri riscaldato a un tubo conico da 15 millilitri. Scongelare rapidamente le cellule a temperatura ambiente. Una volta scongelato, trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo di centrifuga conico.Centrifuga a 300g per cinque minuti. Aspirare il mezzo e rimospendare il pellet cellulare in mezzo di differenziazione per rimuovere qualsiasi mezzo di crioconservazione. Placcare le cellule su piatti prerivestiti in mezzo di differenziazione ad una densità da 40.000 a 50.000 cellule per centimetro quadrato.Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius al 5%CO2, sostituendo il mezzo di differenziazione tre volte a settimana. Su Laminin-521, le cellule staminali pluripotenti umane libere da alimentatore di alta qualità indifferenziate formano prima colonie distinte con spigoli vivi, che si fondono a monostrati omogenei alla confluenza. La coltivazione nel mezzo di induzione basale, integrata con cinque blebbistatina micromolare per 24 ore, produce tipicamente una sospensione di corpi embrionale stretti e regolari di varie dimensioni, mentre la morfologia del corpo embrionale non dovrebbe cambiare drasticamente durante l'induzione ectodermica superficiale in sospensione, la crescita esterna coloniale appare poco dopo che i corpi embrioidi sono placcati sul collagene di tipo quattro e la matrice combinata Laminin-521 nel mezzo di differenziazione.Entro 21-25 giorni dalla differenziazione, le cellule formano strati omogenei confluenti, con morfologia poligonale, che è tipica delle cellule epiteliali. Le cellule possono quindi essere conservate crio immagazzinate per un uso successivo, poiché la vitalità e la morfologia sono ben conservate dopo lo scongelamento. Al giorno 24 della differenziazione, la stragrande maggioranza delle cellule esprimeva proteina box accoppiata, PAX6, il regolatore chiave dello sviluppo oculare, così come p63 alpha, il marcatore LESC ampiamente riconosciuto.Delta Np63 è coespresso nella maggior parte delle cellule alfa positive p63, confermando il fenotipo di cellula alfa positivo delta Np63 più specifico della cornea. Altri marcatori sono espressi in parte, mentre altri non sono rilevabili a questo punto, indicando che la differenziazione è progredita verso i progenitori epiteliali limbali unipotenti, ma la differenziazione terminale in cellule epiteliali corneali mature non si è ancora verificata. In media, ogni cellula staminale pluripotente umana priva di alimentatore indifferenziato genera 0,7 cellule entro il giorno 25.Almeno il 65% delta Np63 popolazione di cellule alfa positive può essere prevista entro il giorno 24. La crioconservazione purifica ulteriormente la popolazione cellulare. Nel complesso, i metodi qui presentati sono relativamente semplici, ma ci sono alcuni punti critici per il successo.L'alta qualità del materiale di partenza è essenziale, così come le tecniche di coltura cellulare dolci e fluenti in generale. Questo protocollo fornisce mezzi robusti per produrre cellule staminali epiteliali limbali per applicazioni cliniche, nonché per vari scopi di ricerca. Inoltre, il metodo può essere facilmente modificato per la differenziazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

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Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

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Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

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Trattamento transitorio delle cellule staminali pluripotenti umane con DMSO per promuovere la differenziazione

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...