Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

연구 기술 및 혁신, 핀란드 (부여 번호 297886)의 아카데미, 인간의 예비 부품 프로그램 Tekes, 핀란드 자금이 체 기구에 의해 지원 되었다 핀란드 눈 및 조직 은행 재단 및 핀란드 문화 재단. 저자는 생물 의학 실험실 기술자를 Outi Melin, 한 나 Pekkanen, 엠마 Vikstedt, 및 Outi Heikkilä 우수한 기술 지원 및 세포 배양에 기여 감사합니다. 교수 카트리나 Aalto-Setälä 형광 이미징 장비를 제공 하 고 사용 하는 hiPSC 라인 BioMediTech 이미징 핵심 시설 제공을 위한 인정 됩니다.

탐 페 레 대학의 인간 배아에 대 한 연구를 수행 하 핀란드 (Dnro 1426/32/300/05) 법의학 담당 국가 기관의 승인이 있다. 연구소는 또한 파생, 문화, 및 hESC 라인 (Skottman/R05116)를 차별화 하 고 안과 연구 (Skottman/R14023)에서 hiPSC 라인을 사용 하는 Pirkanmaa 병원의 윤리 위원회의 지원 문이 있다. 아니 새로운 셀 라인은이 연구에 대 한 파생 되었다.
참고: 설명 프로토콜 기반으로 특정, 상용...

<ol>
	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. 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이 프로토콜의 예상된 결과 성공적이 고 강력한 세대 LESCs의 FF hPSC의 단일 세포 현 탁 액에서 약 3.5 주 이내. 각 막 상피 표면 ectoderm29에서 개발, 프로토콜의 첫 번째 단계는이 혈통으로 hPSCs을 운영 목표로 합니다. 성장 인자 (TGF-β) 베타 길 항 제 SB-505124과 bFGF와 짧은 24 h 유도 세포 표면 ectoderm 향해 밀어 48 h mesodermal BMP-4 큐 다음 ectodermal 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 화학적 ...

안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.
각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각 막 결함은 이렇게 전세계 시각 손실의 주요 원인 중 하나. Limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD)는 limbus 질병 또는 conjunctivalization, 비전5,6의 후속 손실과 각 막 표면의 opacification 외상에 의해 소멸 됩니다. 세포 대체 요법 사용 헌 또는 수용자 limbal 이식 LSCD4,7,,89환자에 대 한 치료 전략을 제공 합니다. 그러나, 그리고 건강 한 눈에 합병증의 위험 곰 수확 자가 이식 기증자 조직 공급 부족 이다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 특히 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 임상 관련 종류의 세포, 각 막 상피 세포를 포함 하 여 무제한 원천이 될 수 있습니다. 따라서, hPSC에서 파생 된 LESCs (hPSC-LESCs) 안구 세포 대체 요법에 대 한 매력적인 새로운 셀 소스를 나타냅니다.
전통적으로, undifferentiated hPSC 문화 메서드 및 LESCs 그들의 분화 프로토콜 정의 되지 않은 피더 세포, 동물 세라, 바른된 미디어 또는 양수 막10,11, 의 사용에 의존 해야 12 , 13 , 14 , 15. 최근, 노력 더 안전한 세포 치료 제품으로 표준화 하 고 이종 문화 및 분화 프로토콜에 대 한 검색 하 라는 메시지가 있다. 그 결과, undifferentiated hPSCs의 장기 문화에 대 한 여러 가지 정의 및 이종 무료 방법을 상용16,,1718지금 있다. 연속체, 각 막 상피 운명에 hPSCs 가이드 분자 신호에 의존 하는 프로토콜은 최근 되었습니다 감독된 차별화 도입19,20,,2122, 23. 아직 이러한 프로토콜의 많은 소재, 또는 차별화에 대 한 복잡 한, xenogeneic 증가율 칵테일을 시작으로 중 정의 되지 않은, 피더 기반으로 hPSCs를 사용.
이 프로토콜의 목적은 제공 하는 강력 하 고, 최적화, 이종 하-급지대 무료 hPSC 문화 방법 및 각 막 LESCs에 후속 차별화. 단층 문화 정의 알 부 민 무료 hPSC 매체 (특히 필수 8 플렉스)에 laminin-521 (LN-521) 매트릭스에 만능 hPSCs의 차별점에 대 한 균질 시작 물자의 급속 한 생산을 허용 한다. 그 후, 간단한 2 단계 차별화 전략 hPSCs 서 스 펜 션, 부착 차별화 LESCs 뒤에 표면 ectodermal 운명 향해 가이드. 24 일 이내 > 65% ΔNp63α를 표현 하는 세포 인구를 얻을 수 있습니다. Xeno 급지대 무료 프로토콜 셀 라인 특정 최적화에 대 한 어떤 요구 든 지 없이 여러 hPSC 라인 (hESCs 및 hiPSCs), 테스트 되었습니다. 주말 무료 유지 보수, 뿌리고, cryostoring 및 hPSC LESC 형질 여기 설명에 대 한 프로토콜 사용에 대 한 높은-품질 LESCs의 큰 배치의 생산 임상 또는 연구 목적.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

상피 각 막 limbal 줄기 세포 (LESCs)는 각 막 상피를 지속적으로 갱신 하 고 따라서 각 막 항상성 및 시각적 선명도 유지 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-각 막 세포 대체 요법에 대 한 유망한 셀 소스를 제공 하는 파생 된 LESCs. 정의 되지 않은, xenogeneic 문화와 차별화 조건 연구 결과에서 변형 원인과 hPSC 유래 치료제의 임상 번역을 방해. 이 프로토콜 hPSC LESC 차별화 이종-및 피더 세포 무료 조건 하에서 재현 하 고 효율적인 방법을 제공합니다. 첫째, 단층 문화 undifferentiated hPSC 재조합 laminin-521 (LN-521)에 정의 된 hPSC 매체의 차별점에 대 한 높은-품질 시작 물자의 강력한 생산 위한 기초 역할을 합니다. 둘째, 신속 하 고 간단한 hPSC LESC 차별화 방법 24 일만에 LESC 인구를 생성합니다. 이 방법은 작은 분자로, 정의 된 각 막 상피 분화 매체에 LN-521/콜라겐 IV 조합 매트릭스에 부착 문화 단계 다음에 4 일간 표면 ectodermal 유도 포함 합니다. Cryostoring와 확장된 차별화 더 세포 인구를 정화 하 고 대량 세포 치료 제품에 대 한 셀의 은행 수 있습니다. 결과 높은 품질 hPSC LESCs 치료 limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD) 각 막 표면 재건을 위한 잠재적인 새로운 치료 전략을 제공 합니다.

HPSC-LESCs에 hPSCs에서
FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs로의 분화 유도에서 전체 프로세스는 약 3.5 주 걸립니다. 그것의 주요 단계를 강조 차별화 방법의 도식 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 그림 1B 는 프로토콜의 여러 단계에서 세포 인구의 일반적인 형태학을 보여줍니다. 제공 된 데이터 Regea08/017 ...

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Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산 가능

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포로부터 각막 사지 상피 줄기 세포를 분화하기 위한 정의된 피더 세포 무료 방법을 도입하였다. 림팔 상피 줄기 세포는 건강한 눈에서 각막 상피를 갱신할 책임이 있습니다. 이 세포에 손상은 사지 줄기 세포 결핍으로 알려져 있는 조건에 지도하고, 각막 선명도의 손실로 이끌어 냅니다.여기에 표시된 세포 배양 방법은 미래의 각막 세포 대체 요법을 위한 사지 상피 줄기 세포의 효율적인 생산을 가능하게 합니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 피더 가 없는 인간 만능 줄기 세포 배양을 통과하고 유지한다. 분화를 위한 시작 재료로 고품질의 인간 만능 줄기 세포만 사용해야 합니다.배아 체형성을 유도할 준비가 되면 필요한 모든 재료와 시약을 라미나르 플로우 후드의 실온으로 데워보세요. 피더 무료 인간 만능 줄기 세포를 각 우물에 xeno 무료 트립신 EDTA 500 마이크로리터를 추가하여 서스펜션에 분리합니다. 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이팅.3분 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 세포 형태를 확인하여 트립신 제거를 위한 최적의 단계를 결정합니다. 세포를 주의 깊게 관찰하여 세포가 반올림되었지만 완전히 분리되지 않은 경우 xeno 무료 tryspin EDTA를 제거하는 최적의 시간을 결정합니다. 최적의 시간에, 세포에서 제노 무료 트립신 EDTA를 제거합니다.정의된 트립신 억제제와 부드럽게 파이펫을 추가하여 세포를 분리합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 단일 세포 현탁액을 수집합니다. 300g의 원심분리기는 5분간.그런 다음, 상체를 제거하고 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 세포를 계산한 후, 5개의 마이크로몰라 블비스타틴으로 보충된 기저 유도 매체의 3밀리리터에 2~300만 개의 세포를 낮은 부착 6웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 하룻밤 사이에 37도에서 5%의 CO2로 배양합니다.다음 날, 현미경의 밑에 태아 바디의 질을 확인합니다. 매체를 제거하고, 인간 기본 유리 섬유 성장 인자의 밀리리터 당 10 마이크로 몰러 SB-505124 및 50 나노그램으로 보충 된 기저 유도 매체의 3 밀리리터로 대체하십시오. 5%의 CO2로 섭씨 37도에서 계속 배양하십시오.다음 이틀, 배지를 제거하고, 뼈 형태 유전학 단백질 4의 밀리리터 당 25 나노 그램으로 보충, 기저 유도 매체의 3 밀리리터로 대체. 그런 다음 이전 조건을 사용하여 인큐베이션을 계속합니다. 4일째에는 라미닌-521의 평방 센티미터당 0.5 마이크로그램과 4형의 1제곱미터당 5마이크로그램을 칼슘 2개와 마그네슘 2개를 함유한 DPBS로 희석한다.이 혼합물을 사용하여 100mm 조직 배양 접시를 코팅하여 접시 당 5 밀리리터의 총 코팅 부피를 억제합니다. 접시를 밀봉하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 5일째에는 필요한 재료와 시약을 라미나르 플로우 후드로 실온으로 데워보실.그 후 코팅 용액을 제거하고 각 접시에 미리 따뜻해지는 분화 매체 10 밀리리터를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 배아 시체를 단일 플레이트에서 2~3개의 조직 배양 접시에 걸쳐 잘 전달합니다. 그런 다음 각 문화 접시를 부드럽게 흔들어 배아 체를 고르게 분배합니다.다음 2~3주 동안 섭씨 37도에서 세포를 5%CO2로 유지하여 배지를 일주일에 3회 신선한 분화 배지10밀리리터로 교체하십시오. 상 대비 현미경을 사용하여 정확한 상피 형태학의 출현을 정기적으로 세포를 확인하십시오. 먼저, 미리 냉각되어야 하는 냉동 보존 매체를 제외하고, 라미나르 유동 후드의 실온에 필요한 모든 재료와 시약을 미리 데우기 위해 미리 데워야 한다.다음으로, 인간 다능성 줄기 세포를 분리하여 제노 프리 트립신 EDTA를 추가하고 5%CO2로 섭씨 37도에서 배양함으로써 단세포 현탁액에 대한 변전성 상피 줄기 세포를 분리한다. 5 분 후, 인큐베이터에서 세포를 제거하고 트립신 제거를위한 최적의 단계를 결정하기 위해 세포 형태를 확인합니다. 세포를 주의 깊게 관찰하여 세포가 반올림되었지만 완전히 분리되지 않은 경우 xeno 무료 트립신 EDTA를 제거하는 최적의 시간을 결정합니다.최적의 시간에, 세포에서 제노 무료 트립신 EDTA를 제거하고, 앞에서 설명한 바와 같이 세포를 분리한다. 세포를 계산한 후 원심분리기는 5분 동안 300g으로 분리합니다. 배지를 흡인시키고, 미리 냉각된 제노 자유 냉동 보존 배지에서 세포를 재분리한다.파이펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 냉동튜브로 전송하여 각 저온 튜브가 냉동 보존 배지의 1 밀리리터에 500, 000에서 백만 개의 세포를 포함하도록 합니다. 튜브를 냉동 용기에 놓습니다. 5분 이내에 하룻밤 동안 섭씨 80도의 냉동고로 옮기면 보관하십시오.다음 날, 장기 저장을 위해 튜브를 액체 질소로 옮깁니다. 세포를 해동하기 전에, LM-521의 평방 센티미터 당 5 마이크로 그램과 LM-521의 평방 센티미터 당 0.5 마이크로 그램의 혼합물로 필요한 모든 요리와 접시 우물을 코팅하고, 라미나르 흐름 후드의 실온에 필요한 모든 재료와 시약을 미리 따뜻하게. 다음으로, 접시 및 플레이트 우물에서 코팅 용액을 제거하고 미리 데워진 분화 매체의 적절한 부피를 추가합니다.15 밀리리터 원모형 튜브에 미리 데워진 분화 매체를 추가합니다. 세포를 실온으로 빠르게 해동합니다. 일단 해동되면, 즉시 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.300g의 원심분리기는 5분간. 배지를 흡인하고, 분화 배지에서 세포 펠릿을 재분리하여 극저온 배지를 제거한다. 세포를 40, 000 ~ 50, 평방 센티미터당 000 셀의 밀도로 분화 배지에서 미리 코팅 된 접시에 접시를 접시.세포를 섭씨 37도에서 5%CO2로 유지하여 분화 매체를 일주일에 세 번 교체한다. Laminin-521에서, 미분화 된 고품질 피더 무료 인간 만능 줄기 세포는 먼저 날카로운 가장자리와 뚜렷한 식민지를 형성, 이는 합류 시 균일 한 단층에 병합. 기저 유도 배지에서 배양, 24시간 동안 5개의 미세몰라 블비스타틴으로 보충된 배아 체형은 전형적으로 다양한 크기의 타이트하고 정기적인 배아 체의 현탁액을 생성하며, 배아 체형태는 현탁액의 표면 이복증 유도 중에 극적으로 변화해서는 안되며, 식민지 외성장은 콜라겐 형 에 판상이 있는 4개의 배아학적 조합에 소판된 직후나타나는 것으로 보인다.분화의 21 에서 25 일 안에, 세포는 상피 세포에 전형적인 다각형 형태와 함께, 응석 균질 층을 형성합니다. 생존력과 형태는 해동 후 잘 보존되기 때문에 세포는 나중에 사용하기 위해 저장될 수 있다. 분화의 24일째에, 세포의 대다수는 쌍이 있는 상자 단백질, PAX6, 눈 발달의 주요 레귤레이터, 뿐 아니라 p63 알파, 널리 인정되는 LESC 마커를 표현했습니다.Delta Np63는 대부분의 p63 알파 양성 셀에서 코표현되어 가장 각막 특이적 델타 Np63 알파 양성 세포 표현형을 확인한다. 다른 마커는 부분적으로 발현되고, 다른 마커는 부분적으로 발현되고, 다른 마커는 이 시점에서 검출할 수 없는 반면, 단호성 사지 상피 전월체쪽으로 분화가 진행되었음을 나타내지만, 성숙한 각막 상피 세포로의 말단 분화는 아직 발생하지 않았다. 평균적으로, 각각의 미분화 피더 무료 인간 만능 줄기 세포는 25일까지 0.7 세포를 생성한다.적어도 65% 델타 Np63 알파 양성 세포 인구는 24일까지 예상될 수 있습니다. 냉동 보존은 세포 인구를 더욱 정화합니다. 전반적으로 여기에 제시된 방법은 비교적 간단하지만 성공에는 몇 가지 중요한 점이 있습니다.시팅 재료의 높은 품질은 일반적으로 부드럽고 유창한 세포 배양 기술뿐만 아니라 필수적입니다. 이 프로토콜은 임상 응용 프로그램뿐만 아니라 다양한 연구 목적을 위해 사지 상피 줄기 세포를 생산하는 강력한 수단을 제공합니다. 더욱이, 방법은 망막 색소 상피 세포의 분화를 위해 쉽게 변형될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

연구

발생학

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

분화를 촉진하기 위해 DMSO를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포의 일시적인 치료

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...