Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Studien ble støttet av akademiet i Finland (bevilgning nummer 297886), menneskelige reservedeler programmet av Tekes, finsk finansiering Direktoratet for teknologi og innovasjon, finsk øyet og vev Bank Foundation og finske kulturelle Foundation. Forfatterne takker biomedisinsk laboratorium teknikere Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt og Outi Heikkilä utmerket kundestøtte og bidrag til cellekultur. Professor Katriina Aalto-Setälä er anerkjent for å gi hiPSC linjen brukes og BioMediTech Imaging Core anlegget for tilbyr utstyr for fluorescens bildebehandling.

Universitetet i Tammerfors har godkjenning av nasjonal myndighet for Medicolegal saker Finland (Dnro 1426/32/300/05) å gjennomføre forskning på menneskelige embryoer. Instituttet har også støtteerklæringer av etiske komiteen av Pirkanmaa sykehuset å utlede, kultur, og skille hESC linjer (Skottman/R05116) og bruke hiPSC linjer i ophthalmica forskning (Skottman/R14023). Ingen nye linjer var avledet for denne studere.
Merk: Protokollen beskrevet er basert på bestemt, kommersielt tilgjenge...

<ol>
	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology,+disease+and+treatment.">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions.">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li><li>Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+induction+promotes+corneal+epithelial+cell+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).</li><li>Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Forventede resultatet av denne protokollen er vellykkede og robuste generasjon av LESCs fra en enkeltcelle suspensjon av FF hPSC innen ca 3,5 uker. Som corneal epitel utvikler seg fra overflaten ektoderm29, det første trinnet i protokollen tar sikte på styring hPSCs mot denne linjen. En kort 24 h induksjon med transformasjon av vekstfaktor beta (TGF-β) antagonist SB-505124, og bFGF brukes til å indusere ectodermal differensiering, etterfulgt av 48t mesodermal BMP-4 stikkordet å presse cellene...

Gjennomsiktig hornhinnen ved okulær overflaten gjør lyset inn netthinnen og gir fleste øyets refraktiv makt. Det ytterste laget, lagdelt hornhinnen epitel, genereres kontinuerlig av limbal epitel stamceller (LESCs). LESCs ligge i basale laget av limbal nisjene på corneoscleral veikryss1,2. LESCs mangler spesifikke og unike markører, så deres identifikasjon krever en mer omfattende analyse av mulige markører. Epitel transkripsjon faktor p63, og spesielt N-terminalt avkortet utskrift av alpha isoformen av p63 (ΔNp63α), har blitt foreslått som en relevant positiv LESC markør3,4. Asymmetrisk fordeling av LESCs tillater dem til selv-fornye, men også produsere avkom overføre centripetally og peke. Som cellene fremgang mot hornhinnen overflaten de gradvis miste deres stemness og endelig terminalt skille overfladisk squamous celler som er kontinuerlig tapt fra hornhinnen overflaten.
Skade på noen av hornhinnen lagene kan føre til alvorlig synshemming og hornhinnen mangler er dermed en av de viktigste årsakene til synstap over hele verden. I limbal stilk cellen mangel (LSCD), er limbus ødelagt av sykdom eller traumer som fører til conjunctivalization og opacification av hornhinnen overflaten og påfølgende tap av syn5,6. Cellen erstatning terapi bruker autologous eller allogene limbal grafts tilbyr en behandling strategi for pasienter med LSCD4,7,8,9. Men høsting autologous grafts bærer en risiko for komplikasjoner for sunn øyet, og donor vev er en mangelvare. Menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs), spesielt menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), kan tjene som en ubegrenset kilde av klinisk relevante celletyper, inkludert hornhinnen epitelceller. Derfor representerer hPSC-avledet LESCs (hPSC-LESCs) en attraktiv ny cellen kilde for okulær cellen erstatning terapi.
Tradisjonelt har både metodene udifferensierte hPSC kultur og deres differensiering protokoller til LESCs stolt på bruk av udefinert mater celler, dyr sera, betinget media eller amniotic membraner10,11, 12 , 13 , 14 , 15. nylig innsats mot tryggere cellen terapi produkter har bedt om søk etter mer standardisert og xeno-fri kultur og differensiering protokoller. Resultatet er flere definerte og xeno-fri metoder for langsiktig kultur udifferensierte hPSCs nå tilgjengelige16,17,18. Som et kontinuum, rettet differensiering protokollene stole på molekylære signaler å hPSCs hornhinnen epithelial skjebne er nylig introdusert19,20,21,22, 23. Mange av disse protokollene brukt ennå enten udefinert, mater basert hPSCs som starter materiale eller komplekse, xenogeneic vekstfaktor cocktail for differensiering.
Formålet med denne protokollen er å gi en robust, optimalisert, xeno- og mater-fri hPSC kultur metoden og påfølgende differensiering å hornhinnen LESCs. Monolayer kultur pluripotent hPSCs på laminin-521 (LN-521) matrise i definerte, albumin-fri hPSC medium (spesielt viktig 8 Flex) tillater rask produksjon av homogen starter materiale for atskillinger. Etter en enkel, to-trinns Differensieringsstrategi guider hPSCs mot overflaten ectodermal skjebne i suspensjon, etterfulgt av tilhenger differensiering til LESCs. En celle befolkningen der > 65% express ΔNp63α oppnås innen 24 dager. Xeno - og mater-frie protokollen har blitt testet med flere hPSC linjer (både hESCs og hiPSCs), uten noen som helst krav for cellen linje bestemt optimalisering. Protokollene for helgen-free vedlikehold, passaging, cryostoring og hPSC-LESC phenotyping beskrevet her gjør produksjonen av store grupper av høykvalitets LESCs for klinisk eller forskning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Hornhinnen limbal epitel stamceller (LESCs) er ansvarlig for kontinuerlig fornyelse hornhinnen epitel, og dermed opprettholde hornhinnen homeostase og visuell klarhet. Menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede LESCs gi en lovende celle kilde for hornhinnen cellen erstatning terapi. Udefinert, xenogeneic kultur og differensiering betingelser gi variasjoner i forskningsresultater og hindre klinisk oversettelsen av hPSC-avledet therapeutics. Denne protokollen gir en reproduserbar og effektiv metode for hPSC-LESC differensiering under xeno- og mater celle-gratis forhold. Først fungerer monolayer kultur udifferensierte hPSC rekombinant laminin-521 (LN-521) og definerte hPSC medium som grunnlag for robust produksjon av høy kvalitet starter materiale for atskillinger. For det andre, gir en rask og enkel hPSC-LESC differensiering metode LESC bestander i bare 24 dager. Denne metoden inneholder en firedagers overflate ectodermal induksjon i suspensjon med små molekyler, etterfulgt av tilhenger kultur fase på LN-521/kollagen IV kombinasjon matrise i definerte hornhinnen epithelial differensiering medium. Cryostoring og utvidet differensiering ytterligere renser celle befolkningen og lar bank cellene i store mengder for cellen terapi produkter. De resulterende høy kvalitet hPSC-LESCs gir en potensiell ny behandling strategi for hornhinnen surface rekonstruksjon å behandle limbal stamcelleforskningen mangel (LSCD).

Fra hPSCs til hPSC-LESCs
Hele prosessen fra inducing differensiering av FF hPSCs å cryostoring hPSC-LESCs tar rundt 3.5 uker. Skjematisk oversikt over metoden differensiering utheving nøkkel trinnene vises i figur 1A. Figur 1B viser typisk morphologies av celle populasjoner i ulike faser av protokollen. Dataene som presenteres er oppnådd med Regea08/017 hESC og UTA.0460...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller

Denne protokollen introduserer en enkel to-trinns metode for å skille hornhinnen limbal epitel stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller under xeno- og mater celle-fri kultur forhold. Metodene for celle-kultur presenteres her aktivere kostnadseffektive, storskala produksjon av klinisk kvalitet celler gjelder hornhinnen cellen terapi bruk.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Denne protokollen introduserte en definert mater celle gratis metode for differensiering hornhinnen limbal epitel stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller. Limbale epitelstamceller er ansvarlige for å fornye hornhinnen epitel i det sunne øyet. Skade på disse cellene fører til en tilstand kjent som limbal stamcellemangel, og til tap av hornhinnen klarhet.Cellekulturmetodene som vises her muliggjør effektiv produksjon av limbale epitelstamceller for fremtidig hornhinnecelleerstatningsterapi. For å begynne, passasje og vedlikeholde materfri menneskelig pluripotent stamcellekultur som beskrevet i tekstprotokollen. Pass på å bruke bare høy kvalitet menneskelige pluripotente stamceller som startmateriale for differensieringer.Når du er klar til å indusere embryoid kroppsdannelse, varm alle nødvendige materialer og reagenser til romtemperatur i en laminær strømningshette. Løsne materfrie humane pluripotente stamceller til suspensjonen ved å legge til 500 mikroliter xeno gratis trypsin EDTA til hver brønn. En inkubasjon på 37 grader Celsius, med 5% CO2.Etter tre minutter, fjern cellene fra inkubatoren og kontroller cellemorfologien for å bestemme den optimale fasen for trypsinfjerning. Vær forsiktig oppmerksom på cellene for å bestemme den optimale tiden for å fjerne xeno gratis tryspin EDTA, når cellene har rundet opp, men har ikke løsnet helt. På optimal tid, fjern xeno gratis trypsin EDTA fra cellene.Tilsett definert trypsinhemmer og forsiktig pipette for å løsne cellene. Samle enkeltcellesuspensjonen i et 50 milliliter sentrifugerør. Sentrifuge på 300g i fem minutter.Deretter fjerner du det overnaturlige, og gjenbruker cellene i ett milliliter kulturmedium. Etter å ha talt cellene, fordel to til tre millioner celler i tre milliliter basal induksjonsmedium supplert med fem mikromolar blebbistatin til hver brønn av en lav vedlegg seks brønnplate. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5%CO2.Neste dag, sjekk kvaliteten på embryolegemene under et mikroskop. Fjern mediet, og erstatt det med tre milliliter basal induksjonsmedium supplert med 10 mikromos SB-505124 og 50 nanogram per milliliter humant grunnleggende glassfibervekstfaktor. Fortsett å inkubere ved 37 grader Celsius med 5%CO2.De følgende to dagene, fjerne mediet, og erstatte den med tre milliliter basal induksjon medium, supplert med 25 nanogram per milliliter av bein morfogenetisk protein fire. Deretter fortsetter du inkubasjonen ved hjelp av de tidligere forholdene. På dag fire, lag en blanding av 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter laminin-521, og fem mikrogram per kvadratcentimeter av human placenta kollagen type fire, fortynnet i DPBS som inneholder kalsium to og magnesium to ioner.Bruk denne blandingen, belegge 100 millimeter vev kultur retter for tilhenger differensiering i totalt belegg volum på fem milliliter per tallerken. Forsegle platene, og lagre dem på fire grader Celsius over natten. På dag fem varmer du alle nødvendige materialer og reagenser til romtemperatur i en laminær strømningshette.Etter dette fjerner du beleggoppløsningen og legger til 10 milliliter forhåndsoppvarmet differensieringsmedium til hver tallerken. Ved hjelp av en pipette, overfør embryolegemene fra en enkelt plate godt over to til tre vevskulturretter. Deretter rister du forsiktig hver kulturrett for å fordele embryolegemene jevnt.Opprettholde cellene i tilhengerkultur ved 37 grader Celsius med 5% CO2 for de neste to og en halv til tre ukene, og sørg for å erstatte mediet med 10 milliliter frisk differensiering medium tre ganger per uke. Bruk et fasekontrastmikroskop for regelmessig å kontrollere cellene for fremveksten av riktig epitelmorfologi. Til å begynne med varmer du alle nødvendige materialer og reagenser til romtemperatur i en laminær strømningshette, med unntak av kryopreservasjonsmediet, som bør forkjøles.Deretter løsner du den menneskelige pluripotente stamcellen avledet limbale epitelstamceller til enkeltcellesuspensjon ved å legge til xeno fri trypsin EDTA og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% CO2. Etter fem minutter, fjern cellene fra inkubatoren og kontroller cellemorfologien for å bestemme den optimale fasen for trypsinfjerning. Følg nøye cellene for å bestemme den optimale tiden for å fjerne xeno fri trypsin EDTA, når cellene har rundet opp, men har ikke løsnet helt.På optimal tid, fjern xeno gratis trypsin EDTA fra cellene, og koble cellene som beskrevet tidligere. Etter å ha talt cellene, sentrifuger dem på 300g i fem minutter. Aspirer mediet, og resuspend cellene i pre-kjølt xeno gratis kryopreservation medium.Ved hjelp av en pipette, overfør enkeltcellesuspensjonen til kryorør slik at hvert kryorør inneholder mellom 500,000 til en million celler i en milliliter kryopreservasjonsmedium. Plasser rørene i en frysebeholder. Innen fem minutter, overføre dem til en fryser ved negative 80 grader Celsius for overnatting lagring.Neste dag, overfør rørene til flytende nitrogen for langsiktig lagring. Før du tiner cellene, belegge alle nødvendige retter og plate brønner med en blanding av fem mikrogram per kvadratcentimeter menneskelig placenta kollagen type fire, og 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter lm-521, og pre-varm alle nødvendige materialer og reagenser til romtemperatur i laminær strømningshette. Deretter fjerner du beleggoppløsningen fra retter og platebrønner og legger til riktig volum av forhåndsoppvarmet differensieringsmedium.Tilsett forhåndsoppvarmet differensieringsmedium til et 15 milliliter konisk rør. Tin cellene raskt til romtemperatur. Når tint, umiddelbart overføre celle suspensjon til konisk sentrifuge rør.Sentrifuge på 300g i fem minutter. Aspirer mediet, og resuspend cellepellet i differensieringsmedium for å fjerne eventuelle kryopreservasjonsmedium. Plate cellene på precoated retter i differensiering medium med en tetthet på 40,000 til 50, 000 celler per kvadratcentimeter.Opprettholde cellene ved 37 grader Celsius ved 5% CO2, og erstatte differensieringsmediet tre ganger i uken. På Laminin-521 danner de udifferentierte materfrie humane pluripotente stamcellene først forskjellige kolonier med skarpe kanter, som fusjonerer til homogene monolayers ved samløpet. Kultering i basal induksjonsmedium, supplert med fem mikromolar blebbistatin i 24 timer produserer vanligvis en suspensjon av stramme, vanlige embryolegemer av forskjellige størrelser, mens embryoid kroppsmorfologi ikke bør endres dramatisk under overflaten ectodermal induksjon i suspensjon, koloniale utvekst er sett å vises kort tid etter embryoid organer er belagt på kollagen type fire og Laminin-521 kombinasjon matrise i differensiering medium.Innen 21 til 25 dager etter differensiering danner cellene samtidige homogene lag, med polygonal morfologi, som er typisk for epitelceller. Cellene kan deretter kryo lagres for senere bruk, da levedyktighet og morfologi er godt bevart etter tining. På dag 24 av differensiering uttrykte det store flertallet av cellene paret boksprotein, PAX6, den viktigste regulatoren for øyeutvikling, samt p63 alfa, den anerkjente LESC-markøren.Delta Np63 er coexpressed i de fleste p63 alfa positive celler, bekrefter den mest hornhinnen spesifikke delta Np63 alfa positiv celle fenotype. Andre markører uttrykkes delvis, mens andre er umulig å oppdage på dette punktet, noe som indikerer differensiering har utviklet seg mot de unipotente limbale epitelene, men terminaldilateringen til modne hornhinneepitelceller har ennå ikke skjedd. I gjennomsnitt genererer hver udifferensiert materfri menneskelig pluripotente stamcelle 0,7 celler etter dag 25.Minst 65% delta Np63 alfa positiv cellepopulasjon kan forventes innen dag 24. Kryopreservation renser cellepopulasjonen ytterligere. Samlet sett er metodene som presenteres her relativt enkle, men det er noen kritiske punkter til suksess.Høy kvalitet på startmaterialet er viktig, samt milde, flytende cellekulturteknikker generelt. Denne protokollen gir robuste midler til å produsere limbale epitelstamceller for kliniske applikasjoner, så vel som for ulike forskningsformål. Videre kan metoden enkelt endres for differensiering av retinal pigment epitelceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differensiering av pluripotent stamceller til å NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; bukspyttkjertelen stamfedre

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differensiering av menneskelige pluripotent stamceller til trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Transient behandling av humant Pluripotent stamceller med DMSO å fremme differensiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...