Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

O estudo foi apoiado por Academia da Finlândia (número de concessão 297886), o programa de peças humanas de Tekes, o finlandês agência de financiamento para tecnologia e inovação, o olho finlandês e Fundação do banco de tecido e Fundação Cultural finlandesa. Os autores graças os técnicos de laboratório biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä para assistência técnica excelente e contribuição para a cultura de células. Professor Katriina Aalto-Setälä é reconhecido para fornecer a linha de hiPSC usado e facilidade de BioMediTech Imaging Core para fornecendo equipamentos para tratamento de imagens de fluorescência.

Universidade de Tampere tem a aprovação da autoridade nacional para assuntos médico-legal Finlândia (Dnro 1426/32/300/05) para conduzir a investigação em embriões humanos. O Instituto também tem declarações de apoia do Comitê ético do distrito de Hospital de Pirkanmaa derivar, cultura, e diferenciar linhas hESC (Skottman/R05116) e usar linhas de hiPSC em pesquisa oftálmica (Skottman/R14023). Não há novas linhas de célula derivaram-se para este estudo.
Nota: O protocolo descrito...

<ol>
	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. 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A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

O resultado esperado deste protocolo é a geração bem sucedida e robusta de LESCs de uma suspensão de célula única do FF hPSC dentro aproximadamente 3,5 semanas. Como o epitélio corneano se desenvolve a partir do ectoderma de superfície29, o primeiro passo do protocolo visa hPSCs para esta linhagem de direção. Uma indução curto 24 h com a transformação de fator de crescimento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF são utilizados para induzir a diferenciação ectodérmica, seguid...

A córnea transparente na superfície ocular permite que a luz entra na retina e fornece a maioria do poder refrativo do olho. A camada mais externa, o epitélio estratificado da córnea, é continuamente regenerada por estroma de células tronco epiteliais (LESCs). Os LESCs residem na camada basal dos nichos estroma no corneoscleral junção1,2. LESCs falta de marcadores específicos e exclusivos, por sua identificação requer uma análise mais abrangente de um conjunto de marcadores putativos. P63 do fator de transcrição epiteliais e especialmente N-terminal truncada transcreva a isoforma alfa do p63 (ΔNp63α), tem sido proposto como um relevante positivo LESC marcador3,4. Divisão assimétrica de LESCs lhes permite renovar o Self, mas também produzir descendência que migra centripetamente e anteriormente. Como as células de progresso em direção à superfície da córnea eles gradualmente perdem sua stemness e finalmente terminalmente diferenciar superficial de células escamosas que perdem-se continuamente da superfície da córnea.
Danos a qualquer uma das camadas da córnea pode levar à severa deficiência visual, e defeitos corneais são, portanto, uma das principais causas de perda de visão em todo o mundo. Na deficiência de estroma de células estaminais (LSCD), ao limbo é destruído pela doença ou trauma que leva a conjunctivalization e opacificação da superfície da córnea e subsequente perda de visão5,6. Terapia de reposição celular usando enxertos de limbo autólogos ou alogênico oferece uma estratégia de tratamento para pacientes com LSCD4,7,8,9. No entanto, colheita de enxertos autólogos carrega um risco de complicações para o olho saudável, e tecido doador está em falta. Células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), especificamente as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs), pode servir como uma fonte ilimitada de tipos de células clinicamente relevantes, incluindo as células epiteliais da córnea. Portanto, hPSC-derivado LESCs (hPSC-LESCs) representam uma fonte de celular novo atrativo para terapia de reposição celular ocular.
Tradicionalmente, ambos os métodos de cultura hPSC indiferenciadas e seus protocolos de diferenciação para LESCs têm contado com o uso de células alimentador indefinido, soros de animais, mídia condicionadas ou membrana amniótica10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, esforços na direção de produtos de terapia celular mais seguros tem solicitado a procura de mais protocolos padronizados e xeno-livre cultura e diferenciação. Como resultado, vários métodos definidos e xeno-livre para cultura a longo prazo de hPSCs indiferenciadas estão agora comercialmente disponíveis16,17,18. Como um continuum, dirigido diferenciação protocolos confiando em pistas moleculares para orientar a hPSCs ao destino epitelial da córnea foram recentemente introduzidos19,20,21,22, 23. Ainda muitos desses protocolos utilizados ou indefinido, alimentador com base hPSCs como material, ou fator de crescimento do complexo, xenogénica cocktails para diferenciação de partida.
O propósito do presente protocolo é fornecer um robusto, otimizado, xeno- e método de cultura livre de alimentador hPSC e subsequente diferenciação para LESCs da córnea. Cultura de monocamadas de pluripotentes hPSCs na matriz de laminina-521 (LN-521) no meio de hPSC definida, livre de albumina (especificamente essencial Flex 8) permite a rápida produção de matéria-prima homogênea para diferenciações. Depois de um simples, estratégia de diferenciação em duas fases guias hPSCs em direção a superfície ectodérmico destino em suspensão, seguido de diferenciação aderente para LESCs. Uma população de células onde > 65% express ΔNp63α é obtida dentro de 24 dias. O protocolo de xeno alimentador-livre e foi testado com várias linhas de hPSC (hESCs e hiPSCs), sem qualquer exigência de otimização específicas de linha de celular. Os protocolos para fenotipagem de manutenção, passagem, cryostoring e hPSC-LESC livre de fim de semana, aqui descritos permitem a produção de grandes lotes de alta qualidade LESCs para clínicas ou fins de investigação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Corneais estroma epiteliais células-tronco (LESCs) são responsáveis por renovar continuamente o epitélio corneano e mantendo assim a homeostasia corneana e clareza visual. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-LESCs derivadas fornecem uma promissora fonte de células para terapia de reposição de células da córnea. Condições de cultura e diferenciação de indefinido, xenogénicas causam variação nos resultados de pesquisa e impedem a tradução clínica da terapêutica hPSC-derivado. Este protocolo fornece um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hPSC-LESC condições xeno - e alimentador sem célula. Em primeiro lugar, cultura de monocamadas de hPSC indiferenciada na recombinação laminina-521 (LN-521) e médio hPSC definido serve como uma base para a produção de robusta de alta qualidade matéria-prima para diferenciações. Em segundo lugar, um método de diferenciação rápida e simples hPSC-LESC produz populações LESC em apenas 24 dias. Este método inclui uma quatro dias superfície ectodérmica indução em suspensão com pequenas moléculas, seguido por fase de cultura aderente na matriz de combinação LN-521/colagénio IV médio definido diferenciação epitelial da córnea. Cryostoring e diferenciação estendida mais purifica a população celular e permite bancário das células em grandes quantidades de produtos de terapia celular. Os resultantes hPSC-LESCs de alta qualidade fornecem uma potencial estratégia de tratamento romance para reconstrução da superfície da córnea tratar a deficiência de células-tronco limbal (LSCD).

De hPSCs para hPSC-LESCs
Todo o processo de induzir a diferenciação de FF hPSCs para cryostoring hPSC-LESCs leva cerca de 3,5 semanas. Visão esquemática do método de diferenciação, destacando suas etapas-chave é apresentada na figura 1A. A figura 1B mostra morfologias típicas de populações de células em diferentes fases do protocolo. Os dados apresentados são ...

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Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Este protocolo introduziu um método livre de células alimentadores definidos para diferenciar células-tronco epiteliais membros da córnea de células-tronco pluripotentes humanas. As células-tronco epiteliais limbais são responsáveis pela renovação da epitelial córnea no olho saudável. Danos a essas células levam a uma condição conhecida como deficiência de células-tronco limbais, e à perda de clareza corneal.Os métodos de cultura celular aqui mostrados permitem a produção eficiente de células-tronco epiteliais membros para futuras terapias de substituição de células córneas. Para começar, passar e manter o alimentador livre de cultura de células-tronco pluripotentes humanas, conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de usar apenas células-tronco pluripotentes humanas de alta qualidade como material inicial para diferenciações.Quando estiver pronto para induzir a formação do corpo embrionário, aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em uma coifa de fluxo laminar. Desvincule as células-tronco pluripotentes humanas livres para a suspensão adicionando 500 microliters de xeno free trypsin EDTA a cada poço. Uma incubação a 37 graus Celsius, com 5% de CO2.Após três minutos, remova as células da incubadora e verifique a morfologia celular para determinar a fase ideal para a remoção da trippsina. Observe cuidadosamente as células para determinar o momento ideal para remover o EDTA de tentem livre xeno, quando as células tiverem arredondado, mas não se desvincularam completamente. No momento ideal, remova o xenófo livre de trippsina EDTA das células.Adicione o inibidor de trippsina definido e a pipeta suavemente para desprender as células. Colete a suspensão de célula única em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrífuga a 300g por cinco minutos.Em seguida, remova o supernasce, e resuspense as células em um mililitro de meio de cultura. Após a contagem das células, distribua de 2 a 3 milhões de células em três mililitros de meio de indução basal suplementado com cinco blebbistatina micromolar para cada poço de uma placa de seis poços de baixa fixação. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de CO2.No dia seguinte, verifique a qualidade dos corpos embrionários sob um microscópio. Remova o meio e substitua-o por três mililitros de meio de indução basal suplementado com 10 micromolar SB-505124 e 50 nanogramas por mililitro do fator de crescimento de fibra de vidro básico humano. Continue incubando a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Nos dois dias seguintes, remova o meio e substitua-o por três mililitros de meio de indução basal, complementados com 25 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro. Em seguida, continue a incubação usando as condições anteriores. No quarto dia, prepare uma mistura de 0,5 microgramas por centímetro quadrado de Laminin-521, e cinco microgramas por centímetro quadrado de colágeno placentário humano tipo quatro, diluído em DPBS contendo cálcio dois e magnésio dois íons.Usando esta mistura, cubra os pratos de cultura tecidual de 100 milímetros para diferenciação aderente no volume total de revestimento de cinco mililitros por prato. Sele as placas e guarde-as a 4 graus Celsius durante a noite. No quinto dia, aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em um capô de fluxo laminar.Depois disso, retire a solução de revestimento e adicione 10 mililitros de meio de diferenciação pré-aquecido a cada prato. Usando uma pipeta, transfira os corpos embrionários de uma única placa bem em dois ou três pratos de cultura de tecido. Em seguida, agite suavemente cada prato de cultura para distribuir uniformemente os corpos embrionários.Mantenha as células na cultura aderente a 37 graus Celsius com 5% de CO2 pelas próximas duas semanas e meia a três semanas, certificando-se de substituir o meio por 10 mililitros de média de diferenciação fresca três vezes por semana. Use um microscópio de contraste de fase para verificar regularmente as células para o surgimento da morfologia epitelial correta. Para começar, pré-aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em uma coifa de fluxo laminar, exceto para o meio de criopreservação, que deve ser pré-refrigerado.Em seguida, desprende as células-tronco pluripotentes humanas derivadas células-tronco epiteliais para suspensão de célula única adicionando xenófo livre trippsina EDTA e incubando a 37 graus Celsius com 5%DE CO2. Após cinco minutos, remova as células da incubadora e verifique a morfologia celular para determinar a fase ideal para a remoção da trippsina. Observe cuidadosamente as células para determinar o momento ideal para remover o xenófo livre trypsin EDTA, quando as células tiverem arredondado, mas não se desvincularam completamente.No momento ideal, remova o xenófo livre de trippsina EDTA das células, e desprende as células como descrito anteriormente. Depois de contar as células, centrifuá-las a 300g por cinco minutos. Aspire o meio e resuspense as células em meio de criopreservação livre de xeno pré-refrigerado.Usando uma pipeta, transfira a suspensão celular única para tubos criogênicos para que cada crio-tubo contenha entre 500.000 a um milhão de células em um mililitro de meio criopreservador. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento. Dentro de cinco minutos, transfira-os para um congelador a 80 graus Celsius negativos para armazenamento durante a noite.No dia seguinte, transfira os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Antes de descongelar as células, cubra todos os pratos e poços de pratos necessários com uma mistura de cinco microgramas por centímetro quadrado de colágeno placentário humano tipo quatro, e 0,5 microgramas por centímetro quadrado de LM-521, e pré-aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente na capa de fluxo laminar. Em seguida, retire a solução de revestimento dos pratos e poços de pratos e adicione o volume apropriado do meio de diferenciação pré-aquecido.Adicione o meio de diferenciação pré-aquecido a um tubo cônico de 15 mililitros. Descongele as células rapidamente à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, transfira imediatamente a suspensão celular para o tubo de centrífuga cônica.Centrífuga a 300g por cinco minutos. Aspire o meio e resuspense a pelota celular em meio de diferenciação para remover qualquer meio de criopreservação. Coloque as células em pratos pré-revestidos em meio de diferenciação a uma densidade de 40.000 a 50.000 células por centímetro quadrado.Mantenha as células a 37 graus Celsius a 5% de CO2, substituindo o meio de diferenciação três vezes por semana. Em Laminin-521, o alimentador de alta qualidade indiferenciado livre células-tronco pluripotentes humanos primeiro forma colônias distintas com bordas afiadas, que se fundem a monocamadas homogêneas em confluência. Cultivo em meio de indução basal, suplementado com cinco blebbistatina micromolar por 24 horas tipicamente produz uma suspensão de corpos embrióides apertados e regulares de vários tamanhos, enquanto a morfologia corporal embrióide não deve mudar drasticamente durante a indução ectodérmica superficial em suspensão, o crescimento colonial é visto aparecendo logo após os corpos embrióides serem banhados no colágeno tipo quatro e matriz de combinação Laminin-521 em meio de diferenciação.Dentro de 21 a 25 dias de diferenciação, as células formam camadas homogêneas confluentes, com morfologia poligonal, que é típica das células epiteliais. As células podem ser então armazenadas crio armazenadas para uso posterior, pois a viabilidade e a morfologia são bem preservadas após o descongelamento. No dia 24 de diferenciação, a grande maioria das células expressou proteína de caixa emparelhada, PAX6, o principal regulador do desenvolvimento dos olhos, bem como p63 alfa, o marcador LESC amplamente reconhecido.Delta Np63 é coexpresso na maioria das células alfa positivas p63, confirmando o mais específico delta Np63 alfa positivo phenotype. Outros marcadores são expressos em parte, enquanto outros são indetectáveis neste ponto, indicando que a diferenciação progrediu em direção aos progenitores epiteliais pericial unipotentes, mas a diferenciação terminal em células epiteliais córneas maduras ainda não ocorreu. Em média, cada célula-tronco pluripotente humana livre de indiferenciado gera 0,7 células até o dia 25.Pelo menos 65% delta Np63 população de células alfa positivas pode ser esperada até o dia 24. A criopreservação purifica ainda mais a população celular. No geral, os métodos aqui apresentados são relativamente simples, mas há alguns pontos críticos para o sucesso.A alta qualidade do material inicial é essencial, assim como técnicas suaves e fluentes de cultura celular em geral. Este protocolo fornece meios robustos para produzir células-tronco epiteliais membros para aplicações clínicas, bem como para vários fins de pesquisa. Além disso, o método pode ser facilmente modificado para diferenciação de células epiteliais de pigmento retiniano.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Biologia do Desenvolvimento

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...