Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Исследование было поддержано в Академии Финляндии (Грант № 297886), человека запасных частей программа Tekes, Финское агентство финансирования технологий и инноваций, Финский глаз и фонд банка тканей и финский культурный фонд. Авторы благодарят биомедицинских лаборантов Ути Мелин, Ханна Pekkanen, Эмма Vikstedt и Ути Хейккиля отличную техническую помощь и вклад в культуру клеток. Профессор Katriina Аалто-Сетала признается за предоставление hiPSC линии и BioMediTech Imaging основного фонда для предоставления оборудования для флуоресценции изображений.

Университет Тампере имеет одобрение Национального органа для судебно-медицинская дел Финляндии (Dnro 1426/32/300/05) для проведения исследований по человеческих эмбрионов. Институт также имеет поддержку заявления этического Комитета районной больницы Pirkanmaa, культура, и дифференцировать Госк...

<ol>
	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology,+disease+and+treatment.">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions.">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li><li>Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+induction+promotes+corneal+epithelial+cell+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).</li><li>Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Ожидаемый результат этого протокола является успешным и надежным поколения LESCs от одной ячейки приостановления FF hPSC в течение приблизительно 3,5 недель. Как эпителий роговицы развивается от поверхности эктодермы29, первый шаг протокола направлена на рулевое hPSCs к этой линии...

Прозрачной роговицы в глазной поверхности позволяет свету войти сетчатки и предоставляет большинство преломляющей способности глаз. Внешний слой, пробужденные эпителия роговицы, непрерывно регенерируется путем нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs). LESCs находятся в базальный слой послабляющие ниш на Корнеосклеральный перекрестке1,2. LESCs отсутствуют конкретные и уникальные маркеры, поэтому их идентификации требует более широкого анализа ряда putative маркеров. Эпителиальных транскрипционным фактором p63 и особенно N-неизлечимо усеченного Стенограмма альфа изоформы p63 (ΔNp63α), было предложено как соответствующие позитивные LESC маркер3,4. Асимметричным разделением LESCs позволяет им самостоятельно обновить, но и производят потомство, что перенос centripetally и кпереди. Как клетки прогресса к поверхности роговицы, они постепенно теряют свою stemness и наконец неизлечимо дифференцировать в поверхностные клетки плоского эпителия, которые постоянно теряются от поверхности роговицы.
Повреждение в любом из слоев роговицы может привести к тяжелой зрительные нарушения, и дефекты роговицы, таким образом, одной из ведущих причин потери зрения во всем мире. В дефицит нейральные стволовые клетки (LSCD) лимба уничтожается болезнь или травма, которая приводит к conjunctivalization и помутнение роговицы поверхности и последующая утрата зрения5,6. Клеточная терапия замены с помощью аутологичных и аллогенных послабляющие графтов предлагает стратегии лечения для пациентов с LSCD4,,78,9. Однако уборки аутологичных трансплантатов несет риск осложнений для здорового глаза, и донорской ткани не хватает. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), специфически человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), может служить неограниченный источник типов клинически значимых клеток, включая роговицы эпителиальных клеток. Таким образом hPSC производные LESCs (hPSC-LESCs) представляют собой привлекательный новый источник клеток для глазной клеточной терапии замены.
Традиционно недифференцированные hPSC культура методы и их дифференциация протоколы для LESCs полагаются на использование неопределенных фидер клетки, животных сера, кондиционером СМИ или амниотической мембраны10,11, 12 , 13 , 14 , 15. Недавно, усилия в направлении безопасные продукты терапии клеток побудили Поиск более стандартизированных и бесплатная xeno протоколы культуры и дифференциации. В результате несколько определенных и xeno бесплатные методы для долгосрочного культуры недифференцированные hPSCs в настоящее время коммерчески доступных16,17,18. Как континуум, направленного дифференцирования, протоколы, полагаясь на молекулярные сигналы для руководства hPSCs эпителия роговицы судьбы были недавно представил19,,21,20,22, 23. Еще многие из этих протоколов используется либо неопределенным, hPSCs на основе подачи как начиная материал, или комплекс, культивированная фактор роста коктейли для дифференциации.
Этот протокол предназначен для предоставления надежной, оптимизированный, xeno- и фидер свободный hPSC культуры метода и последующего дифференциации роговицы LESCs. Однослойная культуре плюрипотентных hPSCs на Ламинин-521 (LN-521) матрицы в среде определенных, альбумин бесплатные hPSC (в частности основных Flex 8) позволяет быстрое производство однородной исходным материалом для дифференцирования. После простой, двухступенчатый дифференциации стратегия руководства hPSCs к поверхности эктодермы судьба в суспензии, следуют адэрентных дифференциации в LESCs. Популяции клеток, где > 65% Экспресс ΔNp63α получается в течение 24 дней. Xeno - и фидер свободно протокол был протестирован с несколькими линиями hPSC (ЭСК и hiPSCs), без требования для оптимизации конкретной линии клеток. Протоколы для свободной выходные обслуживания, пассированый, cryostoring и hPSC-LESC фенотип, описанные здесь позволяют производство больших серий LESCs высокого качества для клинических или исследовательских целях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Роговицы нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs) несут ответственность за постоянно обновление эпителия роговицы и таким образом поддержание гомеостаза роговицы и четкость. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных LESCs обеспечивают перспективный источник клеток для роговицы клеточной терапии замены. Неопределенным, культивированная культуры и дифференциации условия вызывают различия в результатах исследования и препятствуют клинический перевод hPSC производные терапии. Этот протокол обеспечивает воспроизводимость и эффективный метод для hPSC-LESC дифференциация xeno - и условиях подачи клеток бесплатно. Во-первых монослойном культивировании недифференцированные hPSC на рекомбинатных Ламинин-521 (LN-521) и определено hPSC средне служит основой для надежного производства высокого качества исходного материала для дифференцирования. Во-вторых быстрый и простой hPSC-LESC метод дифференциации дает LESC населения в всего 24 дней. Этот метод включает в себя четыре дня поверхности эктодермы индукции в подвеску с малых молекул, следуют адэрентных культуры фазы LN-521/коллаген IV сочетание матрицы в среде определенных эпителия роговицы дифференциации. Cryostoring и расширенной дифференциация далее очищает популяции клеток и позволяет банковских ячеек в больших количествах для продуктов терапия ячейки. Результате высокого качества hPSC-LESCs обеспечивают потенциальные стратегии Роман лечения для роговицы поверхности реконструкции для лечения дефицита нейральные стволовые клетки (LSCD).

От hPSCs до hPSC-LESCs
Весь процесс от вызывающих дифференциация FF hPSCs для cryostoring hPSC-LESCs занимает около 3,5 недель. Схематический обзор метода дифференциации, подчеркнув его ключевые шаги представлены на рисунке 1A. Рису?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Этот протокол вводит метод простой двухступенчатый для дифференциации роговицы нейральные стволовые клетки эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток xeno - и фидер культуры клеток свободных условиях. Представленные здесь методы культуры клетки позволяют экономически эффективным, крупномасштабного производства клинической качества клеток роговицы клетки терапии применение.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Этот протокол ввел определенный метод фидерных клеток для дифференциации роговицы лимбальных эпителиальных стволовых клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Лимбальные эпителиальные стволовые клетки отвечают за обновление эпителиального роговицы в здоровом глазу. Повреждение этих клеток приводит к состоянию, известному как дефицит лимбальных стволовых клеток, и к потере ясности роговицы.Методы клеточной культуры, показанные здесь, позволяют эффективное производство лимбальных эпителиальных стволовых клеток для будущей заместительной терапии клеток роговицы. Для начала, прохождение и поддержание подачи свободной человеческой плюрипотентной культуры стволовых клеток, как указано в текстовом протоколе. Убедитесь в том, чтобы использовать только высокое качество человеческих плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходного материала для дифференциации.Когда вы будете готовы вызвать образование эмбрионального тела, подогрейте все необходимые материалы и реагенты до комнатной температуры в ламинарной капюшоне потока. Отсоедините фидер свободных человеческих плюрипотентных стволовых клеток к подвеске, добавив 500 микролитров xeno бесплатно трипсина EDTA к каждой хорошо. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию, с 5%CO2.Через три минуты удалите клетки из инкубатора и проверьте морфологию клеток, чтобы определить оптимальную фазу для удаления трипсина. Внимательно наблюдайте за клетками, чтобы определить оптимальное время для удаления xeno free tryspin EDTA, когда клетки округляются, но не отсоединяются полностью. В оптимальное время удалите из клеток ксено свободный трипсин ЭДТА.Добавьте определенный ингибитор трипсина и аккуратно пипетки, чтобы отделить клетки. Соберите одноклеточную подвеску в 50-миллилитровой центрифуге. Центрифуга при 300г в течение пяти минут.Затем удалите супернатант и повторно посовелите клетки в один миллилитр культурной среды. После подсчета клеток, распределить от двух до трех миллионов клеток в трех миллилитров базальной индукционной среды дополняется пятью микромолярной blebbistatin к каждому колодец низкой крепления шесть пластины хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.На следующий день проверьте качество эмбриональных тел под микроскопом. Удалите среду и замените ее тремя миллилитров базальной индукционной среды, дополненной 10 микромоларными SB-505124 и 50 нанограммами на миллилитр основного фактора роста стекловолокна человека. Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.Следующие два дня удалите среду и замените ее тремя миллилитров базальной индукционной среды, дополненной 25 нанограммами на миллилитр костного морфогенетического белка четыре. Затем продолжайте инкубацию, используя предыдущие условия. На четвертый день приготовьте смесь 0,5 микрограмма на квадратный сантиметр ламинина-521 и пять микрограммов на квадратный сантиметр плацентарный коллаген человеческого типа четыре, разбавленного в DPBS, содержащего кальций два и магний два иона.Используя эту смесь, покрыть 100 миллиметров ткани культуры блюда для адепта дифференциации в общем объеме покрытия пять миллилитров на блюдо. Печать пластин, и хранить их при четырех градусах по Цельсию на ночь. На пятый день прогреть все необходимые материалы и реагенты до комнатной температуры в ламинарной капюшоне потока.После этого снимите раствор покрытия и добавьте к каждому блюду 10 миллилитров предварительно разогретой дифференциации. Используя пипетки, перенесите эмбриональные тела из одной пластины хорошо через две-три ткани культуры блюд. Затем аккуратно встряхните каждое блюдо культуры, чтобы равномерно распределить эмбриональные тела.Поддерживайте клетки в адептской культуре при 37 градусах Цельсия с 5%CO2 в течение следующих двух с половиной-трех недель, убедившись, что заменить средний с 10 миллилитров свежей дифференциации среды три раза в неделю. Используйте фазовый контрастный микроскоп, чтобы регулярно проверять клетки на наличие правильной эпителиальной морфологии. Для начала предварительно разогреть все необходимые материалы и реагенты до комнатной температуры в ламинарной капюшоне потока, за исключением криоконсервации среды, которая должна быть предварительно охлажденной.Затем отсоедините плюрипотентную стволовую клетку человека, полученную лимбальными эпителиальными стволовыми клетками, к одноклеточной суспензии, добавив ксено свободный трипсин EDTA и инкубации при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2. Через пять минут удалите клетки из инкубатора и проверьте морфологию клеток, чтобы определить оптимальную фазу для удаления трипсина. Внимательно наблюдайте за клетками, чтобы определить оптимальное время для удаления ксено свободного трипсина ЭДТА, когда клетки округлены, но не отделились полностью.В оптимальное время, удалить ксено свободной трипсина EDTA из клеток, и отделить клетки, как описано ранее. После подсчета клеток, центрифуга их на 300г в течение пяти минут. Аспирировать среды, и повторного перерасхода клеток в предварительно охлажденной ксено свободной криоконсервации среды.Используя пипетку, перенесите одноклеточную подвеску в криотрубы, чтобы каждая криотрубка содержит от 500 000 до одного миллиона клеток в одном миллилитре криоконсервации среды. Поместите трубки в замораживающий контейнер. В течение пяти минут, передать их в морозильную камеру при отрицательном 80 градусов по Цельсию для ночного хранения.На следующий день перенесите трубки в жидкий азот для длительного хранения. Перед оттаиванием клеток, покрыть все необходимые блюда и пластины скважины со смесью из пяти микрограммов на квадратный сантиметр человеческого плацентарного коллагена типа четыре, и 0,5 микрограмма на квадратный сантиметр LM-521, и предварительно разогреть все необходимые материалы и реагенты для комнатной температуры в ламинарном потоке капота. Затем снимите раствор покрытия с посуды и пластинных колодцев и добавьте соответствующий объем предварительно разогретой дифференциации среды.Добавьте предварительно разогретую дифференциацию в 15-миллилитровую коническую трубку. Оттепель клетки быстро комнатной температуры. После размораживания немедленно перенесите подвеску клетки в коническую центрифугу.Центрифуга при 300г в течение пяти минут. Аспирировать среды, и повторно использовать ячейки гранулы в дифференциации среды для удаления любых криоконсервации среды. Плита клеток на предварительной посуды в дифференциации среды при плотности от 40000 до 50000 клеток на квадратный сантиметр.Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия при 5%CO2, заменяя дифференциацию средой три раза в неделю. На Laminin-521 недифференцированная высококачественная кормушка, свободная от плюрипотентных стволовых клеток человека, сначала образуют различные колонии с острыми краями, которые сливаются с однородными монослойами при слиянии. Культивирование в базальной индукционной среде, дополненной пятью микромолейными блеббистатином в течение 24 часов, как правило, производит суспензию плотных, регулярных эмбриональных тел различных размеров, в то время как эмбриоидная морфология тела не должна резко меняться во время поверхностной эктодермальной индукции в суспензии, колониальный нарастание, как видно, появляется вскоре после того, как эмбриональные тела появляются на коллагене типа 4 и Laminin-521.В течение 21-25 дней дифференциации клетки образуют стеченные однородные слои с полигональной морфологией, что характерно для эпителиальных клеток. Клетки могут быть затем крио хранится для более длительного использования, как жизнеспособность и морфология хорошо сохранились после оттаивания. На 24-й день дифференциации, подавляющее большинство клеток выразили пару белка коробки, PAX6, ключевой регулятор развития глаз, а также p63 альфа, широко признанный маркер LESC.Дельта Np63 coexpressed в большинстве p63 альфа-положительных клеток, подтверждающие наиболее роговицы конкретных дельта Np63 альфа положительный фенотип клеток. Другие маркеры выражены частично, в то время как другие необнаружимы на данный момент, указывая дифференциации продвинулась в направлении однопотентных лимбальных эпителиальных прародителей, но терминальная дифференциация в зрелых эпителиальных клеток роговицы еще не произошло. В среднем, каждая недифференцированная фидер свободной человеческой плюрипотентной стволовой клетки генерирует 0,7 клеток в день 25.По крайней мере 65%delta Np63 альфа положительной популяции клеток можно ожидать к 24-му дню. Криоконсервация еще больше очищает популяцию клеток. В целом, методы, представленные здесь, относительно просты, но есть несколько критических моментов к успеху.Высокое качество исходного материала имеет важное значение, а также нежные, свободно методы клеточной культуры в целом. Этот протокол обеспечивает надежные средства для производства лимбальных эпителиальных стволовых клеток для клинического применения, а также для различных исследовательских целей. Кроме того, метод можно легко модифицировать для дифференциации пигментных эпителиальных клеток сетчатки.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; панкреатических Предшественники

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Переходное лечение стволовых клеток человека с DMSO для содействия дифференциации

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...