Name: efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Studien har finansierats av akademin av Finland (licensnummer 297886), det mänskliga reservdelar programmet av Tekes – utvecklingscentralen för teknologi och innovationer, finska ögat vävnad Bank stiftelse och Finska Kulturfonden. Författarna vill tacka de biomedicinska laboratorietekniker Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt och Outi Heikkilä för utmärkt tekniskt bistånd och bidrag till cellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä är erkänt för att tillhandahålla den hiPSC linjen används och BioMediTech Imaging Core facility för att tillhandahålla utrustning för fluorescens avbildning.

Tammerfors universitet har godkännande av den nationella myndigheten Rättsskyddscentralen Finland (Dnro 1426/32/300/05) för att bedriva forskning på mänskliga embryon. Institutet har också stödjande uttalanden av etiska kommittén av Birkalands sjukvårdsdistrikt att härleda, kultur, och differentiera hESC linjer (Skottman/R05116) och använda hiPSC linjer i oftalmologiska forskning (Skottman/R14023). Inga nya cellinjer härleddes för denna studie.
Obs: Protokollet beskrivs är basera...

<ol>
	<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).</li><li>Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+and+corneal+epithelial+homeostasis.">Limbal and corneal epithelial homeostasis.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).</li><li>Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+DeltaNp63+and+the+migration+of+ocular+limbal+cells+in+human+corneal+regeneration.">Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).</li><li>Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration.">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li><li>Notara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+sickness+and+in+health:+Corneal+epithelial+stem+cell+biology,+pathology+and+therapy.">In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy.</a> Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).</li><li>Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbal+epithelium+of+the+eye--a+review+of+limbal+stem+cell+biology,+disease+and+treatment.">The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Sangwan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+xeno-free+autologous+cultivated+limbal+epithelial+transplantation:+a+10-year+study.">Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).</li><li>Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+limbal+epithelial+transplantation+(SLET)+in+failed+cultivated+limbal+epithelial+transplantation+(CLET)+for+unilateral+chronic+ocular+burns.">Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns.</a> The British Journal of Ophthalmology. , (2018).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells+by+in+vitro+replication+of+the+corneal+epithelial+stem+cell+niche.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).</li><li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro.">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li><li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium.">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).</li><li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li><li>Shalom-Feuerstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+model+reveals+essential+roles+for+miR-450b-5p+and+miR-184+in+embryonic+corneal+lineage+specification.">Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification.</a> Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).</li><li>Cieslar-Pobuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+transdifferentiation+into+corneal+epithelial-like+cells.">Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.</a> Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions.">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li><li>Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+induction+promotes+corneal+epithelial+cell+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).</li><li>Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Culture+Time+Point+to+Induce+Corneal+Epithelial+Differentiation+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).</li><li>Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+corneal+epithelial+progenitor+cells+under+defined+conditions.">Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions.</a> PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).</li><li>Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+limbal+epithelial+cells+(LiPSC)+as+a+cellular+alternative+for+in+vitro+ocular+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing.</a> PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).</li><li>Kamarudin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Activity+of+Endogenous+Bone+Morphogenetic+Protein+Signaling+Impact+on+the+Ability+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Differentiate+to+Corneal+Epithelial-Like+Cells.">Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells.</a> Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+three+new+human+embryonic+stem+cell+lines+in+Finland.">Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).</li><li>Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Set&#228;l&#228;, K., Hyttinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image-based+analysis+of+single+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocyte+beating+dynamics+using+digital+image+correlation.">Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation.</a> Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).</li><li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+&#945;-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy.">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or &#945;-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).</li><li>Ali, R. R., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine:+DIY+eye.">Regenerative medicine: DIY eye.</a> Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).</li><li>International Stem Cell Initiative, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286 (2017).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

Det förväntade resultatet av detta protokoll är framgångsrik och robusta generation av LESCs från en enda cellsuspension av FF hPSC inom cirka 3,5 veckor. Som hornhinneepitelet utvecklas från ytan ektoderm29, syftar det första steget i protokollet till styrning hPSCs mot denna härstamning. En kort 24 h induktion med omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β) antagonist SB-505124 och bFGF används för att framkalla ektodermala differentiering, följt av 48 h mesodermala BMP-4 cue att driva ce...

Den genomskinliga hornhinnan på den okulära ytan tillåter ljus komma näthinnan och ger majoriteten av ögats brytningsförmåga. Det yttersta lagret, stratifierat hornhinnans epitel, är kontinuerligt regenereras genom limbala epitelial stamceller (LESCs). LESCs finnas i de basala lagret av de limbala nischerna på corneoscleral junction1,2. LESCs saknar specifik och unik markörer, så deras identifiering kräver en mer omfattande analys av en uppsättning förmodad markörer. Epitelial transkription faktorn p63 och särskilt N-terminalt trunkerade avskrift av den alfa isoformen av p63 (ΔNp63α), har föreslagits som en relevant positiva ESF LESC marker3,4. Asymmetrisk fördelning av LESCs tillåter dem att själv förnya, men också producera avkomma som migrerar centripetally och anteriorly. Som cellerna framsteg mot hornhinnans yta de gradvis förlorar sin stemness och slutligen obotligt differentiera till ytlig Skivepitelcancer celler som kontinuerligt försvinner från hornhinnans yta.
Skada på någon av hornhinnans lager kan leda till allvarlig synnedsättning och korneal defekter är således en av de främsta orsakerna till synnedsättning i hela världen. I brist på limbala stamceller (LSCD) förstörs limbus av sjukdom eller trauma som leder till conjunctivalization och grumling av hornhinnans yta och efterföljande förlust av vision5,6. Cell substitutionsterapi med autologa eller allogena limbala ympkvistar erbjuder en behandlingsstrategi för patienter med LSCD4,7,8,9. Men skörd autologa transplantat bär en risk för komplikationer för det friska ögat och givarens vävnad är en bristvara. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), specifikt mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), kan fungera som en obegränsad källa av kliniskt relevanta celltyper, inklusive korneal epitelceller. HPSC-derived LESCs (hPSC-LESCs) utgör därför en attraktiv ny cell källa för okulär cell substitutionsterapi.
Traditionellt, både de odifferentierade hPSC kultur metoderna och deras differentiering protokoll till LESCs har förlitat sig på användning av odefinierade feeder celler, animaliska sera, luftkonditionerade medier eller fostervattnet membran10,11, 12 , 13 , 14 , 15. nyligen, insatser mot säkrare cellterapi har föranlett sökandet efter mer standardiserade och xeno-fri kultur och differentiering-protokoll. Som ett resultat, är flera definierade och xeno-fria metoder för långtidsodling av odifferentierade hPSCs kommersiellt tillgängliga16,17,18. Som ett kontinuum, riktad differentiering protokoll som förlitar sig på molekylär ledtrådar att vägleda hPSCs till hornhinnans epitel öde har nyligen introducerat19,20,21,22, 23. Ännu används många av dessa protokoll antingen odefinierad, feeder baserat hPSCs som utgångsmaterial, eller komplexa, xenogena tillväxtfaktor cocktails för differentiering.
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en robust, optimerad, xeno- och feeder-fri hPSC kultur metod och efterföljande differentiering till hornhinnan LESCs. Enskiktslager kultur av pluripotenta hPSCs på laminin-521 (LN-521) matris i definierade, albumin-fri hPSC medium (särskilt väsentliga 8 Flex) tillåter snabb produktion av homogena utgångsmaterial för differentieringar. Därefter en enkel, two-step differentiering strategi guider hPSCs mot ytan ektodermala öde i suspension, följt av vidhäftande differentiering till LESCs. En cell befolkningen där > 65% uttrycka ΔNp63α erhålls inom 24 dagar. Xeno - och feeder-fri protokollet har testats med flera hPSC linjer (både hESCs och hiPSCs), utan några krav för cell linje specifik optimering. Protokollen för weekend-gratis underhåll, passaging, cryostoring och hPSC-ESF LESC fenotypning beskrivs här möjliggör tillverkning av stora serier av högkvalitativa LESCs för kliniska eller forskningsändamål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-512F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3296</td>
			<td>Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3336</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning CellBIND</td>
			<td>#3337</td>
			<td>Culture vessel format for IF samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, Ultra-Low attachment</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>#3471</td>
			<td>Culture vessel format for induction in suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21202</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-goat Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-11057</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#A-10037</td>
			<td>Secondary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#AF-100-18B</td>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554722</td>
			<td>Fixation and permeabilization solution for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#554723</td>
			<td>Washing buffer for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td>
			<td>PeproTech Inc.</td>
			<td>#120-05A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8022-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 12 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#SC-17099</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#MAB3164</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 15 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#MS-1068-P</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CnT-30</td>
			<td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td>
			<td>#Cnt-30</td>
			<td>Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV (human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5533</td>
			<td>Human placental collagen type IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPure tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>#72.380</td>
			<td>1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>#Ln521</td>
			<td>Human recombinant laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#916;Np63&#945; antibody</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>#4892</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT3/4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#AF1759</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63&#945; antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#ACI3066A</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63-&#945; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#56687</td>
			<td>p63-&#945; PE-conjugated antibody for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HPA030775</td>
			<td>Primary antibody for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td>Cell fixative for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#P36931</td>
			<td>DAPI mountant for hard mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A2644601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#12563-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR XenoFree CTS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-505124</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#S4696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Permeabilization agent for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#H-1200</td>
			<td>DAPI mountant for liquid mounting for IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td>
			<td>Tharmac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and scalable directed differentiation of clinically compatible corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells

Hornhinnans limbala stamceller epitelceller (LESCs) ansvarar för kontinuerligt förnya hornhinneepitelet och därmed upprätthålla korneal homeostas och visuell tydlighet. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda LESCs ger en lovande cell källa för korneal cell substitutionsterapi. Odefinierad, xenogena kultur och differentiering förhållanden orsaka förändring forskningsresultat och hindra klinisk översättning av hPSC-derived therapeutics. Detta protokoll ger en reproducerbar och effektiv metod för hPSC-ESF LESC differentiering xeno- och feeder cellfria villkor. För det första fungerar enskiktslager kultur av odifferentierade hPSC på rekombinant laminin-521 (LN-521) och definierade hPSC medium som en grund för robust produktion av högkvalitativa utgångsmaterial för differentieringar. För det andra, en snabb och enkel hPSC-ESF LESC differentiering metod ger ESF LESC populationer i bara 24 dagar. Metoden innehåller en fyra dagars ytan ektodermala induktion i suspension med små molekyler, följt av vidhäftande kultur fas på LN-521/kollagen IV kombination matris i definierade korneal epitelial differentiering medium. Cryostoring och utökade differentiering ytterligare renar cell befolkningen och möjliggör Bank av cellerna i stora mängder för cellterapi. De resulterande hög kvalitet hPSC-LESCs ge en potentiell ny behandlingsstrategi för hornhinnans yta återuppbyggnad att behandla brist på limbala stamceller (LSCD).

Från hPSCs till hPSC-LESCs
Hela processen från inducerar differentiering av FF hPSCs att cryostoring hPSC-LESCs tar runt 3,5 veckor. Schematisk översikt över metoden differentiering belysa dess viktigaste stegen presenteras i figur 1A. Figur 1B visar typiska morfologier av cellpopulationer i olika faser av protokollet. Uppgifterna erhålls med Regea08/017 hESC linje oc...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Detta protokoll införs en enkel två-stegs metod för att skilja korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller xeno- och villkor feeder cellfria kultur. De cell kultur metoder presenteras här möjliggör kostnadseffektiva, storskaliga produktionen av klinisk kvalitet celler gäller för korneal cell terapi användning.

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Detta protokoll infördes en definierad feeder cell fri metod för differentiering hornhinnans limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller. Limbal epitelial stamceller är ansvariga för att förnya hornhinnans epitelial i friska ögat. Skador på dessa celler leder till ett tillstånd som kallas limbal stamcellsbrist, och till förlusten av hornhinnans klarhet.De cellodlingsmetoder som visas här möjliggör effektiv produktion av limbala epitelceller för framtida ersättningsterapier för hornhinnan. Till att börja med passage och upprätthålla mataren fri mänskliga pluripotenta stamcellskultur som beskrivs i textprotokollet. Se till att använda endast högkvalitativa mänskliga pluripotenta stamceller som utgångsmaterial för differentiering.När du är redo att inducera embryoid kroppsbildning, värma alla de nödvändiga material och reagenser till rumstemperatur i en laminär flöde huva. Lösgör mataren fria mänskliga pluripotenta stamceller till suspensionen genom att lägga till 500 mikroliter av xeno gratis trypsin EDTA till varje brunn. En inkubering vid 37 grader Celsius, med 5%CO2.Efter tre minuter, ta bort cellerna från inkubatorn och kontrollera cellen morfologi för att bestämma den optimala fasen för trypsin borttagning. Observera försiktigt cellerna för att bestämma den optimala tiden för att ta bort xeno gratis tryspin EDTA, när cellerna har avrundat uppåt, men inte har lossnat helt. Vid den optimala tiden, ta bort xeno gratis trypsin EDTA från cellerna.Tillsätt definierad trypsinhämmare och försiktigt pipetten för att lossa cellerna. Samla ihop encellsupphängningen i ett centrifugeringsrör på 50 milliliter. Centrifugera vid 300g i fem minuter.Sedan tar du bort supernatanten och återanvänd cellerna i en milliliter odlingsmedium. Efter att ha räknat cellerna, fördela två till tre miljoner celler i tre milliliter basal induktionsmedium kompletteras med fem mikromolar blebbistatin till varje brunn av en låg fastsättning sex brunnsplatta. Inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%CO2.Nästa dag, kontrollera kvaliteten på embryoidkropparna under mikroskop. Ta bort mediet, och ersätta det med tre milliliter basal induktionsmedium kompletteras med 10 mikromolar SB-505124 och 50 nanogram per milliliter av mänskliga grundläggande glasfiber tillväxtfaktor. Fortsätt inkubera vid 37 grader Celsius med 5%CO2.Följande två dagar, ta bort mediet, och ersätta det med tre milliliter basal induktion medium, kompletteras med 25 nanogram per milliliter ben morphogenetic protein fyra. Fortsätt sedan inkubationen med hjälp av de tidigare villkoren. På dag fyra, förbereda en blandning av 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter av Laminin-521, och fem mikrogram per kvadratcentimeter av mänskliga placenta kollagen typ fyra, utspädd i DPBS som innehåller kalcium två och magnesium två joner.Med hjälp av denna blandning, päls 100 millimeter vävnad kultur rätter för vidhäftande differentiering i total beläggning volym på fem milliliter per skålen. Försegla plattorna, och förvara dem i fyra grader Celsius över natten. På dag fem, värma alla de nödvändiga material och reagenser till rumstemperatur i en laminär flöde huva.Efter detta, ta bort beläggningslösningen och tillsätt 10 milliliter av förvättnad differentiering medium till varje maträtt. Med hjälp av en pipett, överföra embryoid organ från en enda tallrik väl över två till tre vävnad kultur rätter. Sedan skaka försiktigt varje kultur skålen för att jämnt fördela embryoid organ.Behåll cellerna i vidhäftande kultur vid 37 grader Celsius med 5%CO2 under de kommande två och en halv till tre veckor, se till att ersätta mediet med 10 milliliter av färsk differentiering medium tre gånger per vecka. Använd ett faskontrastmikroskop för att regelbundet kontrollera cellerna för uppkomsten av korrekt epitelial morfologi. Till att börja, för varm alla de nödvändiga material och reagenser till rumstemperatur i en laminär flöde huva, med undantag för cryopreservation medium, som bör pre-kyld.Därefter lossa den mänskliga pluripotenta stamceller härrör limbal epitelial stamceller till encells suspension genom att lägga till xeno gratis trypsin EDTA och inkubering vid 37 grader Celsius med 5%CO2. Efter fem minuter, ta bort cellerna från inkubatorn och kontrollera cellen morfologi för att bestämma den optimala fasen för trypsin borttagning. Observera försiktigt cellerna för att bestämma den optimala tiden för att ta bort xeno gratis trypsin EDTA, när cellerna har avrundat uppåt, men inte har lossnat helt.Vid optimal tidpunkt tar du bort xeno-gratis trypsin EDTA från cellerna, och lösgör cellerna enligt tidigare beskrivning. Efter att ha räknat cellerna centrifug dem på 300g i fem minuter. Aspirera mediet, och resuspend cellerna i pre-kyld xeno gratis cryopreservation medium.Med hjälp av en pipett överför du den enda cellupphängningen till kryorör så att varje kryorör innehåller mellan 500, 000 till en miljon celler i en milliliter cryopreservation medium. Placera rören i en frysbehållare. Inom fem minuter, överför dem till en frys på minus 80 grader Celsius för övernattning lagring.Nästa dag, överför rören till flytande kväve för långsiktig lagring. Innan upptining av cellerna, belägga alla behövs rätter och brunnar tallrik med en blandning av fem mikrogram per kvadratcentimeter mänskliga placenta kollagen typ fyra, och 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter LM-521, och för varma alla de nödvändiga material och reagenser till rumstemperatur i laminar flöde huva. Därefter tar du bort beläggningslösningen från disken och tallriks brunnarna och lägger till lämplig volym av förvarnat differentieringsmedium.Lägg till förvörd differentiering medium till en 15 milliliter koniska röret. Tina cellerna snabbt till rumstemperatur. När tinas, omedelbart överföra cellen suspensionen till koniska centrifugröret.Centrifugera vid 300g i fem minuter. Aspirera mediet, och resuspend cellen pelleten i differentiering medium för att avlägsna alla cryopreservation medium. Plate cellerna på precoated rätter i differentiering medium vid en densitet av 40, 000 till 50, 000 celler per kvadratcentimeter.Bibehåll cellerna vid 37 grader Celsius vid 5%CO2, vilket ersätter differentieringsmediet tre gånger i veckan. På Laminin-521, den odifferentierade hög kvalitet feeder fria mänskliga pluripotenta stamceller först bildar distinkta kolonier med vassa kanter, som går samman till homogena monolayers vid sammanflödet. Culturing i basala induktionsmedium, kompletterat med fem mikromolar blebbistatin i 24 timmar ger normalt en suspension av snäva, regelbundna embryoid organ av olika storlekar, medan embryoid kroppen morfologi bör inte förändras dramatiskt under ytan ektodermal induktion i suspension, kolonial utväxt ses visas snart efter embryoid organ är pläterade på kollagen typ fyra och Laminin-521 kombination matris i differentiering medium.Inom 21 till 25 dagar av differentiering, cellerna bildar sammanflytande homogena lager, med polygonal morfologi, som är typiskt för epitelceller. Cellerna kan sedan cryo lagras för senare användning, som livskraft och morfologi är väl bevarade efter upptining. Vid dag 24 av differentiering, de allra flesta av cellerna uttrycktparad låda protein, PAX6, den viktigaste regulatorn för ögat utveckling, samt p63 alfa, den allmänt erkända LESC markör.Delta Np63 är coexprimed i de flesta av de p63 alfa positiva celler, bekräftar de mest hornhinnan specifika delta Np63 alfa positiva cell fenotyp. Andra markörer uttrycks delvis, medan andra är omöjlig att upptäcka på denna punkt, vilket indikerar differentiering har utvecklats mot unipotent limbal epitelial progenitors, men terminalen differentiering till mogna hornhinnans epitelial celler har ännu inte inträffat. I genomsnitt genererar varje odifferentierad matare fri mänsklig pluripotent stamceller 0,7 celler av dag 25.Minst 65%delta Np63 alfa positiva cellpopulationen kan förväntas av dag 24. Kryobevaring renar cellpopulationen ytterligare. Sammantaget är de metoder som presenteras här relativt enkla, men det finns några kritiska punkter till framgång.Hög kvalitet på utgångsmaterialet är väsentligt, liksom milda, flytande cellodlingstekniker i allmänhet. Detta protokoll ger robusta medel för att producera limbala epitelceller för kliniska tillämpningar, samt för olika forskningsändamål. Dessutom kan metoden enkelt modifieras för differentiering av näthinnans pigmentepitelceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreasstamfäder

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Övergående behandling av humana pluripotenta stamceller med DMSO för att främja differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...