Name: antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0302 ו- W81XWH-16-1-0303).

השיטה הכללית מצמד חלבונים שומנים בדם, שילוב ליפוזומים מבוססת במידה רבה על עבודה קודמת15. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים להלן אושרו על ידי מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC). כל העכברים השתמשו במודל לבוטנים הן נקבות BALB/cJ שנרכשו רוב בגי...

<ol>
	<li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence,+severity,+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States.">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li><li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=US+prevalence+of+self-reported+peanut,+tree+nut,+and+sesame+allergy:+11-year+follow-up.">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy:+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization.">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li><li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy.">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).</li><li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults.">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).</li><li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy:+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response.">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li><li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+(STOP+II):+a+phase+2+randomised+controlled+trial.">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li><li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li><li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model.">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li><li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis.">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li><li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2.">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li><li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy.">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li><li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea,+Ara+h+2+and+Ara+h+6,+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice.">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li><li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2.">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li><li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes.">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li><li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development.">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li><li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy.">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li><li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms.">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li><li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).</li><li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG/peanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy.">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li><li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice.">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li><li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+and+autoimmunity.">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li><li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+myasthenia+gravis:+utility+and+limitations.">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system.">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis.">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li><li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis.">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li></ol>

השיטות המתוארות כאן הם עבור הבניין של חלבון כדי ליפופרוטאין אשר מאפשר את התצוגה של החלבון על חלקיקים liposomal פרוטוקול כללי. חלבונים יחידה משנית ריבוי גדול מאוד, פרוטוקול זה תהיה מוגבלת השירות. השיטה האידיאלי יהיה המבוא של תג בייעודי לאתר המאפשר אסטרטגיה כימי biorthogonal קישור לשמש. אם המבטאת את ה...

אלרגיה למזון משפיע על 8% של ילדים בארצות הברית, עלה בשכיחות במהלך העשור1. אלרגיה בוטנים משפיע על 1% של ילדים ואינו בדרך כלל גדולים מדי.2. למרות מספר ניסויים קליניים מבטיח נערכים לטיפול של אלרגיה למזון, כולל אוראלי חיסוני (אוקיאנה), sublingual חיסוני (חריץ) חיסוני epicutaneous (EPIT), יש כיום אין טיפול שאושרו על-ידי ה-FDA אסטרטגיות עבור הרגישות יחידים בוטנים-אלרגית3,4,5,6,7,8. לכן, אנשים אלרגית אך ורק עליך להימנע אלרגנים להתחמק אנפילקסיס. שאלות רבות נותרו לגבי מסלולים של רגישות עולה, שבבסיס מנגנוני התפתחות אלרגיה למזון.
העכבר הן כלי רב ערך עבור הלומדים את המנגנונים של אלרגיה, כמו גם פיתוח חדש tolerogenic הקהיה טיפולים9,10,11,12. זה נכון במיוחד כי האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2; Ah2) אצל בני אדם הוא גם האלרגן דומיננטי בכמה תיאר העכבר מודלים13,14. בעוד העכבר מודלים של אלרגיה לבוטנים בפז בלימוד מנגנונים של רגישות עולה וסובלנות, חיסרון הוא כי הם יכולים להיות משתנה, דורשים שימוש adjuvants. Immunogens יותר חזק תהיה דרך אחת כדי למזער את ההשתנות מהותי של מודל שכזה. מאז B-תאים מופעלים בחוזקה על ידי אנטיגנים multivalent, ליפוזומים antigenic הצגת האלרגן הם אפשרות טובה בשל יכולתם להפעלת פוטנציאל תאי-B באמצעות הקולטן B-cell (BCR), בעוד גם יש את המאפיין של יעילות הטרמה תא T-cell דרך נלקח הלא ספציפית על ידי אנטיגן תאים.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור conjugating חלבונים אנטיגניים כדי liposomal חלקיקים באמצעות אסטרטגיה נתיישב ומודולרית. שימוש של הפונדקאית אנטיגן, מקטע Fab אנטי-IgM, נדגים כיצד חזק ליפוזומים antigenic כזה יכול להיות מגרה הפעלה B-cell. ליפוזומים antigenic הצגת אנטיגן Ah2 שימשו כדי לפתח מודל חדש עכבר שהוענקו רגישות. במודל זה, splenocytes מן מאומת עכברים אלרגית בוטנים, המכיל בוטנים ספציפיות זיכרון ו- T-לימפוציטים, מועברים לתוך תמים congenic עכברים. תגובות נוגדנים זיכרון הם המושרה על ידי הזרקה של ליפוזומים מצומדת עם Ah2 לתוך העכברים הנמען, לשם הפקת נוגדנים נגד Ah2. ואחריו דחיפה אחת בלבד עם Ah2 מסיסים, נוגדנים ספציפיים Ah2 להצמיח אנפילקטי תגובה חזקה כאשר אלו עכברים מאותגרים לאחר מכן עם Ah2. עכברים שעברו התגובה האלרגית מגיבים בצורה מאוד אחידה, לא קיבלו את אדג'וונט, גישה זו הוא מודל רצוי אלרגיה לבוטנים, התוצאות מציע כי זה יכול להיות כלי במודלים אחרים של העכבר מונע על ידי אנטיגנים מכוונת אלרגנים ואולי גם autoantigens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Sigma grade 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPDP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG 18:0</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG Maleimide</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td>1mL syringe with holder/heating block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.1 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.8 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Filter Supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>6100014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Round Bottom Flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z100633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnover stoppers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-301398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-198194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur Lock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>k4201634503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G50 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17004201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G100 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I1203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td>without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-006-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut flour</td>
			<td>Golden Peanut Co.</td>
			<td>521271</td>
			<td>12% fat light roast, 50% protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal feeding needles</td>
			<td>Cadence Science</td>
			<td>7920</td>
			<td>22g x 1.5&#34;, 1.25 mm - straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe for mice</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>Ret-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin, from vibrio cholera</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>100B</td>
			<td>Azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Stop Solution</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-85-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Immulon 4HBX plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified soluble Ara h 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA-DNP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgE anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>BYA60251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-Mouse IgE</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>PC284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>JNS065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin Protein, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>MADNP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329412</td>
			<td>U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-14</td>
			<td>25 x 75 x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 &#956;m Nylon, White, Sterile, Individually packaged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>10 gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS buffer, 4X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies

תגובות נוגדנים לחסינות קריטי מגן מגוון רחב של פתוגנים. יש עדיין עניין גבוהה על מנת לייצר נוגדנים חזקים לקבלת חיסון כמו גם להבין נוגדנים פתוגניים איך לפתח תגובות אלרגיות ומחלות אוטואימוניות. יצירת תגובות חזקות נוגדן אנטיגן ספציפי אינה טריוויאלית תמיד. במודלים של העכבר, זה דורש לעיתים קרובות מספר סיבובים של החיסונים עם אדג'וונט שמוביל כמות גדולה של השתנות רמות נוגדנים המושרה. דוגמה אחת היא במודלים של העכבר של אלרגיות בוטנים שם יותר חזקים לשחזור דגמים למזער מספרים העכבר ושימוש אדג'וונט יהיה מועיל. המוצג כאן הוא מודל העכבר מאוד לשחזור של אלרגיה לבוטנים אנפילקסיס. זה הדגם החדש מתבסס על שני גורמים מרכזיים: splenocytes (1) אנטיגן ספציפי הם adoptively מ רגיש-בוטן העכבר לתוך עכבר תמים הנמען, נרמול המספר של אנטיגן ספציפי זיכרון ו- T-לימפוציטים על פני מספר רב של עכברים; עכברים הנמען (2) הן לאחר מכן שיפרה עם immunogen multivalent חזק בצורה של חלקיקים liposomal הצגת האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2). היתרון העיקרי של מודל זה הוא הפארמצבטית שלה, אשר בסופו של דבר מפחיתה את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר כל, תוך צמצום מספר החיות מקבלים זריקות מרובות של אדג'וונט. מכלול מודולרי של אלה ליפוזומים immunogenic מספק הסתגלות יחסית נתיישב דגמים אחרים אלרגי או אוטואימוניות המערבות נוגדנים פתוגניים.

ניתן להדגים ההטיה של החלבון עניין עם DSPE-PEG(2000) על-ידי הפעלת תוך צמצום מראה עלייה משקל מולקולרי בהשוואה החלבון unconjugated. איור 1A מציג ג'ל נציג של העכבר אנטי IgM F(ab) פרגמנט ההטיה כדי פג-DSPE, אשר מראה על 2-3 kDa bandshift עבור החלבון denatured. שימו לב כי כ- 50% של החלבון מופיע כדי לה...

Watch this Scientific Journal Video about Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies at JoVE.com

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

המתואר הוא הכנת חלקיקים liposomal antigenic והשימוש שלהם עירור תאי B הפעלה במבחנה וב -vivo. תגובות נוגדנים חזקים ועקביים הוביל את הפיתוח של מודל חדש של אלרגיה לבוטנים. הפרוטוקול עבור יצירת ליפוזומים antigenic ניתן להרחיב אנטיגנים שונים ומודלים חיסונים.

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד תאי דם לבנים מופעלים, וכיצד מתפתחות אלרגיות לאלרגנים בודדים? היתרון העיקרי של מודל עכבר אלרגיה חזק ובלתי ניתן לשחזור זה הוא שניתן להשתמש בפחות עכברים כדי להניב שונות נמוכה יותר עם אוכלוסייה ניסיונית. חיסונים חדשים לשליטה בתגובות חיסוניות דורשים מודלים חזקים של עכבר כאמצעי ראשוני לבדיקה ביעילות vivo.לכן, ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי אימונותרפיה אלרגיה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לאלרגיות, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון אוטואימוניות שבה תגובות נוגדנים לא רצויים לשחק תפקיד מפתח במחלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בגלל חוסר ניסיון בעבודה עם חלקיקים liposomal או חוסר ניסיון עם הטכניקות הנדרשות בעבודה העכבר.התחל על ידי הוספת 2.5 שווה ערך טוחן של crosslinker heterobifunctional לחלבון ומניח את התגובה על שייקר מתנוסס בטמפרטורת החדר במשך כשעה. לאחר דגירה של שעה עם SPDP, התפל את החלבון על עמודה שאובדת באצטט נתרן 100 מ"ל, ולאסוף את השברים. לקבוע את ספיגת 280 ננומטר, ולאסוף את השברים העליונים.שטפו את העמודה ב-PBS, והוסיפו דיתיותריטול של 25 מילימולרים, או DTT, לשברי החלבון המפולגים למשך 5 עד 10 דקות. לאחר מכן, למדוד את ספיגת 280 ו 343 ננומטר של החלבון כדי לאפשר חישוב של יחס הקישור מבוסס על טוחנות של חלבון ואת הקישור. לאחר מכן, הפעל את שברי הבריכה של העמוד שטוף PBS, ולאסוף את השברים למדידה של 280 ננומטר ואת השבר העליון אוסף כפי שהודגם.הוסיפו לחלבון את הנפח המתאים של 100x DSPE-PEG2000-Maleimide כדי להשיג ריכוז סופי עודף טוחנת פי 1x ו-10 עם מערבולות עדינות. לאחר מכן, להפעיל את התגובה לילה תחת חנקן בבקבוק אטום עגול תחתון. למחרת, להפעיל את החלבון על עמוד חרוזים ג'ל דקסטרן מקושר, ולאחסן את שברי מאגר הסופי של חלבון הקשורים השומנים בארבע מעלות צלזיוס עד השימוש בהם.לאחר חישוב הכמות הנכונה של כל שומנים, לשלב את כל השומנים לתוך 12 מיליליטר borosilicate מבחנה זכוכית, ולהשתמש מזרק שלושה מיליליטר צינורות לפוצץ בזהירות את כלורופורם עם חנקן. לאחר מכן, ליופיליזציה הפתרון עם 100 microliters של DMSO לילה. למחרת בבוקר, להוסיף מיליליטר אחד של חלבון הקשורים השומנים לצינור השומנים 12 מיליליטר, ו sonicate הפתרון שלוש עד ארבע פעמים במשך 30 עד 60 שניות לכל sonication באמבט מים sonication עם לפחות חמש דקות מנוחה בין sonications.לאחר sonication האחרון, לטעון את המדגם לתוך אחד המזרקים extruding להציב לתוך extruder, ולהניח את מזרק extruder לתוך הקצה השני של extruder. המזרק הריק יתמלא כאשר השומנים מובלטים דרך קרום הפוליקרבונט 0.8 מיקרומטר. מניחים את האלט שהורכב במלואו לתוך בלוק חימום, ומדכאים בעדינות את הבוכנה כדי לרוקן את המזרק.לאחר ההבלטה האחרונה, להעביר את ליפוזומים לתוך בקבוקון נקי, ולהדיר את השומנים דרך פוליקרבונט 0.2 ו 0.1 מיקרומטר ממברנות כפי שהוכח רק. לאחר מכן, לאחסן את ליפוזומים בארבע מעלות צלזיוס. כדי לפקח על תגובת תאי B להפעלת ליפוזום אנטיגני, יש להוסיף 1.5 פעמים 10 לטחול השביעי במאגר טעינת שטף הסידן, ולהוסיף 1.5 מיקרומולרים הודו-1 לתאים, תוך היפוך הפתרון בצינור מספר פעמים כדי לערבב.לאחר דגירה של 30 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור, להוסיף חמש פעמים את נפח חיץ טעינת שטף סידן, צנטריפוגה תאים הודו-1 שכותרתו. עבור gating B-cell, תאי כתם עם נוגדן אנטי CD5 ואנטי B220 ב 0.5 מיליליטר של חיץ טעינה בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים במאגר טעינת שטף סידן טרי, ו resuspend את גלולה באחת עד פעמיים 10 לתאים השביעי לכל מיליליטר של שטף סידן טרי פועל חיץ לאחסון על קרח, מוגן מפני אור עד ניתוח.לאחר מכן, להוסיף 0.5 מיליליטר של תאים כתרים, חמישה מיליליטר, עגול למטה, צינור פוליסטירן, לחמם את התאים ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאחר שלוש עד חמש דקות, מעבירים את הצינור לתא עם מעילי מים של 37 מעלות צלזיוס המחובר לאמבט מים מקיף, והפעלה של הצינור במעיל המים על ציטומטר הזרימה. לאחר איסוף 5, 000 עד 10,000 אירועים בשנייה, לאפשר לתאים להתייצב במשך 15 עד 30 שניות, וליזוב מחדש את רכישת הנתונים, איסוף הנתונים לפחות 10 שניות כדי ליצור קריאת רקע.בסימן 10 שניות, להסיר במהירות את הצינור מן ציטומטר הזרימה, ולהוסיף את הריכוז הניסיוני המתאים של ליפוזומים אנטיגניים. לאחר מכן, פולס מערבולת התאים, ולקרוא את הצינור על ציטומטר במשך שלוש עד חמש דקות נוספות. כדי לחוש את בעלי החיים, לספק 200 microliters של תמצית בוטנים המכיל רעלן כולרה באמצעות gavage אוראלי לכל ארבעה עד חמישה שבועות בן BALB / c נקבה עכבר נמען פעם בשבוע במשך שלושה שבועות ו 300 microliters של תמצית בוטנים מדולל בשבוע הרביעי.ביום 28, להכין תמצית בוטנים לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר ב PBS, ולהשתמש מדחום רקטלי כדי למדוד את טמפרטורת הגוף הבסיסית של כל חיה רגישה. כאשר כל הטמפרטורות נמדדו, לנהל 200 microliters של תמצית בוטנים לכל נמען באמצעות הזרקה תוך-פרטית, ולמדוד את טמפרטורת הגוף עם מדחום רקטלי כל 15 דקות במשך שעה אחת לאחר ההזרקה. טבילה בטמפרטורת הגוף מצביעה על אלרגיה לבוטנים.לאחר בידוד טשטוש מהעכברים האלרגיים לבוטנים, השתמש במזרק אינסולין של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 27 מד, 5/8 אינץ' להזרקה תוך ורידי פי 1.5 עד השביעי של הטשטוש האלרגי המופק לוורידי הזנב של בעלי חיים נאיביים וחסרי רגישות. יום אחד לאחר העברה מאמצת, להזריק דרך הווריד 200 microliters של Ara h 2 ליפוזומים אנטיגניים לתוך הווריד הזנב של כל עכבר BALB / c שקיבל את הטחול האלרגי. שבועיים לאחר הזרקת ליפוזום, להגביר את העכברים עם i.p.הזרקה של Ara h 2 מסיס, ואחריו 200 מיקרוליטר Ara h 2 אתגר ביום 61. לאחר מכן, למדוד את טמפרטורות הגוף עם החללית רקטלי כל 15 דקות כפי שהוכח. ניתן להדגים התייחדות חלבונים על ידי הפעלת ג'ל להפחתת משקל מראה עלייה במשקל המולקולרי בהשוואה לחלבון הבלתי משוקם.כדי להעריך את שטף הסידן B-cell מגרה ליפוזום אנטיגני, שער התאים הבודדים החיים כדי לאפשר בחירה של B220 חיובי CD5 שלילי B תאים. לאחר מכן ניתן לנתח את היחס בין סגול הודו-1 לעומת פלואורסצנטיות כחולה הודו-1 לאורך זמן כדי להעריך את כמות ההפעלה של תאי B הנגרמים על ידי ליפוזום. כימות של Ara h 2 ספציפי IgE ו IgG1 בסרום של עכברים תמצית בוטנים רגישים על ידי ELISA עולה כי עכברים עם רגישות ממוסמר כי הם שיפרו עם Ara h 2 התערוכה מדידה Ara h 2 ספציפי IgE ו IgG1 בסרום שלהם.טמפרטורות הגוף שנרשמו במהלך אתגר Ara h 2 מגלות כי עכברים אלרגיים מדגימים ירידה בטמפרטורות הגוף בעקבות האתגר, בעוד טמפרטורות הגוף בעכברים נאיביים נשארות עקביות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור בזהירות לעקוב אחר כמות החלבון הקשורים לשומנים המשולבים בליפוזומים, כמו יותר מדי חלבון יכול להפוך את ההבלטה קשה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מעקב ומיון של תאי B ו- T ספציפיים לאלרגן כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו תאים ספציפיים לאלרגן אלה מגיבים לטיפולים.טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האלרגיה לחקור immunotherapies חדשים להילחם במחלות אלרגיות באמצעות מודל העכבר הזה. אל תשכח כי עבודה עם רעלן כולרה יכול להיות מסוכן, כי ההנחיות לשימוש בו צריך להיות אחריו על פי תקני הבטיחות הביולוגיים המוסדיים המקומיים שלך.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

נוגדנים ממוקד חסימה על ידי המשלים כפול תפקודית של פפטיד Antigenic ו-השלישי מימטיקה (בית קפה)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...