Name: antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal dipartimento della difesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).

Il metodo generale di accoppiamento proteina a lipido ed incorporare nei liposomi si basa in gran parte il precedente lavoro15. Tutte le procedure degli animali descritte di seguito sono state approvate da University of North Carolina a Chapel Hill istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC). Tutti i topi utilizzati nel modello di allergia dell'arachide sono femmine BALB/cJ acquistate da 3 settimane di età. La cura degli animali Università di Alberta e utilizzare Comitato (ACUC) ha approv...

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	<li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence,+severity,+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States.">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li><li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=US+prevalence+of+self-reported+peanut,+tree+nut,+and+sesame+allergy:+11-year+follow-up.">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy:+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization.">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li><li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy.">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).</li><li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults.">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).</li><li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy:+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response.">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li><li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+(STOP+II):+a+phase+2+randomised+controlled+trial.">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li><li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li><li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model.">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li><li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis.">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li><li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2.">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li><li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy.">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li><li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea,+Ara+h+2+and+Ara+h+6,+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice.">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li><li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2.">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li><li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes.">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li><li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development.">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li><li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy.">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li><li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms.">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li><li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).</li><li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG/peanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy.">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li><li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice.">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li><li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+and+autoimmunity.">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li><li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+myasthenia+gravis:+utility+and+limitations.">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system.">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis.">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li><li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis.">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li></ol>

I metodi descritti qui sono un protocollo generale per la coniugazione di una proteina di un lipide che consente la visualizzazione della proteina sulle nanoparticelle liposomiale. Per le proteine multi-unità secondaria molto grande, questo protocollo potrebbe aver limitato l'utilità. Il metodo ideale sarebbe l'introduzione di un tag site-specific che consente una strategia di collegamento chimico biortogonali essere utilizzato. Se esprimenti la proteina recombinantly, questo può essere possibile utilizzando strategie...

Allergia alimentare colpisce l'8% dei bambini negli Stati Uniti e ha aumentato in prevalenza negli ultimi dieci anni1. Allergia alle arachidi colpisce l'1% dei bambini e non è in genere sovrasviluppata2. Anche se parecchi test clinici promettenti sono in corso per il trattamento di allergia alimentare, tra cui l'immunoterapia orale (OIT), l'immunoterapia sublinguale (SLIT) e immunoterapia epicutaneous (EPIT), non ci sono attualmente senza strategie di trattamento approvato dalla FDA per desensibilizzazione individui allergici arachidi3,4,5,6,7,8. Di conseguenza, individui allergici devono rigorosamente evitare allergeni per evitare anafilassi. Molte domande rimangono riguardanti percorsi di sensibilizzazione e di base dei meccanismi di sviluppo di allergia alimentare.
Modelli murini sono uno strumento prezioso per lo studio dei meccanismi dell'allergia, nonché sviluppando nuove tollerogeniche e desensibilizzazione terapie9,10,11,12. Ciò è particolarmente vero perché l'allergene principale dell'arachide (Ara h 2; AH2) negli esseri umani è anche descritto l'allergene dominante in vari modelli del mouse13,14. Mentre i modelli murini dell'allergia dell'arachide sono preziosi per studiare i meccanismi della sensibilizzazione e della tolleranza, uno svantaggio è che può essere variabile e richiedono l'uso di adiuvanti. Immunogeni più potenti sarebbe un modo per ridurre al minimo la variabilità intrinseca di tali modelli. Dal momento che le cellule B sono fortemente attivate dagli antigeni multivalenti, liposomi antigenici visualizzati l'allergene sono una buona opzione a causa della loro capacità di attivare potenzialmente B-cellule attraverso il recettore delle cellule di B (BCR) mentre avendo anche la proprietà di efficiente adescamento il vano della T-cellula attraverso essere ripreso non specifico di antigene-presentare le cellule.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per coniugazione degli antigeni della proteina alle nanoparticelle liposomiale usando una strategia facile e modulare. Utilizzando un surrogato antigene, frammento Fab anti-IgM, dimostriamo come potente questi liposomi antigenici possono essere stimolante l'attivazione della B-cellula. Liposomi antigenici visualizzazione Ah2 antigene sono stati utilizzati per sviluppare un nuovo modello murino di sensibilità ha conferito. In questo modello, splenocytes dai topi di allergici alle arachidi verificati, contenente arachidi specifica memoria B - e T-cellule, vengono trasferiti in topi Congenici ingenuo. Le risposte dell'anticorpo di memoria sono indotti tramite l'iniezione di liposomi coniugato con Ah2 nei topi destinatari, al fine di indurre anticorpi contro Ah2. Seguita da un solo impulso con Ah2 solubile, anticorpi specifici Ah2 danno luogo a una forte risposta anafilattica quando questi topi sono successivamente impugnati con Ah2. Come topi sottoposti la reazione allergica rispondono in modo molto uniforme e non hanno ricevuto un adiuvante, questo approccio è un modello auspicabile allergia dell'arachide e i risultati suggeriscono che essa può avere utilità in altri modelli del mouse guidati dagli antigeni diretti a allergeni e, eventualmente, autoantigeni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Sigma grade 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPDP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG 18:0</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG Maleimide</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td>1mL syringe with holder/heating block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.1 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.8 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Filter Supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>6100014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Round Bottom Flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z100633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnover stoppers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-301398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-198194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur Lock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>k4201634503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G50 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17004201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G100 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I1203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td>without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-006-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut flour</td>
			<td>Golden Peanut Co.</td>
			<td>521271</td>
			<td>12% fat light roast, 50% protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal feeding needles</td>
			<td>Cadence Science</td>
			<td>7920</td>
			<td>22g x 1.5&#34;, 1.25 mm - straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe for mice</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>Ret-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin, from vibrio cholera</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>100B</td>
			<td>Azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Stop Solution</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-85-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Immulon 4HBX plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified soluble Ara h 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA-DNP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgE anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>BYA60251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-Mouse IgE</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>PC284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>JNS065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin Protein, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>MADNP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329412</td>
			<td>U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-14</td>
			<td>25 x 75 x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 &#956;m Nylon, White, Sterile, Individually packaged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>10 gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS buffer, 4X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies

Risposte anticorpali forniscono immunità protettiva critico per una vasta gamma di agenti patogeni. Ci rimane un elevato interesse nel generare anticorpi robusti per la vaccinazione così come capire come patogeno anticorpo risposte sviluppano allergie e malattie autoimmuni. Non è banale generando risposte robusto dell'anticorpo antigene-specifiche. In modelli murini, spesso richiede più cicli di vaccinazioni con adiuvante che conduce ad una grande quantità di variabilità dei livelli di anticorpi indotti. Un esempio è in modelli murini di allergie arachidi dove modelli più robusti e riproducibile che riducono al minimo i numeri del mouse e l'uso dell'adiuvante sarebbe vantaggioso. Presentato qui è un modello murino altamente riproducibili di anafilassi allergia dell'arachide. Questo nuovo modello si basa su due fattori chiave: (1) antigene-specifici splenocytes passivamente vengono trasferiti da un mouse di arachidi-sensibilizzati in un ingenuo destinatario mouse, normalizzare il numero di memoria antigene-specifiche cellule di B e di T attraverso un gran numero di topi; e (2) destinatari topi sono successivamente potenziati con un forte immunogen multivalenti sotto forma di nanoparticelle liposomiale visualizzati l'allergene principale dell'arachide (Ara h 2). Il principale vantaggio di questo modello è la sua riproducibilità, che in ultima analisi, riduce il numero di animali utilizzati in ogni studio, riducendo al minimo il numero di animali che ricevono iniezioni multiple di adiuvante. L'assemblaggio modulare di questi liposomi immunogenici fornisce relativamente facile adattabilità ad altri modelli allergiche o autoimmuni che coinvolgono gli anticorpi patogeni.

Coniugazione della proteina di interesse con DSPE-PEG(2000) può essere dimostrato mediante l'esecuzione di un riducente con un incremento di peso molecolare rispetto alla proteina non coniugata. Figura 1A Mostra un gel rappresentativo di coniugazione di frammento F(ab) di IgM anti-topo a PEG-DSPE, che mostra un bandshift di kDa di 2 – 3 per la proteina denaturata. Notare che circa il 50% della proteina sembra essere modificato, che è atteso dato che stech...

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Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Descritto è la preparazione di nanoparticelle liposomiale antigeniche e loro uso nella stimolante della B-cellula attivazione in vitro e in vivo. Risposte anticorpali coerente e stabile ha condotto allo sviluppo di un nuovo modello di allergia dell'arachide. Il protocollo per la generazione di liposomi antigenici può essere estesa a diversi antigeni e modelli di immunizzazione.

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come come vengono attivati i globuli bianchi e come si sviluppano le allergie ai singoli allergeni? Il vantaggio principale di questo modello di topo allergico robusto e riproducibile è che un minor numero di topi può essere utilizzato per produrre una minore varianza con una popolazione sperimentale. Le nuove immunoterapie per controllare le risposte immunitarie richiedono modelli di topo robusti come mezzo iniziale per testare l'efficacia in vivo.Pertanto, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia allergica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle allergie, può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'autoimmunità in cui le risposte anticorpali indesiderate svolgono un ruolo chiave nella malattia. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza nel lavorare con nanoparticelle liposomiche o di un'inesperienza con le tecniche richieste nel lavoro del topo.Iniziare aggiungendo 2,5 equivalente molare del reticolazione eterobifunzionale alla proteina e posizionando la reazione su uno shaker oscillante a temperatura ambiente per circa un'ora. Dopo un'incubazione di un'ora con SPDP, desalt la proteina su una colonna equilibrata in acetato di sodio 100 millimolare e raccogliere le frazioni. Determinare l'assorbanza di 280 nanometri e mettere in comune le frazioni migliori.Lavare la colonna in PBS e aggiungere ditiotriolo 25 millimolare, o DTT, alle frazioni proteiche raggruppate per un'incubazione da cinque a 10 minuti. Quindi, misurare le assorbanza di 280 e 343 nanometri della proteina per consentire il calcolo del rapporto di collegamento in base alla molarità della proteina e del linker. Successivamente, eseguire le frazioni raggruppate della colonna lavata con PBS e raccogliere le frazioni per la misurazione del pooling di 280 nanometri e frazione superiore come dimostrato.Aggiungere il volume appropriato di 100x DSPE-PEG2000-Maleimide alla proteina per ottenere una concentrazione finale in eccesso molare 1x, 10 volte con un delicato vorticoso. Quindi, eseguire la reazione durante la notte sotto azoto in un pallone rotondo-fondo sigillato. Il giorno seguente, eseguire la proteina su una colonna di perline di gel di dextran reticate e conservare le frazioni finali raggruppate di proteine lipidiche a quattro gradi Celsius fino al loro uso.Una volta calcolata la corretta quantità di ciascun lipide, combinare tutti i lipidi in una provetta di vetro borosilicato da 12 millilitri e utilizzare una siringa e tubi da tre millilitri per soffiare con cura il cloroformio con azoto. Quindi, liofilizzare la soluzione con 100 microlitri di DMSO durante la notte. La mattina seguente, aggiungere un millilitro di proteine lipidiche collegate al tubo lipidico da 12 millilitri e sonicare la soluzione da tre a quattro volte per 30-60 secondi per sonicazione in un bagno d'acqua di sonicazione con almeno cinque minuti di riposo tra le sonicazioni.Dopo l'ultima sonicazione, caricare il campione in una delle siringhe estrusorie poste nell'estrusore e posizionare la siringa estrusore nell'altra estremità dell'estrusore. La siringa vuota si riempirà quando il lipide viene estruso attraverso la membrana policarbonato da 0,8 micrometri. Posizionare l'estrusore completamente assemblato in un blocco riscaldante e deprimere delicatamente lo stantuffo per svuotare la siringa.Dopo l'ultima estrusione, trasferire i liposomi in una fiala pulita ed estrudere i lipidi attraverso membrane policarbonate 0,2 e 0,1 micrometri come appena dimostrato. Quindi, conservare i liposomi a quattro gradi Celsius. Per monitorare la risposta delle cellule B all'attivazione del liposoma antigenico, resuspend 1,5 per 10 al settimo splenociti nel tampone di carico del flusso di calcio e aggiungere 1,5-micromolare Indo-1 alle cellule, invertendo la soluzione nel tubo più volte per mescolare.Dopo un'incubazione di bagno d'acqua di 30 minuti a 37 gradi Celsius, protetta dalla luce, aggiungere cinque volte il volume del tampone di carico del flusso di calcio e centrifugare le cellule etichettate Indo-1. Per la gating a cellule B, le cellule di macchia con anticorpo anti-CD5 e anti-B220 in 0,5 millilitri di tampone di carico a quattro gradi Celsius per 20 minuti, protette dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in tampone di carico del flusso di calcio fresco e rimorsire il pellet da una a due volte 10 alla settima cellule per millilitro di tampone di flusso di calcio fresco per lo stoccaggio sul ghiaccio, protetto dalla luce fino all'analisi.Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di cellule a un tubo di polistirolo chiuso, cinque millilitro, fondo rotondo e riscaldare le cellule a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Dopo tre o cinque minuti, trasferire il tubo in una camera con giacca d'acqua Celsius di 37 gradi collegata a un bagno d'acqua ricircolante e far scorrere il tubo nella giacca ad acqua sul citometro a flusso. Dopo aver raccolto da 5.000 a 10.000 eventi al secondo, consentire alle celle di stabilizzarsi per 15-30 secondi e reinizializzare l'acquisizione dei dati, raccogliendo i dati per almeno 10 secondi per stabilire una lettura in background.Al segno di 10 secondi, rimuovere rapidamente il tubo dal citometro di flusso e aggiungere l'appropriata concentrazione sperimentale di liposomi antigenici. Quindi, pulsare le cellule e leggere il tubo sul citometro per altri tre o cinque minuti. Per sensibilizzare gli animali, consegnare 200 microlitri di estratto di arachidi contenente tossina colera tramite gavage orale a ciascuna ricevente di topo femmina BALB/c di quattro o cinque settimane una volta alla settimana per tre settimane e 300 microlitri di estratto diluito di arachidi nella quarta settimana.Il giorno 28, preparare l'estratto di arachidi a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro in PBS e utilizzare un termometro rettale per misurare la temperatura corporea di base di ogni animale sensibilizzato. Una volta misurate tutte le temperature, somministrare 200 microlitri di estratto di arachidi a ciascun ricevente tramite iniezione intraperitoneale e misurare la temperatura corporea con il termometro rettale ogni 15 minuti per un'ora dopo l'iniezione. Un calo della temperatura corporea indica un'allergia alle arachidi.Dopo aver isolato gli splenociti dai topi allergici alle arachidi, utilizzare una siringa per insulina da un millilitro dotata di un ago da 27 e 5/8 pollici per iniettare per via endovenosa 1,5 per 10 al settimo degli splenociti allergici estratti nelle vene della coda di animali ingenui e nonsensibilizzati. Un giorno dopo il trasferimento adottivo, iniettare per via endovenosa 200 microlitri di liposomi antigenici Ara h 2 nella vena di coda di ogni topo BALB/c che ha ricevuto gli splenociti allergici. Due settimane dopo l'iniezione di liposoma, aumentare i topi con un i.p.iniezione di Ara h 2 solubile, seguita da una sfida Ara h 2 da 200 microliter il giorno 61. Quindi, misurare le temperature corporee con la sonda rettale ogni 15 minuti come dimostrato. La coniugazione proteica può essere dimostrata eseguendo un gel riducente che mostra un aumento del peso molecolare rispetto alla proteina non coniugata.Per valutare il flusso di calcio a cellule B stimolato dal liposoma antigenico, gate le singole cellule vive per consentire la selezione delle cellule B b220-positive CD5-negative. Il rapporto tra viola Indo-1 e fluorescenza blu Indo-1 nel tempo può quindi essere analizzato per valutare la quantità di attivazione delle cellule B indomito da liposomi. La quantificazione di Ara h 2-specific IgE e IgG1 nel siero di topi sensibilizzati agli estratti di arachidi da ELISA indica che i topi con sensibilità conferita che vengono potenziati con Ara h 2 mostrano ara h 2-specifici IgE e IgG1 misurabili nel loro siero.Le temperature corporee registrate durante la sfida Ara h 2 rivelano che i topi allergici dimostrano una diminuzione delle temperature corporee a seguito della sfida, mentre le temperature corporee nei topi ingenui rimangono costanti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere attentamente traccia della quantità di proteine lipidiche incorporate nei liposomi, poiché troppe proteine possono rendere difficile l'estrusione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il tracciamento e lo smistamento di cellule B e T specifiche degli allergeni per rispondere a domande aggiuntive su come queste cellule specifiche degli allergeni rispondono alle terapie.Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo delle allergie per esplorare nuove immunoterapie che combattono le malattie allergiche usando questo modello di topo. Non dimenticare che lavorare con la tossina colera può essere pericoloso e che le linee guida per il suo uso dovrebbero essere seguite secondo i tuoi standard di sicurezza biologica istituzionali locali.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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