Name: antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00
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この研究は、国防総省 (W81XWH-16-1-0302 と W81XWH-16-1-0303) からの助成金によって支えられました。

蛋白質に結合脂質とリポソームに組み込むことの一般的な方法は、以前の作業15主に基づいています。以下の動物のすべての手続きは、チャペルヒル機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ノースカロライナ大学で承認されています。ピーナッツ アレルギー モデルで使用されるすべてのマウスは、3 週齢から購入した BALB/cJ 女性です。アルバータ大学のアニマル ・ ケアおよ...

<ol>
	<li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence,+severity,+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States.">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li><li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=US+prevalence+of+self-reported+peanut,+tree+nut,+and+sesame+allergy:+11-year+follow-up.">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy:+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization.">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li><li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy.">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).</li><li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults.">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).</li><li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy:+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response.">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li><li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+(STOP+II):+a+phase+2+randomised+controlled+trial.">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li><li>Sampson, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model.">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li><li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis.">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li><li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2.">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li><li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy.">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li><li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea,+Ara+h+2+and+Ara+h+6,+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice.">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li><li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2.">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development.">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li><li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy.">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li><li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms.">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li><li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).</li><li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG/peanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy.">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li><li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice.">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li><li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+and+autoimmunity.">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li><li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+myasthenia+gravis:+utility+and+limitations.">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system.">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis.">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li><li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis.">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li></ol>

ここで説明する方法は、タンパク質脂質リポソーム型ナノ粒子上で、蛋白質の表示を可能にするための一般的なプロトコルです。非常に大きい複合体タンパク質の場合は、このプロトコルにユーティリティを制限されています。理想的な方法は、使用する直交化学リンク戦略を可能にするサイト固有タグの導入でしょう。Recombinantly 蛋白質を表現する、市販されているペグインターフェロン?...

食物アレルギーは、アメリカ合衆国の子供の 8% に影響を与えるし、過去の有病率の増加している 10 年1。ピーナッツ アレルギーは、子供の 1% に影響を与える、通常小さくなった2ではありません。いくつかの有望な臨床試験が進行中である経口免疫療法 (OIT)、舌下免疫療法 (スリット)、皮膚免疫療法 (EPIT) など、食物アレルギーの治療のため現在はありません FDA 承認の治療戦略ピーナッツ アレルギーの個人3,4,5,6,7,8脱感作。そのため、アレルギーの個人は厳密にアナフィラキシーを回避するためにアレルゲンを避ける必要があります。多くの質問は、感作のルート、食品アレルギー疾患発症のメカニズムを基になるまま。
マウスのモデルは、新しい免疫寛容と脱感作療法9,10、11,12の開発し同様、アレルギーのメカニズムを勉強のための貴重なツールです。これは特に、主要なピーナッツ アレルゲン (Ara h 2;Ah2) 人間にはまたいくつかの支配的なアレルゲン説明マウス モデル13,14。ピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデル、感作性と耐性のメカニズムの研究に貴重な欠点は、ことができます変数やアジュバントの使用が必要です。強力な混合は、このようなモデルの本質的な可変性を最小限に抑える 1 つの方法でしょう。B 細胞は強く、多価抗原によって活性化、アレルゲンを表示する抗原のリポソームが良いオプションも効率的のプロパティを持つ、B 細胞の受容器 (BCR) を介して B 細胞を有効に可能性があります機能のため抗原提示によって非具体的に取り上げられているから T 細胞コンパートメントをプライミング細胞。
ここでは、安易なモジュラー方式リポソームのナノ粒子への蛋白質の抗原の結合のための詳しいプロトコルについて述べる。サロゲート抗原、抗 igm 抗体 Fab フラグメントを使用して、ことを示すこのような抗原のリポソームが刺激的な B 細胞の活性化にすることができますどのように強力な。Ah2 抗原を表示する抗原のリポソームは、授与の感度の新しいマウスモデルの開発に使用されました。このモデルでピーナッツ固有のメモリ B と T-細胞を含む検証のピーナッツ アレルギー マウスの脾細胞は素朴なコンジェニック マウスに転送されます。Ah2 に対する抗体を誘導するために受信者のマウスに共役 Ah2 とリポソームの注入によるメモリ抗体が誘導されます。水溶性 Ah2 で 1 つだけのブーストによって続かれて、Ah2 特異的抗体を生じ強いアナフィラキシー反応これらのマウスはその後 Ah2 に立ち向かっているとき。このアプローチは、望ましいピーナッツ アレルギー モデルと成果に向けられた抗原によって駆動される他のマウスモデルのユーティリティがあると示唆しているアレルギー反応を受けているマウスが均一な方法で応答、アジュバントを受け取っていません。アレルゲンになり自己抗原。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Sigma grade 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPDP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG 18:0</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG Maleimide</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td>1mL syringe with holder/heating block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.1 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.8 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Filter Supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>6100014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Round Bottom Flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z100633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnover stoppers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-301398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-198194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur Lock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>k4201634503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G50 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17004201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G100 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I1203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td>without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-006-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut flour</td>
			<td>Golden Peanut Co.</td>
			<td>521271</td>
			<td>12% fat light roast, 50% protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal feeding needles</td>
			<td>Cadence Science</td>
			<td>7920</td>
			<td>22g x 1.5&#34;, 1.25 mm - straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe for mice</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>Ret-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin, from vibrio cholera</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>100B</td>
			<td>Azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Stop Solution</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-85-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Immulon 4HBX plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified soluble Ara h 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA-DNP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgE anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>BYA60251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-Mouse IgE</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>PC284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>JNS065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin Protein, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>MADNP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329412</td>
			<td>U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-14</td>
			<td>25 x 75 x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 &#956;m Nylon, White, Sterile, Individually packaged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>10 gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS buffer, 4X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies

抗体は病原体の広い配列に重要な防御免疫を提供します。ワクチン接種と同様どの病原性抗体反応をアレルギーと自己免疫疾患の開発の理解のための堅牢な抗体の生成に対する関心の高さが残っています。堅牢な抗原特異的抗体を生成する常に簡単ではありません。マウス モデルで多くの場合予防接種による抗体のレベルの変動の大きなにつながるアジュバントの複数のラウンドが必要です。一例は、マウス番号と補助の使用を最小限に抑えるより堅牢かつ再現性のあるモデルが有益であろうピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデルであります。ここで紹介はピーナッツ アレルギーのアナフィラキシーの再現性の高いマウス モデルです。この新しいモデルは、2 つのキーファクターに依存している: (1) 抗原特異的脾細胞が素朴な受信者マウス、マウスを用いての多数にわたって抗原特異的メモリー B および T 細胞数の正規化にピーナッツ感作マウスから転送に対して(2) の受信者のマウスはその後 (Ara h 2) 主要なピーナッツ アレルゲンを表示するリポソームの粒子の形で強力な多価免疫で昇圧され.このモデルの主な利点はその再現性、最終的にアジュバントの複数の注射を受けた動物の数を最小限に抑えながら、それぞれの研究で使用される動物の数が減ります。これらの免疫原性リポソームのモジュラー アセンブリは、病原性の抗体を含む他のアレルギーや自己免疫モデルに比較的安易な適応性を提供します。

DSPE-PEG(2000) の興味の蛋白質の共役は、削減の増加を示す非蛋白質と比較して分子量を実行して示すことができます。図 1 aは、ペグ-DSPE、変性タンパク質の 2-3 kDa bandshift を示していますを抗マウス IgM F(ab) フラグメント活用の代表的なゲルを示しています。蛋白質の約 50% は、予想される 1:1 の化学量論は、重鎖および軽鎖の heterodimer です Fab 断片...

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Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

説明は、抗原のリポソーム化ナノ粒子と刺激的な B 細胞活性化の in vitroとin vivoでの使用の準備です。一貫性と堅牢な抗体は、ピーナッツ アレルギーの新しいモデルの開発につながった。抗原性リポソームの生成のためのプロトコルは、異なる抗原と免疫モデルに拡張できます。

疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

この方法は、白血球がどのように活性化され、個々のアレルゲンに対するアレルギーがどのように発症するかなど、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この堅牢で再現可能なアレルギーマウスモデルの主な利点は、実験集団でより低い分散を生み出すために使用できるマウスが少ないことである。免疫応答を制御する新しい免疫療法は、生体内での有効性をテストする最初の手段として堅牢なマウスモデルを必要とします。したがって、この技術の意味はアレルギー免疫療法にまで及ぶ。この方法はアレルギーに関する洞察を提供することができますが、望ましくない抗体応答が病気の重要な役割を果たす自己免疫などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、リポソームナノ粒子を扱う経験の欠如やマウスの仕事に必要な技術の未熟さのために苦労します。まず、タンパク質に2.5モル相当のヘテロビ官クロスリンカーを添加し、室温で振動シェーカーに約1時間反応を置きます。SPDPで1時間のインキュベーションを行った後、酢酸ナトリウム100ミリモルで平衡化されたカラム上のタンパク質を脱塩し、画分を回収する。280ナノメートルの吸光度を決定し、上部の分数をプールします。PBSでカラムを洗浄し、25ミリモルジチオトレイトール(DTT)をプールしたタンパク質画分に5〜10分間インキュベーションで加えます。次に、タンパク質の280および343ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質とリンカーのモル度に基づいて結合比を計算することを可能にする。次に、PBS洗浄カラムのプールされた分数を実行し、実証したように280ナノメートルおよびトップフラクションプールの測定のための画分を収集する。100x DSPE-PEG2000-マレイミドの適切な体積をタンパク質に加えて、穏やかな渦巻きで1倍、10倍のモル過剰最終濃度を達成します。その後、密閉された丸底フラスコで窒素の下で一晩反応を実行します。翌日、架橋されたデキストランゲルビーズカラム上でタンパク質を実行し、脂質結合タンパク質の最終的なプールされた分画を使用するまで摂氏4度で保存します。各脂質の正しい量を計算したら、すべての脂質を12ミリリットルのホウケイ酸ガラス試験管に組み合わせ、3ミリリットルのシリンジとチューブを使用してクロロホルムを窒素で慎重に吹き飛ばします。次いで、一晩100マイクロリットルのDMSOで溶液を凍結乾燥する。翌朝、12ミリリットルの脂質チューブに脂質結合タンパク質を1ミリリットル加え、超音波処理の間に少なくとも5分間の休息を伴う超音波水浴で超音波処理ごとに30〜60秒間溶液を3〜4回超音波処理します。最後の超音波処理の後、押出機に配置された押出シリンジの1つにサンプルをロードし、押出機の反対側に押出機の注射器を置きます。空のシリンジは、ポリカーボネート0.8マイクロメートル膜を通して脂質が押し出されると充填されます。完全に組み立てた押出機を加熱ブロックに入れ、プランジャーを軽く押してシリンジを空にします。最後の押し出しの後、リポソームをきれいなバイアルに移し、ちょうど実証したようにポリカーボネート0.2と0.1マイクロメートルの膜を通して脂質を押し出す。その後、リポソームを摂氏4度で保存します。抗原性リポソーム活性化に対するB細胞応答をモニタリングするために、カルシウムフラックスローディングバッファー内の第7スプレノサイトに1.5回10回再懸濁し、細胞に1.5マイクロモルIndo-1を加え、チューブ内の溶液を数回反転させて混合する。光から保護された37°Cで30分間の水浴インキュベーションの後、カルシウムフラックスローディングバッファの5倍の体積を加え、Indo-1標識細胞を遠心分離します。B細胞格下げの場合、抗CD5および抗B220抗体を有する染色細胞は、0.5ミリリットルの摂氏4度で20分間、光から保護された。インキュベーションの終わりに、新鮮なカルシウムフラックスローディングバッファーで細胞を洗浄し、ペレットを氷上に保存するための新鮮なカルシウムフラックスランニングバッファーのミリリットル当たり1〜2倍の細胞に再懸濁し、分析まで光から保護する。次に、キャップ付き、5ミリリットル、ラウンドボトム、ポリスチレンチューブに0.5ミリリットルの細胞を加え、水浴でセルを摂氏37度に温めます。3~5分後、再循環水浴に接続された37°Cのウォータージャケットチャンバーにチューブを移し、フローサイトメーターのウォータージャケットでチューブを実行します。1秒あたり5,000~10,000個のイベントを収集した後、細胞を15~30秒間安定させ、データ取得を再開し、少なくとも10秒間データを収集してバックグラウンド読み取りを確立します。10秒のマークで、フローサイトメーターからチューブを素早く取り出し、抗原リポソームの適切な実験濃度を加える。次いで、細胞をパルス渦、さらに3〜5分間細胞計上の管を読み取る。動物を感作するには、コレラ毒素を含むピーナッツ抽出物200マイクロリットルを経口ギャベージを介して、週に1回4〜5週齢のBALB/c雌マウスレシピエントに3週間、第4週に希釈ピーナッツ抽出物300マイクロリットルを送達する。28日目に、PBS中の1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度にピーナッツ抽出物を調製し、直腸温度計を使用して各感作動物のベースライン体温を測定する。全ての温度を測定したら、腹腔内注射を介して各レシピエントに200マイクロリットルのピーナッツ抽出物を投与し、注射後1時間毎に直腸温度計で体温を15分ごとに測定する。体温の低下はピーナッツに対するアレルギーを示す。ピーナッツアレルギーマウスから脾細胞を単離した後、27ゲージ、5/8インチの針を備えた1ミリリットルのインスリン注射器を使用して、抽出されたアレルギー性脾細胞の7番目の10~7分の1をナイーブで無感覚化した動物の尾静脈に静脈内注射する。養子転写の翌日、アレルギー性脾細胞を受けた各BALB/cマウスの尾静脈にAra h2抗原性リポソーム200マイクロリットルを静脈内に注入する。リポソーム注射の2週間後、i.p.でマウスを高める。可溶性のAra h 2の注射、61日目に200マイクロリットルAra h 2チャレンジが続いた。次に、示されているように、直腸プローブで体温を15分ごとに測定します。タンパク質の共役は、非共役タンパク質と比較して分子量の増加を示す還元ゲルを実行することによって実証できる。抗原リポソーム刺激B細胞カルシウムフラックスを評価するために、生きた単一細胞をゲートしてB220陽性CD5陰性B細胞の選択を可能にする。時間の経過に及ぶIndo-1バイオレット対Indo-1ブルー蛍光の比を分析し、リポソーム誘導B細胞活性化の量を評価することができる。ELISAによるピーナッツ抽出物感作マウスの血清中のAra h 2特異的IgEおよびIgG1の定量化は、Ara h 2でブーストされた感受性を有するマウスが血清中に測定可能なAra h 2特異的IgEおよびIgG1を示すことを示している。Ara h 2の挑戦の間に記録された体温は、アレルギーマウスが挑戦後の体温の低下を示し、ナイーブマウスの体温は一貫していることを明らかにする。この手順を試みる間、タンパク質が多すぎると押出しが困難になる可能性がありますので、リポソームに組み込まれる脂質結合タンパク質の量を慎重に追跡することが重要です。この手順に従って、アレルゲン特異的BおよびT細胞の追跡および並べ替えのような他の方法を実行して、これらのアレルゲン特異的細胞が治療にどのように反応するかについての追加の質問に答えることができる。この技術は、アレルギー分野の研究者がこのマウスモデルを使用してアレルギー疾患と闘う新しい免疫療法を探求する道を開くでしょう。コレラ毒素を使用すると危険であり、その使用のためのガイドラインは、あなたの地元の制度的生物学的安全基準に従う必要があることを忘れないでください.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

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IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

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Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートによる標的抗体遮断

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...