Name: antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies at JoVE.com

Denna forskning stöds av bidrag från Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 och W81XWH-16-1-0303).

Den allmänna metoden för koppling protein till lipid och införliva i liposomer bygger till stor del på tidigare arbete15. Alla djur förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av University of North Carolina at Chapel Hill institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC). Alla möss används i jordnötsallergi modellen är BALB/cJ honor köpta från vid 3 veckors ålder. University of Alberta djur vård och använda kommittén (ACUC) har godkänt experiment med användning av mu...

<ol>
	<li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence,+severity,+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States.">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li><li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=US+prevalence+of+self-reported+peanut,+tree+nut,+and+sesame+allergy:+11-year+follow-up.">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy:+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization.">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li><li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy.">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).</li><li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults.">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).</li><li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy:+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response.">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li><li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+(STOP+II):+a+phase+2+randomised+controlled+trial.">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li><li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li><li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model.">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li><li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis.">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li><li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2.">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li><li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy.">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li><li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea,+Ara+h+2+and+Ara+h+6,+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice.">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li><li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2.">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li><li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes.">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li><li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development.">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li><li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy.">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li><li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms.">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li><li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).</li><li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG/peanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy.">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li><li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice.">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li><li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+and+autoimmunity.">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li><li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+myasthenia+gravis:+utility+and+limitations.">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system.">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li><li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis.">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li><li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis.">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li></ol>

De metoder som beskrivs här är ett allmänt protokoll för konjugationen av ett protein till en lipid som möjliggör visning av proteinet på liposomalt nanopartiklar. För mycket stora multi subenhet proteiner, har detta protokoll begränsad nytta. Den idealiska metoden skulle vara införandet av en platsspecifik tagg som möjliggör en biorthogonal kemisk länka strategi som ska användas. Om uttrycker proteinet recombinantly, kan detta vara möjligt med hjälp av tillgängliga platsspecifika strategier<sup class="x...

Matallergi påverkar 8% av barnen i USA, och har ökat i prevalens under senaste decenniet1. Allergi mot jordnöt drabbar 1% av barn och är inte vanligtvis urvuxna2. Även om flera lovande kliniska prövningar pågår för behandling av födoämnesallergi, inklusive orala immunterapi (OIT), sublingual immunterapi (SLIT) och epikutan immunterapi (EPIT), finns det för närvarande ingen FDA-godkända behandlingsstrategier för okänsliggöra jordnöt-allergiska personer3,4,5,6,7,8. Allergiska personer måste därför strikt undvika allergener för att undvika anafylaxi. Många frågor återstår när det gäller rutter av sensibilisering och underliggande mekanismer av mat allergi utveckling.
Musmodeller är ett värdefullt verktyg för studerar mekanismer för allergi samt utveckla nya tolerogena och hyposensibilisering terapier9,10,11,12. Detta gäller särskilt eftersom det stor jordnöt allergenet (Ara h 2; Ah2) hos människa är också det dominerande allergenet i flera beskrivs mus modeller13,14. Medan musmodeller av jordnötsallergi är ovärderligt för att studera mekanismer av sensibilisering och tolerans, är en nackdel att de kan vara variabel och kräver användning av tillsatsmedel. Mer potent immunogens skulle vara ett sätt att minimera det inneboende variabilitet av sådana modeller. Eftersom B-celler aktiveras starkt av multivalenta antigener, är antigen liposomer visar allergen ett bra alternativ på grund av deras förmåga att potentiellt aktivera B-celler via B-cells receptor (BCR) medan också har egenskapen för effektivt grundning T-cell kupén genom tas upp icke-specifikt av antigen-presenterande celler.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för konjugera proteinantigener för liposomalt nanopartiklar med en lättköpt och modulär strategi. Använda en surrogat antigen, anti-IgM Fab-fragment, vi visar hur potent sådant antigen liposomer kan vara stimulerande B-cells aktivering. Antigena liposomer visar Ah2 antigen användes för att utveckla en ny musmodell av tillerkänner känslighet. I denna modell överförs splenocytes från verifierade jordnöt allergisk möss, som innehåller jordnötter-specifika minne B - och T-celler, till naiva congenic möss. Minne-antikroppssvar induceras av injektion av liposomer konjugerat med Ah2 in mottagarens möss, för att inducera antikroppar mot Ah2. Följt av endast en boost med lösliga Ah2, ger Ah2-specifika antikroppar upphov till en stark anafylaktisk reaktion när dessa möss utmanas därefter med Ah2. Möss som genomgår den allergiska reaktionen reagerar mycket enhetligt och inte har fått ett adjuvans, detta tillvägagångssätt är en önskvärd jordnötsallergi modell och resultaten tyder på att det kan ha nytta i andra musmodeller som drivs av antigener som riktas allergener och eventuellt autoantigener.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Sigma grade 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPDP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG 18:0</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG Maleimide</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td>1mL syringe with holder/heating block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.1 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 0.8 &#181;m</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Filter Supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>6100014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Round Bottom Flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z100633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnover stoppers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-301398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P-198194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur Lock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>k4201634503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G50 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17004201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G100 Beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I1203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td>without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-006-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut flour</td>
			<td>Golden Peanut Co.</td>
			<td>521271</td>
			<td>12% fat light roast, 50% protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal feeding needles</td>
			<td>Cadence Science</td>
			<td>7920</td>
			<td>22g x 1.5&#34;, 1.25 mm - straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe for mice</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>Ret-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin, from vibrio cholera</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>100B</td>
			<td>Azide free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Stop Solution</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-85-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Immulon 4HBX plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified soluble Ara h 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA-DNP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgE anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>BYA60251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-Mouse IgE</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>PC284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>JNS065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin Protein, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 anti-DNP</td>
			<td>Accurate Chemical</td>
			<td>MADNP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329412</td>
			<td>U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-14</td>
			<td>25 x 75 x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 &#956;m Nylon, White, Sterile, Individually packaged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>10 gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS buffer, 4X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigenic liposomes for generation of disease-specific antibodies

Antikroppssvar ge kritiska skyddande immunitet mot ett brett spektrum av patogener. Det finns fortfarande ett stort intresse i att generera robusta antikroppar för vaccination samt förstå hur patogena antikroppen Svaren utvecklar allergier och autoimmuna sjukdomar. Generera robusta antigen-specifika antikroppen svaren är inte alltid trivial. I musmodeller kräver det ofta flera rundor av vaccinationer med adjuvant som leder till en hel del variation i nivåerna av inducerade antikroppar. Ett exempel är i musmodeller av jordnötter allergier där mer stabila och reproducerbara modeller som minimerar mus nummer och användning av adjuvant skulle vara fördelaktigt. Presenteras här är en mycket reproducerbara musmodell av jordnötsallergi anafylaxi. Denna nya modell bygger på två viktiga faktorer: (1) antigen-specifika splenocytes överförs adoptively från en jordnöt-sensibiliserad mus till en naiv mottagarens mus, normalisera antalet antigen-specifika minne B - och T-celler över ett stort antal möss; och (2) mottagaren möss är därefter boostade med en stark multivalenta immunogen i form av liposomalt nanopartiklar visar det stor jordnöt allergenet (Ara h 2). Den stora fördelen med denna modell är dess reproducerbarhet, vilket i slutändan minskar antalet djur som användes i varje studie, samtidigt minimera antalet djur flera injektioner av adjuvans. Modulär montering av dessa immunogent liposomer ger relativt lättköpt anpassningsförmåga till andra allergiska eller autoimmuna modeller som innebär patogena antikroppar.

Böjningar av proteinet av intresse med DSPE-PEG(2000) kan påvisas genom att köra en reducerande visar en ökning i molekylär vikt jämfört med proteinet okonjugerat. Figur 1A visar en representativ gel av antimus IgM F(ab) fragment konjugation till PEG-DSPE, som visar en 2 – 3 kDa bandshift för denaturerat protein. Observera att cirka 50% av proteinet visas ändras, vilket är väntat med tanke på att 1:1 stökiometri uppnåddes på den Fab-fragment ...

Watch this Scientific Journal Video about Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies at JoVE.com

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Beskrivs är utarbetandet av antigena liposomalt nanopartiklar och deras användning i stimulerande B-cells aktivering in vitro- och in-vivo. Konsekvent och robust antikroppssvar ledde till utvecklingen av en ny jordnötsallergi modell. Protokollet för att generera antigena liposomer kan utvidgas till olika antigener och immunisering modeller.

Antigena liposomer för generering av sjukdom-specifika antikroppar

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom immunologi, till exempel hur är vita blodkroppar aktiveras, och hur utvecklas allergier mot enskilda allergener? Den största fördelen med denna robusta och reproducerbara allergi musmodell är att färre möss kan användas för att ge en lägre varians med en experimentell population. Nya immunterapier för att kontrollera immunsvar kräver robusta musmodeller som ett första sätt att testa in vivo-effekt.Således, konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot allergi immunterapi. Även om denna metod kan ge insikt i allergier, det kan också tillämpas på andra system, såsom autoimmunitet där oönskade antikroppssvar spelar en nyckelroll i sjukdomen. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa på grund av bristande erfarenhet av att arbeta med liposomala nanopartiklar eller en oerfarenhet med de tekniker som krävs i musen arbete.Börja med att lägga till 2,5 molar motsvarande heterobifunktionella crosslinker till proteinet och placera reaktionen på en oscillerande shaker vid rumstemperatur i ungefär en timme. Efter en timmes inkubation med SPDP, avsalta proteinet på en kolumn ekvilovillig i 100-millimolar natriumacetat, och samla in fraktionerna. Bestäm 280-nanometerabsorbans, och poola de översta fraktionerna.Tvätta kolonnen i PBS, och tillsätt 25-millimolar dithiothreitol, eller DTT, till poolade proteinfraktioner för en fem till 10-minuters inkubation. Mät sedan proteinens 280 och 343-nanometerabsorbanser för att möjliggöra beräkning av länkningsförhållandet baserat på proteinets molaritet och länkaren. Därefter kör de poolade fraktionerna av den PBS-tvättade kolumnen och samla in fraktionerna för mätning av 280-nanometern och toppfraktionspoolen som visas.Tillsätt lämplig volym av 100x DSPE-PEG2000-Maleimide till proteinet för att uppnå en 1x, 10-faldig molaröverskottsförskottskoncentration med skonsam virvlande. Kör sedan reaktionen över natten under kväve i en förseglad rund bottenkolv. Följande dag, kör proteinet över en crosslinked dextran gel pärla pärla kolumn, och lagra den slutliga poolade fraktioner av lipid-linked protein vid fyra grader Celsius tills de används.När den korrekta mängden av varje lipid har beräknats, kombinera alla lipider i en 12-milliliter borosilikat glas provrör, och använda en tre-milliliter spruta och slangar för att försiktigt blåsa kloroformen bort med kväve. Sedan, lyophilize lösningen med 100 mikroliter av DMSO över natten. Nästa morgon, tillsätt en milliliter lipid-länkade protein till 12-milliliter lipidrör, och sonikera lösningen tre till fyra gånger i 30 till 60 sekunder per ultraljudsbehandling i en ultraljudsbehandling vattenbad med minst fem minuters vilar mellan sonications.Efter den sista ultraljudsbehandling, ladda provet i en av de extrudersprutor som placeras i extrudern, och placera extrudersprutan i den andra änden av extrudern. Den tomma sprutan kommer att fylla som lipiden är extruderad genom polykarbonat 0,8-mikrometer membran. Placera den färdigmonterade extrudern i ett värmeblock och tryck försiktigt ned kolven för att tömma sprutan.Efter den sista extrudering, överför liposomer till en ren injektionsflaska, och extrudera lipider genom polykarbonat 0,2 och 0,1-mikrometer membran som just visat. Sedan, lagra liposomer på fyra grader Celsius. För att övervaka B-cells svar på antigena liposom aktivering, resuspend 1,5 gånger 10 till den sjunde splenocyterna i kalcium flux lastning buffert, och lägga till 1,5-mikromolar Indo-1 till cellerna, invertera lösningen i röret flera gånger för att blanda.Efter en 30-minuters vattenbad inkubation vid 37 grader Celsius, skyddad från ljus, tillsätt fem gånger volymen av kalcium flux lastning buffert, och centrifug indo-1-märkta celler. För B-cellsgreating, fläckceller med anti-CD5 och anti-B220-antikropp i 0,5 milliliter lastningsbuffert vid fyra grader Celsius i 20 minuter, skyddade från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna i färskt kalcium flux lastning buffert, och återanvända pelleten på en till två gånger 10 till den sjunde celler per milliliter av färskt kalcium flux kör buffert för lagring på is, skyddas från ljus fram till analys.Därefter lägger du till 0,5 milliliter celler till ett tak, fem milliliter, rundbottens, polystyrenrör och värm cellerna till 37 grader Celsius i ett vattenbad. Efter tre till fem minuter, överför röret till en 37-graders Celsius vattenmantlat kammare ansluten till en recirkulerande vattenbad, och kör röret i vatten-jacka på flödet cytometer. Efter att ha samlat in 5, 000 till 10, 000 händelser per sekund, tillåta cellerna att stabiliseras i 15 till 30 sekunder, och initiera datainsamlingen, samla in data i minst 10 sekunder för att upprätta en bakgrundsläsning.Vid 10-sekundersmärket, ta snabbt bort röret från flödescytometern, och tillsätt lämplig experimentell koncentration av antigena liposomer. Sedan, pulsvirvel cellerna, och läsa röret på cytometern i ytterligare tre till fem minuter. För att sensibilisera djuren, leverera 200 mikroliter av jordnötsextrakt som innehåller koleratoxin via sondmatning till varje fyra till fem veckor gamla BALB / c kvinnliga musmottagare en gång i veckan i tre veckor och 300 mikroliter av utspädd jordnöt extrakt i den fjärde veckan.På dag 28, förbereda jordnöt extrakt till en slutlig koncentration av ett milligram per milliliter i PBS, och använda en rektal termometer för att mäta baslinjen kroppstemperaturen för varje sensibiliserat djur. När alla temperaturer har mätts, administrera 200 mikroliter jordnötsextrakt till varje mottagare via intraperitoneal injektion, och mäta kroppstemperaturen med rektalstermometern var 15 minuter i en timme efter injektion. Ett dopp i kroppstemperatur indikerar en allergi mot jordnötter.Efter att ha isolerat splenocyter från de jordnötsallergiska mössen, använd en en milliliter insulinspruta utrustad med en 27-gauge, 5/8-tums nål för att intravenöst injicera 1,5 gånger 10 till den sjunde av de extraherade allergiska splenocyterna i svansvenerna hos naiva, utan stödda djur. En dag efter adoptivöverföring injicera intravenöst 200 mikroliter av Ara h 2 antigena liposomer i svansvenen hos varje BALB/c mus som fick de allergiska splenocyterna. Två veckor efter liposominjektionen, boosta mössen med en i.p.injektion av lösliga Ara h 2, följt av en 200-microliter Ara h 2 utmaning på dag 61. Mät sedan kroppstemperaturen med rektalsonden var 15:e minut som den visas. Proteinkonjugering kan påvisas genom att köra en reducerande gel som visar en ökning av molekylvikten jämfört med det oskadade proteinet.För att bedöma den antigena liposomsockperade B-cells kalciumfluset, grind de levande enstaka cellerna för att tillåta val av de B220-positiva CD5-negativa B-cellerna. Förhållandet mellan Indo-1 violett kontra Indo-1 blå fluorescens över tiden kan sedan analyseras för att bedöma mängden liposom-inducerad B-cells aktivering. Kvantifieringen av Ara h 2-specifika IgE och IgG1 i serumet hos jordnötsextrakt-sensibiliserade möss av ELISA indikerar att möss med förlänad känslighet som är boostade med Ara h 2 uppvisar mätbara Ara h 2-specifika IgE och IgG1 i deras serum.Kroppstemperaturer som registrerats under Ara h 2-utmaningen visar att allergiska möss visar sänkta kroppstemperaturer efter utmaningen, medan kroppstemperaturen hos naiva möss förblir konsekventa. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att noggrant hålla reda på mängden lipid-linked protein införlivas i liposomer, som för mycket protein kan göra extrudering svårt. Efter detta förfarande, andra metoder som spårning och sortering av allergen-specifika B och T-celler kan utföras för att svara på ytterligare frågor om hur dessa allergen-specifika celler svarar på terapier.Denna teknik kommer att bana väg för forskare inom allergiområdet att utforska nya immunterapier som bekämpar allergiska sjukdomar med hjälp av denna musmodell. Glöm inte att det kan vara farligt att arbeta med koleratoxin och att riktlinjerna för dess användning bör följas enligt dina lokala institutionella biologiska säkerhetsstandarder.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

IgY Teknik: Utvinning av Kyckling Antikroppar från äggula med polyetylenglykol (PEG) Nederbörd

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Metodik för effektiv generering av fluorescerande märkta vacciniavirusproteiner

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generering av murina monoklonala antikroppar genom hybridomteknik

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generation av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Riktad antikropp blockering av en dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...