Name: contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

作者没有确认。

1. 细胞板的制备
注: 准备细胞板 3-4 周前的药物影响的测量。
<ol><li>实验0天 注意: 为了进行规划, 测试复合应用程序可以在实验的22天-28 之间的任何一天执行。<ol>
<li>打开水浴在37摄氏度和温暖40毫升电镀介质 (由制造商提供)。 注: 将单元格与供应商提供的匹配区域性和维护媒体一起使用。</li>
		<li>将含有冷冻细胞的 cryotubes 在水浴中放置2分钟, 解冻 hiPSC 厘米。</li>
		<li>将1毫升细胞悬浮液小心转移到50毫升锥形管上。</li>
		<li>用1毫升的温热电镀培养基洗涤每个 cryotube, 从含有细胞的步骤1.1.3 中提取剩余的细胞并将洗涤介质添加到同一个锥形管中。</li>
		<li>仔细混合另8毫升温暖电镀介质到细胞悬浮液中。</li>
		<li>使用台盼蓝排除方法和 hematocytometer8计数活细胞。 注意: 一个384孔细胞板的 6 x 106细胞的要求考虑了在冰冻细胞中多达20% 个死细胞的可能性, 这是我们的经验中最大的。</li>
		<li>将细胞悬浮液调节至 5 x 105活细胞/毫升, 并使用温热电镀介质。</li>
		<li>将细胞悬浮液分配到两个384孔细胞板中, 每孔添加25µL (每孔约12500个细胞)。 注: 电池板不需要与任何矩阵覆膜 (参见讨论)。</li>
		<li>在含有 5% CO2的加湿气氛中保持37摄氏度的细胞板。</li>
	</ol>
</li>
	<li>实验1天<ol>
<li>打开水浴在37摄氏度和温暖50毫升的维护培养基补充1% 伏/v 青霉素-链霉素溶液。</li>
		<li>在每个孔板中, 用50µL 的热维护介质代替电镀介质。</li>
	</ol>
</li>
	<li>实验的天数 2-21 (最多27天) 注意: hiPSC-CMs 不需要任何传代在此期间, 因为他们是非分裂细胞。<ol>
<li>每 2-3 天续订一半维护介质, 并在7、14和21天内完全续订。 注: 荧光测量可在实验的22和28天之间进行。较长的持续时间尚未尝试, 但可能仍然正常。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 仪器、复合板和测定板的制备
注: 在测定药物效果的当天, 在实验的22和28天之间准备仪器、复合板和检测板。使用带有温度控制的荧光板读卡器和适当的荧光过滤器套件和激发光源。例如, 使用 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 荧光过滤器套件 (激励: 472 nm; 发射: 520-560 nm) 和 150 W 励磁光源单元。
<ol><li>至少2小时前, 第一个细胞板被放置在板读取器内进行测量, 打开读卡器, 并设置在37摄氏度的供暖系统。 注意: 这也可以在前一天晚上完成。</li>
	<li>准备阳性对照, 毛佛司, N6-cyclopentyl-adenosine 和 E-4031 作为库存解决方案0.33 毫米在 dmso, 10 毫米在 dmso, 和3.33 毫米在 H2O, 分别。 注: 库存解决方案将被稀释333倍的时间, 他们被添加到细胞, 目的是达到最终测试浓度1µM 毛佛司, 30 µM N6-cyclopentyl-adenosine, 和10µM E-4031, 这产生可靠和可重现的效果。</li>
	<li>将352种测试化合物作为 DMSO 库存解决方案准备333倍的计划测试浓度 (例如, 10 mM 测试在30µM)。 注: 目的是在复合应用后, 在细胞板中达到 0.3% (v-/v) DMSO 的最终浓度;这是最高的 DMSO 浓度, 不影响心肌细胞的节奏活动。库存解决方案也可以在前一天进行准备。每个重复测量需要至少5µL 的库存解决方案。</li>
	<li>准备复合板。<ol>
<li>温40毫升的维护培养基, 辅以1% 伏/v 青霉素-链霉素溶液室温。</li>
		<li>通过增加1.5 µL 的库存溶液, 分别分布到两个384孔复合板中: i) 测试化合物 (两个孔各), ii) 阳性对照组 (毛佛司, N6-cyclopentyl 腺苷, E-4031, 每复合板四孔), iii) 负控制 (DMSO, 每复合板20孔)。</li>
		<li>将复合板离心 100 x g , 1 分钟。</li>
		<li>在室温下添加37µL 的维护介质到每个井 (3.9% DMSO 在38.5 µL 在该阶段)。</li>
		<li>将复合板离心 100 x g , 1 分钟。</li>
		<li>将复合板加载到板读取器中。 注: 应尽快执行后续步骤, 以最小化复合板中的蒸发。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备荧光染料。<ol>
<li>打开水浴在37摄氏度和温暖100毫升的维护培养基补充1% 伏/v 青霉素-链霉素溶液。</li>
		<li>用10毫升的热维护培养基和抗生素重组 Ca 敏感荧光染料和止渴。 注: 此股票荧光培养基含有钙敏感荧光染料, 通常 Fluo-4 和止渴, 任何残留物都可以储存在4摄氏度至少5天。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 数据采集
注: 在药物效果测量当天执行数据采集。对第一个细胞板完全执行步骤 3.1-. 10, 然后对第二个单元格板重复它们。
<ol><li>启动板读取器软件 (如果需要) 并加载吸管提示。</li>
	<li>调整软件设置, 记录2分钟的钙波段, 采集频率至少为10赫兹, 以确定每个油井的基线跳动率。</li>
	<li>对于一个细胞板, 稀释3毫升的股票荧光培养基成12毫升的热维护培养基与抗生素, 使荧光培养基。</li>
	<li>用30µL 荧光培养基取代20µL 的培养基。</li>
	<li>移液器上下1x 混合。</li>
	<li>尽快将电池板放入板读卡器, 让 hiPSC 适应到温度。</li>
	<li>在开始数据采集之前等待60分钟。</li>
	<li>在板读取器软件中开始数据采集, 以记录至少 10 Hz 的采集频率的 Ca 波的2分钟段, 以定义每个井的基线跳动速率。 注: 对于每个记录序列, 确保在数据采集后, 电池板不会自动从设备中转移出去。这样可以防止电池板在室温下冷却。有了一些版本的平板阅读器软件, 可能有必要停止每一个录音之前, 它完全结束, 以实现这一点。</li>
	<li>通过将5µL 从复合板移入细胞板 (加入后, DMSO 浓度为 0.3% [v/v]), 将测试和参考化合物与平板读卡器机器人一起添加。</li>
	<li>在板读取器软件中启动数据采集, 记录2分钟的 Ca 波段, 在化合物添加后开始大约5、15、30、45和60分钟 (确保每一次电池板停留在设备中)。</li>
</ol>4. 数据分析
注意: 数据分析可以在测量后的任何时间执行。
<ol><li>将每个录制期间的原始数据从平板阅读器软件导出为 ASCII 文本文件。</li>
	<li>将原始数据导入数据分析软件。</li>
	<li>对于每个井和所有时间点, 提取主要跳动频率。 注: 使用材料表中列出的数据分析软件, 可以使用 LombPeriodogram 函数在自定义分析例程中计算跳动频率, 方法是基于最小二乘法光谱分析的 Lomb–Scargle 法7.周期图应计算在0.01 和 5 Hz 之间的频率范围。可以使用 PeakAutoFind 例程从周期图中提取主频率。这种分析方法比使用平板读卡器软件提供的方法更精确地测量跳动频率。但是, 如果软件自定义不是选项, 则仍可使用后者。</li>
	<li>将数据分析软件中每个记录期间的主要跳动频率导出为剪贴板副本或 ASCII 文本文件。</li>
	<li>通过剪贴板粘贴或文本文件导入, 将主要跳动频率导入电子表格软件。 注意: 可以在任何现代电子表格软件中执行步骤 4.5-4.9。</li>
	<li>对于每一个井, 规范化, 以基线的跳动频率在药物应用后的每个时间点 (5, 15, 30, 45 和60分钟) 通过除以主要跳动频率在该时间点由初级殴打频率在基线。</li>
	<li>在药物应用 (5、15、30、45和60分钟) 后的每个时间点计算平均 dmso 效应, 方法是对采用 DMSO 的20孔的规范化值进行平均。</li>
	<li>在药物应用 (5、15、30、45和60分钟) 之后的每一个井和每个时间点, 减去同一个板块的平均 DMSO 效应 (时间匹配)。</li>
	<li>重复测量的平均值。 注: 如果化合物改变频率或软件在复合添加后找不到主频率, 则对跳动模式的目视检查可以评估该化合物是否产生心律失常。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+their+derivatives:+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research.">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li><li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+An+In-Vitro+Model+to+Predict+Cardiac+Effects+of+Drugs.">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).</li><li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells.">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li><li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Lomb-Scargle+Periodogram.">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+blockers+and+calcium+channels.">Calcium channel blockers and calcium channels.</a> Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).</li><li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs.">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li><li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels.">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li><li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue.">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

两个方面对于成功录制跳动频率至关重要。第一种是对细胞的电镀和培养保持警惕。特别是, 在交换介质时, 尽量避免刮伤井底的细胞层是很重要的。使用移液器接触井底是可以接受的, 但每次都要使用相同的角度, 从而只在细胞层产生微小的划痕, 而不会影响检测性能。获得可重现的均匀节律的第二个关键方面是在测量期间, 在电池板上提供37摄氏度的良好温度控制。我们无法使用此处使用的平板阅读器以外的设备获得这种均匀性, 但在对温度调节进行特殊修改时可能是可行的: 它将使此处提供的协议更广泛地适用于单一品牌的板读者。为了在实验期间达到温度稳定性, 在这里使用的设备, 有必要停止每一个记录, 在它结束之前;否则, 机器人将弹出测量的细胞板。此技术问题可能会随下一版版读卡器软件而消失, 但现在仍然至关重要。如果电池板被错误地转移到板读取器外, 它必须尽可能快地装回内部。然而, 实验的质量会恶化, 因为温度变化会非常迅速地影响跳动速率。
其他一些尚未彻底测试的方面可能不那么重要。例如, hiPSC 制造商建议在细胞播种之前先涂覆细胞培养板, 但在这种特定的检测中, 不使用涂层, 因为细胞在各种表面上粘着很容易, 而且很难正确涂384孔。板。然而, 细胞板涂层可能仍然是允许的, 或者甚至可以提高检测质量。我们也从未测试过 DMSO 以外的溶剂是否可以接受, 但从其他记录技术的经验来看, 类似浓度的乙醇或甲醇也可以耐受。我们通常使用来自同一个制造商的 hiPSC CMs, 只有一个额外供应商的细胞被测试, 这似乎是以类似的方式工作。同样, 我们只使用了少量不同批次的 hiPSC-CMs, 通过 prechecking 它们来验证它们是否与初始批次相似。一个或两个批次被认为是不合适的, 因为它们的较多在这里使用的文化条件下稳定性差或重现性较差。否则, 在测试有限的 "典型" 化合物 (毛佛司、N6-cyclopentyl 腺苷和 E-4031, 以及内皮素、异丙肾上腺素、氨氯地平和 ponesimod) 时, 药理学在批次中显得非常相似。我们只使用来自健康捐赠者的 hiPSC。评估患有心脏病患者的 hiPSC 是否会提供不同的结果可能是值得的, 尽管在评估酪氨酸激酶抑制剂的心脏毒性时, 健康捐献者和患者之间没有区别12. 最后, 在测量药物效果之前, 我们通常在文化中等待22–28天: 在我们的经验与相同细胞的阻抗记录, 一个稳定状态的慢阻抗 (一个指标的细胞层稳定性) 和快速阻抗 (指标跳动频率) 在 12-15 天的文化中达到。然而, 我们决定等待 22-28 天, 因为这是时间时, 心脏通道和成熟标记的表达谱已经稳定了13。如果这些细胞在较早或更高的时候被使用, 则不研究是否可以获得比较的结果。
这里描述的协议使用非常直接的测量 hiPSC 的自发跳动率, 以评估潜在药物对人心电生理的影响。与其他方法相比, 它的主要优点是, i) 它是适于高通量筛选环境, ii) 它记录心肌细胞的活动和药物在生理温度下的影响, iii) 不需要用于执行或评估结果的电生理专业知识。
在经批准用于人类使用的许多药物进行的验证研究中, 我们表明, 该检测对人类药物中使用的药物作出反应, 这是现有临床数据5所预测的。因为这种方法考虑所有潜在的影响心脏节律, 它补充了全面的体外致心律失常测定 (CiPA) 倡议14 , 具体评估亲心律失常潜能。
今后, 该方法可以进一步了解药物的作用方式, 从而影响自发跳动率。在 Ca 瞬变的荧光记录 (例如, 在其振幅或形状) 中, 可能会出现额外的机械信息。如果荧光记录以更高的采集速率 (例如, 30 Hz) 进行, 除了跳动速率, 这些参数也很容易提取, 并且将这些参数中的变化与已知的影响关联起来可能很有趣。临床使用的药物。

本议定书描述了一种测量药物对 hiPSC 较多自发跳动频率的生理相关节律的方法。人诱导的多能干细胞可以分化成功能性心肌细胞,在体外建立自发跳动的较多1、2、3、4。这些 hiPSC 可以通过商业提供商或实验室的生产大量获得, 它们是产生人体心脏生理学和药理学模型的有用的细胞来源。特别是, 它们可以用来预测或描述当药物被施用到人类5时可能发生的心脏效应。
hiPSC 较多的跳动频率可在生理条件下使用微电极阵列或阻抗传感1: 这些无创技术提供了关于药物作用的非常详细的信息, 但它们相当低吞吐量, 它们不允许在实际时间和预算限制内测试大型复合库。使用384孔荧光成像板读取器和 Ca 敏感染料6, 可以更有效地阐述系统, 但经典的板读器受温度控制和采集频率的影响而受阻。这些限制由 unphysiological 跳动率 (约 15 bpm, 与受控环境1中的 35–55 bpm 相比) 和较差的 Ca 信号分辨率 (8 Hz 的采集频率处于下限, 以记录可达到 120 bpm 的速率) 为例。在受刺激的条件下, 它不能提取信息, 如坡度或持续时间)。这里描述的方法结合了跳动模式的记录在生理节律和足够的分辨率, 以排除这些问题。
在积极的一面, 这种方法是简单, 可靠, 高通量, 这允许快速测试大量的化合物, 在合理的成本。在负面方面, 该方法要求快速板读取器具有有效的温度控制, 这是一个昂贵的投资, 它提供了很少的机械信息观察到的药物效应, 这可能需要进一步测试更详细的方法。
近似 6 x 106 hiPSC 厘米是需要一个测量在一个384孔细胞板。hiPSC-厘米通常提供商业作为冷冻等份约 4 x 106细胞1毫升。因此, 用三冷冻等份制备两个细胞板是很方便的。在大多数情况下, 由于这种检测的低变异性, 它是足以执行重复测量的测试化合物和, 在每个细胞板, 四份测量阳性对照 (毛佛司, N6-cyclopentyl-adenosine, 和 E-4031), 和20-折扇状测量阴性对照 (DMSO 单独)。因此, 最多可以用两个384孔的细胞板评估352种化合物/浓度对。下面的协议认为这样的实验使用352测试化合物, 两个细胞板和1200万细胞提供作为三冷冻等份;如果需要额外的数据点, 可以很容易地对其进行扩展。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

人诱导的多潜能干细胞 (hiPSC) 自发收缩心肌细胞较多是人类心脏生理学和药理学的一个有用的模型。已经提出了各种方法来记录这种自发活动和评估药物效果, 但是这些方法中的许多都受到有限的吞吐量和/或生理相关性的影响。我们开发了高通量筛选系统, 利用 Ca 敏感荧光染料和温度控制成像多孔板读取器, 量化外源化合物对 hiPSC 的跳动频率的影响。我们描述如何制备细胞板和复合板以及如何运行自动检测以实现高灵敏度和重现性。本文还介绍了如何对荧光数据进行转化和分析, 为药物对自发节律的影响提供可靠的措施。此检测可用于药物发现程序, 以指导化学优化远离或朝向影响人心功能的化合物。

图 1显示了在一个384孔板上的基线上的 Ca 波的代表性记录。在大多数情况下, 所有油井显示正常跳动速率, 在整个板块上几乎没有变化 (平均± SD = 40.1 ± 3.5 bpm; 范围 = 34–54 bpm)。偶尔 (少于1个10个实验), 几个井 (小于 5) 有心律失常或缺乏节奏。在三384孔板中, 我们还尝试了其他供应商的心肌细胞 (见材料表), 并获得了非常相似的自发跳动基线值。
心脏离子通道阻断剂以可重现的方式影响心肌细胞的节律5。氨氯地平, 缓慢的 Ca 通道9的阻滞剂, 加速节奏超过100% 在浓度依赖性的方式高达1µM (图 2A)。这一效果在前5分钟内很好地发展, 但在稳定前的30分钟内仍会增加近似50%。在1µM 以上, 氨氯地平逮捕殴打 (虚线), 从事实可以预料, Ca 骑自行车是关键的自发收缩。其他选择性二氢吡啶 Ca 通道阻滞剂产生非常相似的效果。
E-4031, 一个快速延迟整流器 K 通道10的拦截器, 以浓度依赖性的方式将节奏减慢 65-70%, 达到10µM (图 2B)。效果在前5分钟内发展, 在接下来的60分钟内不会发生变化。其他选择性克郎阻滞剂产生类似的效果, 虽然最大降低率可能会有所不同 (例如, 35-40% 的西沙必利, 70% 为 E-4031, 和 90%-95% 特)。这种差距的基础是未知的。
河豚毒素是快速 Na 通道11的阻断剂, 以浓度依赖性的方式减速约15% 的节奏, 高达 1-30 µM (图 2C)。这一效果在前5分钟内很好地发展, 在未来60分钟内不会有很大变化。然而, 超过30µM, 河豚毒素在前5分钟内逮捕殴打, 而在30分钟后, 它逮捕它超过1µM。其他 Na 通道阻滞剂, 如利多卡因或美西律, 产生类似的全效或无效果。
Bepridil 是心脏 Na、Ca 和 K 通道9的混合阻滞剂, 它也产生了全无效应 (图 2D)。这表明, 在这一准备过程中, Na 通道块是 bepridil 的主要作用。由于 Ca 通道块的加速度未被看到, 并且由于克郎块而导致的更渐进的减慢会被 Na 通道效应掩盖。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> 图 1: 在384孔板上的代表性基线 Ca 波.(A) 整个板块上的所有水井都表现出正常的跳动率, 变化不大。此图像直接从平板读卡器软件捕获。每个跟踪都是十年代的持续时间。荧光强度是任意的 (相对光单位从视频摄像机灰度)。(B) 十年代的一条迹线的爆炸显示信号的低噪声。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> 图 2: 心脏离子通道阻滞剂的代表性影响.这些面板显示浓度-响应曲线与 (A) 选择性 Ca 通道阻滞剂氨氯地平, (B) 选择性克郎阻滞剂 E-4031, (C) 选择性 Na 通道阻滞剂 TTX, 和 (D) 非选择性通道拦截器 bepridil。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>

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Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

人诱导的多潜能干细胞自发收缩心肌细胞较多是人类心脏生理学和药理学的有用模型。在这里, 我们提出了一个高通量的筛选系统, 以量化的影响, 外源化合物对跳动频率, 使用 Ca 敏感荧光染料和温度控制成像多孔板读取器。

温度控制384孔板中用 Ca 敏感荧光染料测定人 iPSC 的心肌细胞较多的收缩

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

该方法有助于回答心脏安全药理学领域关键问题。例如，新的人类药物有改变正常心脏节律的风险吗？该技术的主要优点是，它可以快速评估大量的化合物，并以中等成本。演示这个程序的将是卡米尔·唐尼，我实验室的一名副研究员。为了准备测量人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（HIPSCCMs）的同步收缩，首先将含有冷冻细胞的冷冻管放在37摄氏度的水浴中两分钟。将整个解冻的细胞悬浮液从每个管转移到一个单一的、新鲜的 50 毫升锥形管。要取回剩余的细胞，请用一毫升37摄氏度的预预热电镀介质清洗每个管，并将这种介质添加到含有解冻细胞的50毫升锥形管中。在管子中加入八毫升热电镀介质，小心地混合悬浮液。使用 trypan 蓝色排除方法和血细胞计来计算活细胞。通过添加暖电介质，将浓度调整为每毫升5万个细胞。要将细胞分布到两个新的384孔细胞培养板中，每孔加入25微升，每井将产生约12，500个细胞。在加湿的大气中384孔板块中，用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞，共3至4周。第二天，用50微升的暖质维护介质更换电镀介质。之后，每两到三天更换一半的维护介质。第7天、第14天和21天，完全更换介质。一旦细胞在培养中维持三到四周，它们就自发地收缩，并且可以测量化合物对这些收缩的影响。在测定当天，在第一个单元板被放入板读取器内进行测量之前至少两个小时，打开读卡器，将加热系统设置为 37 摄氏度。要准备复合板，温暖至室温40毫升的维护介质，辅以1%体积的青霉素链霉素。当介质预热时，通过每孔添加 1.5 微升的库存溶液，将测试化合物和控制装置分配到两个 384 孔复合板中。将复合板在 100 G 下离心一分钟。在每个孔中加入37微升的维护介质，并在100G下再次离心板1分钟。为了准备荧光染料，在37摄氏度的水浴中加热100毫升的维持介质，辅以1%的体积青霉素链霉素。然后，将10毫升的加热介质加入钙敏感荧光染料和淬火剂的混合物中，将其重新构成库存荧光介质。启动板读卡器软件。准备软件以记录两分钟钙波段，采集频率至少为 10 赫兹。为了使每个细胞板的荧光介质，用抗生素稀释3毫升的库存荧光介质，用12毫升的暖维持介质。用30微升荧光介质在细胞板的每个井中更换20微升的介质，然后上下移液一次。紧接着，将板放入板读卡器中，让 HIPSCCM 调整至读卡器温度 60 分钟。然后，启动板读卡器软件。记录两分钟段的钙波，采集频率至少为 10 赫兹，以定义每井的基线跳动速率。在数据采集后，确保电池板不会从设备中传输出来非常重要。对于某些软件版本，您必须在录制完全结束之前停止录制。使用板读卡器机器人移液五微升的测试和参考化合物井到井从复合板到细胞板。之后，在板读卡器软件中开始数据采集，从复合物添加后 5 分钟、15 分钟、30 分钟、45 分钟和 60 分钟开始记录两分钟的钙波段。要开始数据分析，请从 ASCII 文本文件中的板读卡器软件导出每个记录周期的原始数据。然后将它们导入数据分析软件。从数据分析软件中，将每个录制周期的主要跳动频率导出为剪贴板副本。提取每个井和每个时间点的主要跳动频率。最后，通过剪贴板粘贴将跳动频率导入电子表格软件，然后继续文本协议中描述的数据分析。在一个384孔板的基线记录钙波表明，在大多数情况下，所有孔都显示有规律的跳动率，整个板块的变异性很小。当添加心脏离子通道的阻滞剂时，它们会影响心肌细胞的节奏。Amlodipine，慢钙通道的阻滞剂，以一个微摩尔的浓度依赖方式加速节奏超过100%。最重要的是，阿梅洛迪平逮捕了殴打者。E-4031，快速延迟整流剂钾通道的阻滞器以高达10微摩尔的浓度依赖方式减速约65%至70%的节奏。特特罗多毒素，一种快速钠通道的阻滞剂，以1至30微摩尔的浓度依赖方式将节奏减速约15%，而超过30微摩尔的四多毒素则会在第五分钟内停止殴打。Bepridil是心脏钠、钙和钾通道的混合阻滞剂，也会产生全有或全无效应，表明钠通道阻滞是百丙草的主要作用。在尝试此过程时，在细胞培养板中移液时，必须记住要非常温和。这些组织非常脆弱，如果被移液器触摸，很容易损坏。不要忘记，使用人体细胞和活性药物可能是危险的，在执行此过程时，应始终采取预防措施，如戴上安全手套和眼镜。

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