Name: contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Forfatterne har ingen anerkendelser.

1. forberedelse af celle plader
Bemærk: Forberede celle plader 3-4 uger før måling af narkotika effekter.
<ol><li>Dag 0 i eksperimentet Bemærk: til planlægningsformål, sammensatte testprogram kan udføres på en given dag mellem dage 22-28 i eksperimentet.<ol>
<li>Tænde et vandbad ved 37 ° C og varm 40 mL plating medium (som leveres af fabrikanten). Bemærk: Brug af celler med deres leverandør-forudsat matchende kultur og vedligeholdelse medier.</li>
		<li>Optø hiPSC-CM ved at placere den cryotubes, der indeholder frosne celler i vandbad i 2 min.</li>
		<li>Overføre 1 mL celle suspensioner omhyggeligt til en 50 mL konisk slange.</li>
		<li>Vask hver cryotube med 1 mL varm plating medium til at hente de sidesten celler og tilføje vask media til den samme koniske rør fra trin 1.1.3 indeholdende celler.</li>
		<li>Bland omhyggeligt en anden 8 mL varm plating medium i cellesuspension.</li>
		<li>Tælle levende celler ved hjælp af metoden trypan blå udstødelse og en hematocytometer8. Bemærk: kravet om 6 x 106 celler for en 384-godt celle plade finder mulighed for op til 20% døde celler blandt de frosne celler, som er højst i vores erfaring.</li>
		<li>Justere cellesuspension til 5 x 105 levende celler/mL med varm plating medium.</li>
		<li>Distribuere cellesuspension til to 384-godt celle plader ved at tilføje 25 µL til hver brønd (ca 12.500 celler pr. brønd). Bemærk: Celle pladerne behøver ikke at være præcoatede med enhver matrix (Se diskussion).</li>
		<li>Vedligeholde celle plader ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 1 i eksperimentet<ol>
<li>Tænde et vandbad ved 37 ° C og varm 50 mL af vedligeholdelse medium suppleret med 1% v/v penicillin-streptomycin løsning.</li>
		<li>Erstatte plating medium med 50 µL af varm vedligeholdelse medium i hver brønd af celle-plader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dage 2-21 (op til dag 27) af forsøget Bemærk: hiPSC-CMs behøver ikke nogen passaging i denne periode, da de ikke dividere celler.<ol>
<li>Forny halvdelen af vedligeholdelse medium hver 2-3 dage og forny det helt på dag 7, 14 og 21. Bemærk: Fluorescens målingen kan udføres mellem dage 22 og 28 i eksperimentet. Længere varighed har ikke blevet prøvet men kan stadig være fint.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. forberedelse af Instrument, sammensatte plader og Assay plader
Bemærk: forberede instrument, sammensatte plader, og assay plader på dagen for måling af narkotika effekter, mellem dage 22 og 28 i eksperimentet. Bruge et fluorescerende-Pladelæser udstyret med temperaturstyring og et passende fluorescens filter kit og excitations lys kilde. Brug for eksempel en Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescens filter kit (excitation: 472 nm; emission: 520-560 nm) og et 150 W excitation lyskilde enhed.
<ol><li>Mindst 2 h før den første celle plade skal være placeret inde i pladelæseren til måling, tænde læseren og indstille varmeanlægget ved 37 ° C. Bemærk: Dette kan også gøres om aftenen før.</li>
	<li>Forbered positive kontroller, forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin og E-4031 som stamopløsninger af 0,33 mM i DMSO, 10 mM i DMSO og 3,33 mM H2O, henholdsvis. Bemærk: lager løsninger vil være fortyndet 333-fold ved tid, de er føjet til cellerne, og formålet er at opnå endelige test-koncentrationer af 1 µM forskolin, 30 µM N6-cyclopentyl-adenosin, og 10 µM E-4031, der producerer pålidelig og reproducerbar effekter.</li>
	<li>Forberede de 352 test forbindelser som DMSO stamopløsninger på 333-fold de planlagte testkoncentrationer (fx10 mM for en test på 30 µM). Bemærk: Formålet er at opnå en endelig koncentration på 0,3% (v/v) DMSO i celle plade efter det sammensatte program; Dette er den højeste DMSO koncentration, der ikke påvirker den rytmiske aktivitet af cardiomyocytes. De stamopløsninger kan også tilberedes dagen før. Et minimum af 5 µL af stamopløsningen er påkrævet for hver dublet måling.</li>
	<li>Forberede de sammensatte plader.<ol>
<li>Varm 40 mL af vedligeholdelse medium suppleret med 1% v/v penicillin-streptomycin løsning til stuetemperatur.</li>
		<li>Distribuere i to 384-godt sammensatte plader ved at tilføje 1,5 µL af stamopløsningen pr. brønd: i) test forbindelser (to brønde hver), ii) de positive kontroller (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin og E-4031, fire brønde pr. sammensatte plade) og iii) negative kontrol (DMSO, 20 wells pr. sammensatte plade).</li>
		<li>Der centrifugeres de sammensatte plader på 100 x g i 1 minut.</li>
		<li>Tilføje 37 µL af vedligeholdelse medium ved stuetemperatur til hver brønd (3,9% DMSO i 38,5 µL på tidspunkt).</li>
		<li>Der centrifugeres de sammensatte plader på 100 x g i 1 minut.</li>
		<li>Indlæse de sammensatte plader ind i pladelæseren. Bemærk: De næste skridt bør udføres hurtigst muligt for at minimere fordampning i de sammensatte plader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede den fluorescerende farvestof.<ol>
<li>Tænde et vandbad ved 37 ° C og varm 100 mL af vedligeholdelse medium suppleret med 1% v/v penicillin-streptomycin løsning.</li>
		<li>Rekonstruere Ca-følsomme fluorescerende farvestof og quencher med 10 mL varm vedligeholdelse medium med antibiotika. Bemærk: denne bestand fluorescens medium indeholder Ca-følsomme fluorescerende farvestof, normalt Fluo-4 og en quencher, og eventuelle rester kan opbevares ved 4 ° C i mindst 5 dage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dataindsamling
Bemærk: udfører dataopsamling på dagen for måling af narkotika effekter. Udfør trin 3.1-.10 helt op til den første celle plade, derefter gentage dem for den anden celle plade.
<ol><li>Starte plade reader-software (hvis nødvendigt) og indlæse pipette tips.</li>
	<li>Justere indstillingerne software for at optage en 2 min segment af Calcium bølger med en erhvervelse frekvens på mindst 10 Hertz at definere baseline slå sats til hver brønd.</li>
	<li>For én celle plade, 3 mL af stock fluorescens medium fortyndes til 12 mL varm vedligeholdelse medium med antibiotika for at gøre fluorescens medium.</li>
	<li>Erstatte 20 µL af medium i hvert hul i celle plade med 30 µL af fluorescens medium.</li>
	<li>Pipetteres op og ned 1 x til at blande.</li>
	<li>Placer celle pladen ind i pladelæseren så hurtigt som muligt at lade hiPSC-CM akklimatisere til temperaturen.</li>
	<li>Vente på 60 min før du starter dataopsamling.</li>
	<li>Start dataopsamling i plade reader software til at optage en 2 min segment af Ca bølger med en erhvervelse frekvens på mindst 10 Hz, at fastlægge grundlinjen slå sats til hver brønd. Bemærk: For hver optagelse sekvens, Sørg for celle plade ikke er overført automatisk af enheden efter dataopsamling. Dette forhindrer celle plade køling ved stuetemperatur. Med nogle versioner af plade-læser software, kan det være nødvendigt at stoppe hver optagelse, før det ender helt for at opnå dette.</li>
	<li>Tilføje test- og referencestoffer forbindelser med plade læser robot af pipettering godt til godt 5 µL af den sammensatte plade i celle pladen (efter tilsætning, DMSO koncentration er 0,3% [v/v]).</li>
	<li>Start dataopsamling i plade reader software til at optage 2 min segmenter af Ca bølger starter om 5, 15, 30, 45 og 60 min. efter sammensatte tilsætning (Sørg for hver gang cellen pladen forbliver i enheden).</li>
</ol>4. dataanalyse
NOTE: dataanalyse kan udføres nogen tid efter måling.
<ol><li>Eksportere de rå data for hver registrering periode fra plade reader software som ASCII-tekstfiler.</li>
	<li>Importere de rå data til data analyse software.</li>
	<li>For hver brønd og alle tidspunkter, uddrag den primære slå frekvens. Bemærk: Med den data analyse programmel listet i Tabel af materialer, slå frekvenser kan beregnes med en brugerdefineret analyse rutine ved hjælp af funktionen LombPeriodogram, baseret på metoden Lomb – Scargle af mindste-kvadraters spektralanalyse7 . Periodogram skal beregnes for en række frekvenser mellem 0,01 og 5 Hz. Den primære frekvens kan udvindes fra periodogram ved hjælp af PeakAutoFind rutiner. Denne analysemetode, der giver mere nøjagtige målinger for at slå frekvenser end metoden leveres som ekstraudstyr med plade reader-software. Men sidstnævnte kan stadig bruges, hvis software tilpasning ikke er en mulighed.</li>
	<li>Eksport primære slå frekvenser for hver registrering periode fra data analyse software som Udklipsholder kopier eller som ASCII-tekstfiler.</li>
	<li>Importere de primære slå frekvenser i et regneark software af Udklipsholder indsætning eller tekst filimport. Bemærk: trin 4,5-4.9 kan udføres i moderne regneark software.</li>
	<li>Til hver brønd, normalisere til baseline slå frekvens på hvert tidspunkt efter programmet stof (5, 15, 30, 45 og 60 min) ved at dividere den primære slå frekvens dengang punkt af den primære slå frekvens på baseline.</li>
	<li>Beregner den gennemsnitlige DMSO effekt på hvert tidspunkt efter programmet stof (5, 15, 30, 45 og 60 min) af gennemsnit de normaliserede værdier for 20 brøndene hvor DMSO blev anvendt.</li>
	<li>Hver brønd og hver gang punkt efter programmet stof (5, 15, 30, 45 og 60 min), trække den gennemsnitlige DMSO effekt (tid-matchede) for den samme plade.</li>
	<li>Gennemsnitlig dublerede målingerne. Bemærk: Hvis en stof ændrer frekvens eller softwaren kan ikke finde en primær frekvens efter sammensatte tilsætning, en visuel undersøgelse af det bankende mønster kan vurdere, om sammensat produceret arytmier.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+their+derivatives:+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research.">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li><li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+An+In-Vitro+Model+to+Predict+Cardiac+Effects+of+Drugs.">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).</li><li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells.">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li><li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Lomb-Scargle+Periodogram.">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+blockers+and+calcium+channels.">Calcium channel blockers and calcium channels.</a> Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).</li><li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs.">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li><li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels.">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li><li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue.">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

To aspekter er mest afgørende for en vellykket optagelse i slå frekvenser. Først er at udvise forsigtighed med celle plating og kultur. Det er især vigtigt at forsøge at undgå at ridse cellelag i bunden af brøndene når udveksling medium. Det er acceptabelt at røre bunden af brøndene med pipetter, men den samme vinkel bør anvendes hver gang dermed producerer kun en lille skramme i cellelag og ikke påvirke assay ydeevne. Det andet kritiske aspekt for at opnå reproducerbare homogene rytmer er at give god temperaturkontrol ved 37 ° C i hele cellen plade for varigheden af målingen. Vi kunne ikke opnå denne ensartethed ved hjælp af andre enheder end i pladelæseren anvendes her, men det kan være muligt med særlige ændringer til forordningen temperatur: det ville gøre den protokol, der præsenteres her mere bredt anvendelige ud over et enkelt mærke af plade læser. For at opnå temperatur stabilitet for varigheden af forsøget med den enhed, der bruges her, var det nødvendigt at stoppe hver optagelse før det endte; ellers, robotten ville skubbe den målte celle plade. Dette tekniske problem kan forsvinde med den næste udgave af softwaren til læseren til pladen, men det er fortsat afgørende for nu. Hvis en celle plade er fejlagtigt overført udenfor i pladelæseren, skal det være lastet tilbage inde så hurtigt som muligt. Ikke desto mindre, kvaliteten af eksperimentet vil forværres, fordi temperaturændringer påvirker slå sats meget hurtigt.
Nogle andre aspekter, der ikke er er blevet testet grundigt, kan være mindre vigtigt. For eksempel, hiPSC-CM producenter anbefaler belægning cellekultur plader før såning cellerne, men i denne konkrete analyse, belægning blev ikke brugt, fordi cellerne overholde ganske let på forskellige overflader, og det er meget svært at korrekt frakke 384-godt plader. Endnu, celle plade belægning kan stadig være tilladte, eller det kan endda forbedre assay kvalitet. Vi testede også aldrig om opløsningsmidler end DMSO ville være acceptabel, men det forventes fra erfaring med andre teknologier, optagelse, at lignende koncentrationer af EtOH eller MeOH også ville være acceptabel. Generelt bruger vi hiPSC-CMs fra samme producent, og celler fra kun én ekstra leverandør blev testet, som syntes at arbejde på en lignende måde. Ligeledes har vi brugt kun et lille antal forskellige batches af hiPSC-CMs, der blev valgt ved prechecking dem til at kontrollere, at de opførte sig på samme måde til den første gruppe. En eller to partier blev anset for uhensigtsmæssigt, fordi deres syncytia havde dårlig stabilitet eller reproducerbarhed betingelser kultur anvendes her. Ellers, farmakologi syntes meget ens på tværs af partier når du tester et begrænset panel af "typiske" forbindelser (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin, og E-4031, samt endothelin, isoprenalin, amlodipin og ponesimod). Vi brugte kun hiPSC-CM stammer fra raske donorer. Det kan være umagen værd at vurdere, om hiPSC-CM stammer fra patienter med hjertesygdomme ville give forskellige resultater, selv om ingen forskel mellem raske donorer og patienter blev observeret ved vurderingen af cardiotoxicity af tyrosin kinase hæmmere 12. Endelig, vi normalt vente 22-28 dage i kultur før måling narkotika effekter: vores erfaring med impedans optagelser af de samme celler, en steady-state for langsom impedans (en indikator for celle lag stabilitet) og hurtig impedans (en indikator for slå frekvens) nås efter 12-15 dage i kultur. Dog besluttede vi at vente 22-28 dage, fordi det er den tid, når profilen udtryk af cardiac kanaler og modning markører er stabiliseret13. Det var ikke undersøgt, om sammenlignelige resultater ville kunne opnås, hvis cellerne blev brugt tidligere eller senere.
Protokollen beskrev bruger her en meget ligetil måling af den spontane slå sats på hiPSC-CM til at vurdere potentielle lægemiddel virkninger på menneskers hjerte Elektrofysiologi. Dets vigtigste fordele i forhold til andre metoder er at i) det er indstillet til en høj overførselshastighed screening miljø, ii) det registrerer aktiviteten af cardiomyocytes og virkningerne af narkotika på fysiologiske temperaturer, og iii) det kræver ikke elektrofysiologiske ekspertise til udførelse eller for en vurdering af resultaterne.
I en valideringsundersøgelse udført med mange lægemidler godkendt til human brug, viste vi, at analysen reagerer på lægemidler, der anvendes i human medicin som forudsagt af eksisterende kliniske data5. Fordi denne metode finder alle potentielle virkninger på hjerterytmen, supplerer det den omfattende i vitro Proarrhythmic analyse (CiPA) initiativ14 der specifikt vurderer pro-arytmi potentiale.
Fremover vil kunne denne metode give en yderligere forståelse af tilstanden af handling af stoffer vist sig at påvirke den spontane slå. Det er sandsynligt, at yderligere mekanistiske information er til stede i fluorescens optagelser af Ca transienter (f.eks.i deres amplitude eller figur). Hvis fluorescens optagelser er udført til højere erhvervelse priser (fx, 30 Hz), disse parametre pakkes nemt ud over slå sats, og det kan være interessant at korrelere ændringer i disse parametre med de kendte virkninger af klinisk brugt stoffer.

Denne protokol skildrer en metode til at måle lægemiddel virkninger på den spontane slå hyppigheden af syncytia af hiPSC-CM på fysiologisk relevante rytmer. Human-induceret pluripotente stamceller kan udvikle sig til funktionelle cardiomyocytes, der etablerer spontant bankende syncytia in vitro-1,2,3,4. Disse hiPSC-CM fås i stort tal gennem kommercielle udbydere eller produktion i laboratoriet, og de er en nyttig kilde til celler til at generere modeller af menneskers hjerte fysiologi og farmakologi. De kan især bruges til at forudsige eller at karakterisere hjerte virkninger, der kan opstå, når et stof indgives til mennesker5.
Slå hyppigheden af hiPSC-CM syncytia kan måles på fysiologiske betingelser ved hjælp af mikroelektrode arrays eller impedans sensing1: disse noninvasive teknikker give meget detaljerede oplysninger om narkotika virkninger, men de er snarere lav-overførselshastighed, og de sætter ikke teste store sammensatte biblioteker i realistisk tid og budgetbegrænsninger. Et mere effektivt system kan blive udarbejdet ved hjælp af en 384-godt fluorescens imaging Pladelæser og en Ca-følsomme farvestof6, men klassisk plade læsere er hæmmet af suboptimal temperatur kontrol og erhvervelse frekvens. Disse begrænsninger er illustreret af unphysiological slå satser (~ 15 bpm, sammenlignet med 35-55 bpm i kontrollerede miljøer1) og dårlig Ca signal opløsning (en erhvervelse frekvens på 8 Hz er på den nedre grænse til optage satser, der kan nå 120 bpm stimuleret betingelser, og det kan ikke udtrække oplysninger såsom hældning eller varighed). Metoden beskrevet her kombinerer optagelse for at slå mønstre på fysiologiske rytmer og tilstrækkelig opløsning til hinder for disse bekymringer.
På den positive side er denne metode simpel, pålidelig og høj overførselshastighed, som tillader hurtig test af stort antal forbindelser til en fornuftig pris. På den negative side, denne metode kræver en hurtig Pladelæser med effektive temperaturkontrol, som er en kostbar investering, og det giver lidt mekanistiske information om observerede narkotika virkninger, som kan nødvendiggøre yderligere prøvning med mere detaljerede metoder.
Ca 6 x 106 hiPSC-CM er behov for en måling i en 384-godt celle plade. hiPSC-CM leveres normalt kommercielt som frosne delprøver af ~ 4 x 106 celler i 1 mL. Derfor er det bekvemt at forberede to celle plader med tre frosne delprøver. I de fleste tilfælde på grund af den lave variation af denne analyse, er det tilstrækkeligt at udføre identiske målinger af test forbindelser og, i hver celle plade, forsøgsbetingelse målinger af de positive kontroller (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin og E-4031), og 20-plicate målinger af den negative kontrol (DMSO alene). Derfor kan højst 352 sammensatte/koncentration par evalueres med to 384-godt cellen plader. Følgende protokol finder sådan et eksperiment udført med 352 test forbindelser, to celle plader og 12 millioner celler leveres som tre frosne delprøver; Det kan være let skaleres op, hvis flere datapunkter er nødvendige.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

Spontant kontraherende syncytia af cardiomyocytes stammer fra menneskelige-induceret pluripotente er stamceller (hiPSC-CM) en nyttig model af menneskets hjerte fysiologi og farmakologi. Forskellige metoder er blevet foreslået til at registrere denne spontane aktivitet og for at vurdere narkotika effekter, men mange af disse metoder lider begrænset overførselshastighed og/eller fysiologiske relevans. Vi udviklet en høj overførselshastighed screening system for at kvantificere virkningerne af udefrakommende forbindelser på hiPSC-CMS bankende frekvens, ved hjælp af et Ca-følsomme fluorescerende farvestof og en temperatur-kontrolleret imaging multi godt Pladelæser. Vi beskriver hvordan man forbereder celle plader og de sammensatte plader og hvordan man køre automatiserede analysen for at opnå høj følsomhed og reproducerbarhed. Vi beskriver også hvordan til at omdanne og analysere fluorescens data for at give pålidelige foranstaltninger af narkotika virkninger på spontan rytme. Denne analyse kan bruges i drug discovery programmer til at guide kemiske optimering væk fra eller mod, stoffer der påvirker menneskelige hjertefunktion.

Figur 1 viser et repræsentativt optagelse af Ca bølger ved baseline på tværs af en 384-godt plade. I de fleste tilfælde, alle wells afslører en regelmæssig slå sats med lidt variation på tværs af pladen (betyde ± SD = 40.1 ± 3,5 bpm; range = 34-54 bpm). Meget lejlighedsvis (mindre end 1 ud af 10 forsøg), et par wells (mindre end 5) har arytmi eller fravær af rytme. I tre 384-godt plader, har vi også prøvet cardiomyocytes fra en anden leverandør (Se Tabel af materialer) og opnået meget lignende baseline værdier for den spontane slå.
Blokering af cardiac Ionkanaler påvirker rytmen i cardiomyocytes i en reproducerbar måde5. Amlodipin, en blokering af den langsomme Ca kanaler9, accelererer rytme mere end 100% i en koncentration-afhængige måde op til 1 µM (figur 2A). Effekten er veludviklet inden for de første 5 min, men det stadig stiger ca 50% inden for de næste 30 min før det stabiliserer. Over 1 µM, amlodipin arresterer slå (stiplede linjer), som kan forventes fra faktum, at Ca cykling er afgørende for de spontane veer. Andre selektive dihydropyridin Ca kanal blokkere producere meget lignende effekter.
E-4031, en blokering af hurtige forsinkede ensretter K kanaler10, retarderer rytme omkring 65-70% i en koncentration-afhængige måde op til 10 µM (figur 2B). Virkningen udvikler sig inden for de første 5 min og det varierer ikke inden for de næste 60 min. Andre selektive IKr blokkere producerer lignende virkninger, selv om maksimal reduktion i sats kan variere (f.eks., 35-40% for cisaprid, 70% for E-4031 og 90-95% for dofetilide). Grundlaget for denne forskel er ikke kendt.
Tetrodotoxin, en blokering af den hurtige Na kanaler11, retarderer rytme ca. 15% i en koncentration-afhængige måde, op til 1-30 µM (figur 2 c). Effekten er veludviklet inden for de første 5 min og det varierer ikke meget indenfor de næste 60 min. Dog over 30 µM arresterer tetrodotoxin slå inden for de første 5 min, mens efter 30 min, det arresterer det ovenfor 1 µM. Andre Na kanal blokkere, såsom lidocain eller mexiletine, producerer lignende effekter.
Bepridil, en blandet blokering af cardiac Na, Ca og K kanaler9, producerer også en alt eller intet effekt (figur 2D). Dette tyder på, at i denne forberedelse, en blok af Na kanaler er den primære virkning af bepridil. En acceleration på grund af Ca kanal blok ses ikke, og den mere progressive langsommere på grund af IKr blok vises maskeret af Na kanal effekt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> Figur 1: repræsentative baseline Ca bølger på tværs af en 384-godt plade. (A) alle brønde i hele pladen demonstrere en regelmæssig slå sats med lidt variation. Dette billede er taget til fange direkte fra plade reader software. Hvert spor er 10 s i varighed. Fluorescens-intensiteten er vilkårlige (relativ lys enheder afledt af videokamera gråtoner). (B) denne blow-up af én 10 s spor viser den lave støj i signalet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> Figur 2: repræsentative virkningerne af cardiac ion kanal blokkere. Disse paneler vis koncentration-respons kurver med (A) den selektive Ca kanal blokker amlodipin, (B) den selektive IKr blokker E-4031, (C) den selektive Na kanal blokker TTX, og (D) ikke-selektiv kanalen Blocker bepridil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Spontant kontraherende syncytia af cardiomyocytes stammer fra menneskelige-induceret pluripotente er stamceller nyttige modeller af menneskers hjerte fysiologi og farmakologi. Her præsenterer vi en høj overførselshastighed screening system for at kvantificere virkningerne af udefrakommende forbindelser på slå frekvens, ved hjælp af et Ca-følsomme fluorescerende farvestof og en temperatur-kontrolleret imaging multi godt Pladelæser.

Sammentrækninger af menneske-iPSC-afledt Cardiomyocyte Syncytia målt med et Ca-følsomme fluorescerende farvestof i temperatur-kontrollerede 384-godt plader

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for hjertesikkerhed farmakologi. Indebærer en ny humanmedicin for eksempel en risiko for at ændre den normale hjerterytme? Den største fordel ved denne teknik er, at det kan evaluere et stort antal forbindelser hurtigt og til en moderat pris.Demonstration af proceduren vil være Camille Forny, en forskningsmedarbejder i mit laboratorium. For at forberede målingen af sammentrækninger af syncytia af human-induceret pluripotent stamceller-afledte kardiomyocytter, eller HIPSCCMs, start med at placere CryoTubes indeholder frosne celler i en 37 grader Celsius vandbad i to minutter. Hele den optøede celleaffjedring overføres fra hvert rør til et enkelt, friskt konisk rør på 50 milliliter.For at hente de tilbagedene celler, vaskes hvert rør med en milliliter på 37 grader Celsius forvarmet plating medium og tilsæt dette medium til de 50 milliliter koniske rør, der indeholder optøede celler. Tilsæt otte milliliter varm plating medium til røret og bland forsigtigt suspensionen. Brug trypan blå udelukkelse metode og et hæmocytometer til at tælle levende celler.Ved at tilsætte varm plating medium, justere koncentrationen til 50, 000 celler pr milliliter. For at fordele cellerne i to nye 384-brøndcellekulturplader, tilsættes 25 mikroliter til hver brønd, hvilket vil give omkring 12, 500 celler pr. brønd. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 384-brøndplader i befugtet atmosfære med 5% kuldioxid i alt tre til fire uger.Den følgende dag, erstatte plating medium med 50 mikroliter af varm vedligeholdelse medium. Derefter skal halvdelen af vedligeholdelsesmediet udskiftes hver anden til tredje dag. På dag syv, 14 og 21, erstatte mediet helt.Når cellerne er blevet opretholdt i kultur i tre til fire uger, har de dannet spontant ordregivende syncytia, og effekten af forbindelser på disse sammentrækninger kan måles. På analysedagen skal der mindst to timer før den første celleplade placeres inde i pladelæseren til målingen, tænde for læseren og indstille varmesystemet til 37 grader Celsius. For at forberede de sammensatte plader, varm til stuetemperatur 40 milliliter vedligeholdelse medium suppleret med 1% volumen-for-volumen penicillin streptomycin.Mens mediet varmer op, fordeles testforbindelserne og kontrollerne i to 384-brønds sammensatte plader ved at tilføje 1,5 mikroliter stockopløsning pr. brønd. Centrifuge de sammensatte plader ved 100 G i et minut. Tilsæt 37 mikroliter af vedligeholdelsesmedie til hver brønd og centrifuge pladerne igen ved 100 G i et minut.For at forberede fluorescerende farvestof, varm 100 milliliter vedligeholdelse medium suppleret med 1% volumen-for-volumen penicillin streptomycin i en 37 grader Celsius vandbad. Derefter tilsættes 10 milliliter af det opvarmede medium til blandingen af calcium-følsomme fluorescerende farvestof og quencher at rekonstituere dem som en bestand fluorescens medium. Start pladelæsersoftwaren.Forbered softwaren til at optage en to minutters segment af calcium bølger med en erhvervelse frekvens på mindst 10 hertz. For at gøre fluorescens medium for hver celleplade, fortyndes tre milliliter lager fluorescens medium med 12 milliliter varm vedligeholdelse medium med antibiotika. Udskift 20 mikroliter af medium i hver brønd af cellepladen med 30 mikroliter fluorescens medium og bland ved pipettering op og ned én gang.Umiddelbart derefter skal pladen sættes i en pladelæser for at lade HIPSCCM'erne tilpasse sig læsertemperaturen i 60 minutter. Start derefter pladelæsersoftwaren. Optag en to minutters segment af calcium bølger med en erhvervelse frekvens på mindst 10 hertz at definere baseline slå sats for hver brønd.Det er vigtigt at sikre, at cellepladen ikke overføres fra enheden efter dataindsamling. Med nogle softwareversioner skal du stoppe optagelsen, før den afsluttes helt. Brug pladelæserrobotten til at pipette fem mikroliter af testen og henvise forbindelser godt til godt fra den sammensatte plade ind i cellepladen.Derefter skal du starte dataindsamlingen i pladelæsersoftwaren for at optage to minutter af calciumbølger, der starter ved fem, 15, 30, 45 og 60 minutter efter tilsætningen. Hvis du vil starte dataanalyse, skal du eksportere rådata for hver optagelsesperiode fra pladelæsersoftwaren i ASCII-tekstfiler. Og derefter importere dem til dataanalyse software.Fra dataanalysesoftwaren skal du eksportere de primære slåfrekvenser for hver optagelsesperiode som kopier af udklipsholder. Uddrag den primære slåfrekvens for hver brønd og hvert tidspunkt. Endelig skal du importere slåfrekvenserne til en regnearkssoftware ved at indsætte udklipsholder og fortsætte dataanalysen som beskrevet i tekstprotokollen.Registrering af calciumbølger ved baseline på tværs af en 384-brønd plade viser, at i de fleste tilfælde alle brønde afslører en regelmæssig slåhastighed med lidt variation på tværs af pladen. Når blokkere af hjerteion kanaler er tilføjet, de påvirker rytmen af kardiomyocytter. Amlodipin, en blokker af de langsomme calcium kanaler, accelererer rytmen mere end 100% i en koncentration afhængig måde op til en mikromolar.Og over det, anholder amlodiine tæsk. E-4031, en blokker af den hurtige forsinkede ensretter kalium kanaler decelererer rytmen omkring 65 til 70% i en koncentration afhængig måde op til 10 mikromolar. Tetrodotoxin, en blokker af de hurtige natriumkanaler decelererer rytmen omkring 15% i en koncentration afhængig måde op til en til 30 mikromolar, mens over 30 mikromolar, tetrodotoxin arresterer slå inden for de første fem minutter.Bepridil, en blandet blokker af hjerte natrium, calcium, og kalium kanaler producerer også en alt-eller-intet effekt, hvilket tyder på, at natrium kanal blok er den primære virkning af bepridil. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at være yderst blid, når pipettering i cellen kultur plade. Disse væv er meget skrøbelige og let beskadiget, hvis rørt af pipetter.Glem ikke, at arbejde med menneskelige celler og aktive stoffer kan være farligt, og forholdsregler såsom iført sikkerhedshandsker og briller bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Medicine

Unit 1

Cardiovascular Drugs: Antihypertensive Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering af cardiomyocyte Kerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantificering Glomerular fyldbarhed Fluorescent Macromolecules Brug 2-Photon mikroskopi i München Wistarrotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Udvikling af en Audio-based Virtual Gaming Miljø til at hjælpe med Navigation Skills i Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Shrinkage of Dental Composite in Simulated Cavity Measured with Digital Image Correlation

Krympning af Dental Composite i simuleret Cavity Målt med Digital Image Correlation

Polymerization shrinkage of dental resin composites can lead to restoration debonding or cracked tooth tissues in composite-restored teeth. In order to ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerende farvestofmærkning af erytrocytter og leukocytter til at studere strømdynamikken i muskelspiralcirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Noninvasiv bestemmelse af Vortex dannelsen tid ved hjælp af Transesophageal ekkokardiografi under hjertekirurgi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

En rotte halspulsåren Tryk-kontrolleret segmental ballon skade med Periadventitial Terapeutisk Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Elektromekanisk vurdering af optogenetisk moduleret kardiomyocyt aktivitet

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Intrathecal Application of a Fluorescent Dye for the Identification of Cerebrospinal Fluid Leaks in Cochlear Malformation

Intrathecal Anvendelse af et fluorescerende farvestof til identifikation af Cerebrospinalvæske lækager i Cochlear misdannelser

In cases of cerebrospinal fluid (CSF) leaks, reliable detection of their origins is needed to seal the leak sufficiently and prevent complications, such ...