Name: contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

De auteurs hebben geen bevestigingen.

1. bereiding van de platen van de cel
Opmerking: Bereiden de cel platen 3-4 weken voor het meten van effecten van de drug.
<ol><li>Dag 0 van het experiment Opmerking: voor planningsdoeleinden, de samengestelde toepassing van de test kan worden uitgevoerd op elke dag tussen dagen 22-28 van het experiment.<ol>
<li>Zet het waterbad bij 37 ° C en 40 mL van plating medium warm (zoals geleverd door de fabrikant). Opmerking: Gebruik de cellen met hun leverancier geleverde overeenkomende cultuur en onderhoud media.</li>
		<li>Ontdooi de hiPSC-CM door het plaatsen van de cryotubes met bevroren cellen in het waterbad gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Overbrengen in de 1 mL cel schorsingen zorgvuldig een kegelvormige tube van 50 mL.</li>
		<li>Wassen elke cryotube met 1 mL van warme plating medium voor het ophalen van de overgebleven cellen en het wassen media toevoegen aan de dezelfde conische buis uit stap 1.1.3 met cellen.</li>
		<li>Meng zorgvuldig een andere 8 mL warme plating medium in de celsuspensie.</li>
		<li>Levende cellen met behulp van de methode trypan blauwe uitsluiting en een hematocytometer8tellen. Opmerking: de eis van 6 x 106 cellen voor een 384-well cel plaat acht de mogelijkheid om maximaal 20% dode cellen onder de bevroren cellen, die een maximum in onze ervaring.</li>
		<li>Aanpassen van de celsuspensie tot 5 x 105 levende cellen/mL met het warme plating-medium.</li>
		<li>Het verdelen van de celsuspensie over twee 384-well cel platen door 25 µL toe te voegen aan elk putje (ongeveer 12.500 cellen per putje). Opmerking: De cel platen hoeft niet te worden voorgelakt met een matrix (Zie discussie).</li>
		<li>De platen van de cel bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2handhaven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 1 van het experiment<ol>
<li>Inschakelen van het waterbad bij 37 ° C en warme 50 mL onderhoud voedingsbodem aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine oplossing.</li>
		<li>Het medium van de beplating vervangen door 50 µL van warme onderhoud medium in elk putje van de platen van de cel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dagen 2-21 (tot dag 27) van het experiment Opmerking: de hiPSC-CMs hoeft niet elke passaging in deze periode, zoals ze niet-delende zijn cellen.<ol>
<li>Vernieuwen de helft van het onderhoud medium elke 2-3 dagen en vernieuwen het volledig op dagen 7, 14 en 21. Opmerking: De fluorescentie-meting kan worden uitgevoerd tussen dagen 22 en 28 van het experiment. Langere duur hebben niet geprobeerd maar kunnen nog wel goed.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van het Instrument, samengestelde platen en Assay platen
Opmerking: bereiden van het instrument, samengestelde platen en assay platen op de dag van de waardering van effecten van de drug, tussen dagen 22 en 28 van het experiment. Gebruik een fluorescerende afleesapparaat uitgerust met temperatuurregeling en een passende fluorescentie filter kit en excitatie licht bron. Gebruik bijvoorbeeld een Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescentie filter kit (excitatie: 472 nm, emissie: 520-560 nm) en een 150 W excitatie lichtbron eenheid.
<ol><li>Ten minste 2 uur voordat de eerste plaat van de cel moet worden geplaatst binnen de afleesapparaat voor de meting, zet de lezer en selecteer het verwarmingssysteem bij 37 ° C. Opmerking: dit kan ook de avond vóór.</li>
	<li>Voorbereiding van de positieve controles, forskolin N6-cyclopentyl-adenosine en E-4031 als stamoplossingen van 0.33 mM in DMSO, 10 mM in DMSO, en 3,33 mM H2O, respectievelijk. Opmerking: voorraad oplossingen zal worden verdund 333-fold tegen de tijd dat ze worden toegevoegd aan de cellen, en het doel is om de laatste testconcentraties van 1 µM forskolin, 30 µM N6-cyclopentyl-adenosine, en 10 µM E-4031, die betrouwbare en reproduceerbare effecten produceren.</li>
	<li>Bereiden de 352 test verbindingen als DMSO stamoplossingen op 333-fold de geplande testconcentraties (bijvoorbeeld10 mM voor een test op 30 µM). Opmerking: Het doel is om een eindconcentratie van 0,3% (v/v) DMSO in de cel plaat na de samengestelde toepassing; Dit is de hoogste concentratie van DMSO, dat heeft geen invloed op de ritmische activiteit van de cardiomyocytes. De voorraadoplossingen kunnen ook worden bereid van eergisteren. Een minimum van 5 µL van stockoplossing is vereist voor elke dubbele meting.</li>
	<li>De samengestelde platen voor te bereiden.<ol>
<li>Verwarm 40 mL onderhoud voedingsbodem aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine oplossing tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Verdelen over twee 384-well samengestelde platen door het toevoegen van 1,5 µL van stockoplossing per putje: i) de test verbindingen (elke twee putten), ii) de positieve controle (forskolin N6-cyclopentyl-adenosine en E-4031, vier wells per samengestelde plaat) en iii) de negatieve controle (DMSO, 20 wells per samengestelde plaat).</li>
		<li>Centrifugeer de samengestelde platen bij 100 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>37 µL van onderhoud medium op kamertemperatuur toevoegen aan elk putje (3,9% DMSO in 38.5 µL in dat stadium).</li>
		<li>Centrifugeer de samengestelde platen bij 100 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>De samengestelde platen in de afleesapparaat laden. Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd zo spoedig mogelijk om te minimaliseren van de verdamping in de samengestelde platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De fluorescente kleurstof voor te bereiden.<ol>
<li>Inschakelen van het waterbad bij 37 ° C en warme 100 mL onderhoud voedingsbodem aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine oplossing.</li>
		<li>Het reconstrueren van de Ca-gevoelige fluorescente kleurstof en quencher met 10 mL warme onderhoud medium met antibiotica. Opmerking: deze voorraad fluorescentie-medium bevat de fluorescente kleurstof van Ca-gevoelige, meestal Fluo-4 en een quencher, en eventuele overgebleven kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende ten minste 5 dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. data-acquisitie
Opmerking: de data-acquisitie uitvoeren op de dag van de waardering van effecten van de drug. Stappen 3.1-.10 geheel voor de eerste cel plaat, dan herhalen voor de tweede plaat van de cel.
<ol><li>Start de plaat reader-software (indien nodig) en laadt u de uiteinden van de pipet.</li>
	<li>Pas de instellingen van de software als u wilt opnemen van een segment van de 2 min van Calcium golven met een frequentie van de acquisitie van ten minste 10 Hertz te definiëren van de basislijn kloppend tarief voor elk putje.</li>
	<li>Verdun voor één cel plaat, 3 mL voorraad fluorescentie voedingsbodem in 12 mL warme onderhoud medium met antibiotica om het medium van de fluorescentie.</li>
	<li>20 µL van medium in elk putje van de plaat van de cel vervangen door 30 µL van fluorescentie medium.</li>
	<li>Pipetteer op en neer 1 x te mengen.</li>
	<li>Plaats de plaat van de cel in de afleesapparaat zo snel mogelijk te laten de hiPSC-CM acclimatiseren aan de temperatuur.</li>
	<li>60 min wachten voordat de data-acquisitie.</li>
	<li>Start de data-acquisitie in de plaat lezerssoftware voor het registreren van een segment van de 2 min van Ca golven met een frequentie van de acquisitie van ten minste 10 Hz, tot het definiëren van de basislijn verslaan tarief voor elk putje. Opmerking: voor elke opname sequentie, zorg ervoor dat de cel plaat is niet automatisch overgebracht uit het apparaat na de data-acquisitie. Hiermee voorkomt u dat de cel plaat koeling bij kamertemperatuur. Bij sommige versies van de software van de lezer van de plaat, kan het nodig om te stoppen met elke opname voordat het eindigt volledig om dit te bereiken zijn.</li>
	<li>Toevoegen van de teststof en de referentiestof verbindingen met de plaat lezer robot door goed-te-goed 5 µL van de samengestelde plaat in de cel plaat pipetteren (na toevoeging, de concentratie van DMSO is 0,3% [v/v]).</li>
	<li>Start de data-acquisitie in de plaat reader software om record 2 min segmenten van Ca golven beginnen over 5, 15, 30, 45 en 60 min na de samengestelde toevoeging (zorg ervoor dat elke keer dat de cel plaat blijft in het apparaat).</li>
</ol>4. de gegevensanalyse
Opmerking: de data-analyse een willekeurig tijdstip na de meting kan worden uitgevoerd.
<ol><li>De ruwe gegevens voor elke periode van de opname van de software van de lezer van de plaat als ASCII-tekstbestanden exporteren.</li>
	<li>De ruwe gegevens in de software van de analyse van de gegevens te importeren.</li>
	<li>Voor elk putje en alle tijdstippen, pak de primaire kloppend frequentie. Opmerking: Met de data-analysesoftware vermeld in de Tabel van materialen, het verslaan van frequenties kan worden berekend met een routine van de aangepaste analyse met behulp van de functie van de LombPeriodogram, gebaseerd op de Lomb-Scargle methode van kleinste kwadraten spectrale analyse7 . De periodogram moet worden berekend voor een bereik van frequenties tussen 0,01 en 5 Hz. De primaire frequentie kan worden geëxtraheerd uit de periodogram met behulp van de PeakAutoFind routines. Deze analysemethode biedt meer nauwkeurige metingen van frequenties dan de methode geleverd als een optie met de software van de lezer van de plaat te verslaan. De laatste kan echter nog steeds worden gebruikt als de aanpassing van de software geen optie is.</li>
	<li>Exporteren de frequenties van de primaire kloppend voor elke periode van de opname van de software van de analyse van de gegevens als Klembord kopieën of als ASCII-tekstbestanden.</li>
	<li>De primaire kloppend frequenties in een spreadsheet-software importeren door Klembord plakken of tekst bestand importeren. Opmerking: stappen 4.5-4.9 in elke moderne spreadsheet-software kunnen worden uitgevoerd.</li>
	<li>Voor elk putje, normaliseren tot basislijn de afstraffing frequentie op elk tijdstip na de toepassing van de drug (5, 15, 30, 45 en 60 min) door het verdelen van de frequentie van de primaire kloppend op dat moment punt door de frequentie van de primaire kloppend op basislijn.</li>
	<li>Berekenen van het gemiddelde effect van DMSO op elk tijdstip na de toepassing van de drug (5, 15, 30, 45 en 60 min) door het gemiddelde van de genormaliseerde waarden voor de 20 putten waar DMSO werd toegepast.</li>
	<li>Voor elk putje en telkens na de toepassing van de drug punt (5, 15, 30, 45 en 60 min), de gemiddelde DMSO effect (tijd-overeenkomst) voor de dezelfde plaat aftrekken.</li>
	<li>Het gemiddelde van de dubbele metingen. Opmerking: als een verbinding verandert de frequentie of de software niet kan een primaire frequentie na de samengestelde toevoeging vinden, een visueel onderzoek van het patroon van de afstraffing kan beoordelen of de stof aritmieën geproduceerde.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+their+derivatives:+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research.">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li><li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+An+In-Vitro+Model+to+Predict+Cardiac+Effects+of+Drugs.">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).</li><li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells.">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li><li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Lomb-Scargle+Periodogram.">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+blockers+and+calcium+channels.">Calcium channel blockers and calcium channels.</a> Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).</li><li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs.">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li><li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels.">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li><li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue.">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Twee aspecten zijn meest kritisch voor de succesvolle opname van mishandeling van frequenties. De eerste is om voorzichtig te zijn met de cel plating en cultuur. In het bijzonder, is het belangrijk om te proberen en te voorkomen krassen van de cellaag op de bodem van de putten, bij het vervangen van het medium. Het is aanvaardbaar om te raken van de onderkant van de putjes met de pipetten, maar dezelfde hoek moet telkens opnieuw worden gebruikt, waardoor het produceren van alleen een kleine kras in de cellaag en niet van invloed op de prestaties van de test. Het tweede kritische aspect van het verkrijgen van reproduceerbare homogene ritmes is te leveren van goede temperatuurregeling bij 37 ° C in de cel plaat voor de duur van de meting. We kunnen niet krijgen deze homogeniteit met behulp van andere apparaten dan de afleesapparaat hier gebruikt, maar het mogelijk met speciale wijzigingen aan de temperatuur-regeling: het zou maken het protocol gepresenteerd hier meer in het algemeen bruikbaar dan één merk van plaat lezer. Om te bereiken temperatuur stabiliteit voor de duur van het experiment met het apparaat hier gebruikt, bleek het noodzakelijk om te stoppen met elke opname voordat het einde; anders zou de robot de gemeten cel plaat uitwerpen. Deze technische kwestie kan verdwijnen met de volgende versie van de software van de lezer van de plaat, maar het blijft kritisch voor nu. Als een cel plaat per ongeluk buiten de afleesapparaat overgedragen wordt, moet het zo snel mogelijk terug binnen worden geladen. Niettemin, de kwaliteit van het experiment zal verslechteren, omdat temperatuurveranderingen zeer snel invloed hebben op de koers gewonnen.
Enkele andere aspecten, die niet grondig getest hebben, kunnen minder belangrijk zijn. Bijvoorbeeld hiPSC-CM fabrikanten adviseren coating celkweek platen voor het zaaien van de cellen, maar in dit specifieke assay, coating niet werd gebruikt, omdat de cellen zich vrij gemakkelijk op verschillende oppervlakken, en het is zeer moeilijk te goed vacht 384-well platen. Nog, cel plaat coating kan nog steeds toegestane, of het kan zelfs de assay-kwaliteit te verbeteren. Wij ook nooit getest of oplosmiddelen dan DMSO aanvaardbaar zou zijn, maar de verwachting uit ervaring met andere opname technologieën dat vergelijkbare concentraties van EtOH of MeOH ook aanvaardbaar zou zijn. Over het algemeen gebruiken we hiPSC-CMs van dezelfde fabrikant en cellen van slechts één extra leverancier werden getest, die leek te werken op een vergelijkbare manier. Evenzo hebben we slechts een klein aantal verschillende batches instellen voor hiPSC-CMs die werden geselecteerd door prechecking hen om te verifiëren dat ze zich ook aan de eerste partij gedragen gebruikt. Één of twee partijen werden geacht ongepast omdat hun syncytia had slechte stabiliteit of de reproduceerbaarheid onder de kweekomstandigheden gebruikt hier. Anders, de farmacologie verscheen zeer gelijkaardig over partijen bij het testen van een beperkte panel van "typische" verbindingen (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, en E-4031, evenals endothelin, isoproterenol, amlodipine en ponesimod). We gebruikten alleen hiPSC-CM afgeleid van gezonde donoren. Het kan zijn moeite waard om te beoordelen of hiPSC-CM afgeleid van patiënten met hart-en vaatziekten zou het bieden van verschillende resultaten, hoewel geen verschil tussen gezonde donoren en patiënten werd waargenomen bij de beoordeling van de cardiotoxicity van tyrosine kinase remmers 12. tot slot wachten we normaal 22 – 28 dagen in cultuur voor het meten van effecten van de drug: in onze ervaring met impedantie opnames van dezelfde cellen, een stationaire toestand voor langzaam impedantie (een indicator van de cel laag stabiliteit) en snelle impedantie (indicatie voor verslaan frequentie) wordt bereikt na 12-15 dagen in cultuur. Echter besloten we te wachten 22-28 dagen, want dit is de tijd wanneer het profiel van de expressie van cardiale kanalen en rijping markers13heeft gestabiliseerd. Het werd niet onderzocht of vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen als de cellen werden gebruikt eerder of later.
Het protocol beschreven gebruikt hier een heel eenvoudig meten van de spontane kloppend tarief van hiPSC-CM om te evalueren van potentiële effecten van de drug op menselijke cardiale electrofysiologie. De belangrijkste voordelen ten opzichte van andere methoden zijn dat i) het is vatbaar voor een high-throughput screening omgeving, ii) het registreert de activiteit van de cardiomyocytes en de effecten van drugs bij fysiologische temperaturen en iii) het is niet noodzakelijk elektrofysiologische expertise voor de uitvoering of voor een beoordeling van de resultaten.
In een valideringsstudie uitgevoerd met veel drugs goedgekeurd voor menselijk gebruik, toonden we dat de bepaling op de geneesmiddelen die gebruikt worden in de menselijke geneeskunde zoals voorspeld door de bestaande klinische gegevens5 reageert. Omdat deze methode alle potentiële effecten op de cardiale ritme beschouwt, het is een aanvulling op de uitgebreide in vitro Proarrhythmic assay (CiPA) initiatief14 die specifiek pro-aritmische potentieel beoordeelt.
Deze methode kan in de toekomst bieden een verder inzicht in de modus-in-actie van drugs aan invloed hebben op de spontane gewonnen die getoond. Het is waarschijnlijk dat aanvullende mechanistische informatie aanwezig in de opnames van de fluorescentie van Ca transiënten (b.v.in hun amplitude of vorm is). De fluorescentie-opnames worden uitgevoerd op hogere overname tarieven (b.v., 30 Hz), deze parameters zijn gemakkelijk gewonnen naast verslaan tarief als het wellicht interessant om veranderingen in deze parameters correleren met de bekende gevolgen van klinisch drugs gebruikt.

Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van de effecten van de drug op de frequentie van spontane afstraffing van syncytia van hiPSC-CM op fysiologisch relevante ritmes. Mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen differentiëren tot functionele cardiomyocytes dat spontaan kloppend syncytia in vitro1,2,3,4 opzet. Deze hiPSC-CM kan worden verkregen in grote aantallen via commerciële aanbieders of productie in het laboratorium, en ze zijn een nuttige bron van cellen voor het genereren van modellen van menselijke cardiale fysiologie en farmacologie. In het bijzonder, kunnen ze worden gebruikt om te voorspellen of te karakteriseren cardiale effecten die optreden kunnen wanneer een geneesmiddel wordt toegediend aan mens5.
De frequentie van de afstraffing van hiPSC-CM syncytia kan worden gemeten onder fysiologische omstandigheden met micro-elektrode matrices of impedantie sensing1: deze noninvasive technieken zeer gedetailleerde informatie verstrekken over de effecten van de drug, maar ze zijn nogal lage-doorvoer en ze Schakel niet testen van grote samengestelde bibliotheken binnen realistische tijd en budgettaire beperkingen. Een effectiever systeem kan worden uitgewerkt met behulp van een 384-well fluorescentie afleesapparaat imaging en een Ca-gevoelige kleurstof6, maar klassieke plaat lezers worden belemmerd door suboptimaal temperatuur controle en overname frequentie. Deze beperkingen worden geïllustreerd door unphysiological kloppend tarieven (~ 15 bpm, in vergelijking met 35-55 bpm in gecontroleerde omgevingen1) en slechte Ca signaal resolutie (de frequentie van een overname van 8 Hz is bij de lagere limiet voor record tarieven die oplopen 120 bpm tot kan onder de voorwaarden van het gestimuleerd, en het kan geen informatie zoals de helling of duur uitpakken). De hier beschreven methode combineert de opname van het verslaan van patronen op fysiologische ritmes en voldoende resolutie te sluiten deze bezorgdheid.
Aan de positieve kant is deze methode eenvoudig, betrouwbaar en hoge doorvoer, waarmee het snelle testen van grote aantallen verbindingen tegen een redelijke prijs. Aan de negatieve kant, deze methode vereist een snelle afleesapparaat met effectieve temperatuurcontrole, die een dure investering is, en het beetje mechanistische informatie over drugs van de waargenomen effecten, die kunnen vergen nader onderzoek met meer gedetailleerde methoden.
Ongeveer 6 x 106 hiPSC-CM zijn nodig voor een meting in een 384-well cel plaat. hiPSC-CM worden meestal commercieel geleverd als bevroren aliquots ~ 4 x 106 cellen in 1 mL. Daarom is het handig om de voorbereiding twee cel platen met drie bevroren aliquots. In de meeste gevallen, als gevolg van de lage variabiliteit van deze assay, volstaat het te voeren dubbele metingen van de test-verbindingen, in elke cel plaat, quadruplicate metingen van de positieve controle (forskolin N6-cyclopentyl-adenosine en E-4031), en 20-plicate metingen van de negatieve controle (DMSO alleen). Daarom kan een maximum van 352 samengestelde/concentratie paren met twee 384-well cel platen worden geëvalueerd. Het volgende protocol beschouwt dergelijke een experiment uitgevoerd met 352 test verbindingen, twee cel platen en 12 miljoen cellen geleverd als drie bevroren aliquots; het kan gemakkelijk schaal-up worden als aanvullende gegevenspunten nodig zijn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

Spontaan verdragsluitende syncytia van cardiomyocytes afgeleid van mens-geïnduceerde pluripotente zijn stamcellen (hiPSC-CM) een nuttig model van menselijke cardiale fysiologie en farmacologie. Verschillende methoden hebben voorgesteld om deze spontane activiteiten te leggen en om te evalueren van de effecten van de drug, maar veel van deze methoden lijden beperkt debiet en/of fysiologische relevantie. Wij ontwikkeld een high-throughput screening systeem om te kwantificeren van de effecten van exogene verbindingen op hiPSC-CM kloppend frequentie, met behulp van een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof en een temperatuurgevoelig imaging multi goed afleesapparaat. We beschrijven hoe voor te bereiden op de platen van de cel en de samengestelde platen en het uitvoeren van de automatische bepaling te bereiken hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid. Ook beschrijven we hoe om te transformeren en analyseren van de gegevens van de fluorescentie om betrouwbare maatregelen van effecten van de drug op spontane ritme. Deze test kan in drug discovery-programma's worden gebruikt bij chemische optimalisatie van, of naar, verbindingen op het gebied van menselijke hartfunctie.

Figuur 1 toont een representatieve opname van Ca golven op basislijn over een 384-well plaat. In de meeste gevallen onthullen alle putjes een regelmatige kloppend tarief met variëren over de plaat (bedoel ± SD = 40.1 ± 3,5 HSM; bereik = 34-54 bpm). Heel af en toe (minder dan 1 van de 10 experimenten), een paar putten (minder dan 5) hebben aritmie of gebrek aan ritme. In drie 384-Wells-platen, wij hebben ook geprobeerd cardiomyocytes van een andere leverancier (Zie Tabel van materialen) en behaalde zeer vergelijkbare waarden volgens de basislijn voor de spontane gewonnen.
Blokkers van cardiale ionenkanalen van invloed zijn op het ritme van de cardiomyocytes in een reproduceerbare wijze5. Amlodipine, een blocker van de langzame Ca kanalen9, versnelt het ritme van meer dan 100% in een concentratie-afhankelijke manier tot 1 µM (figuur 2A). Het effect is goed ontwikkeld binnen de eerste 5 min, maar het stijgt nog steeds ongeveer 50% binnen de volgende 30 min voordat het stabiliseert. Boven 1 µM, amlodipine arresteert de afstraffing (onderbroken lijnen), zoals kan worden verwacht uit het feit dat Ca fietsen is cruciaal voor de spontane weeën. Andere selectieve dihydropyridine Ca kanaal blokkers produceren zeer soortgelijke effecten.
E-4031, een blocker van de snelle vertraagde gelijkrichter K kanalen10, wordt vertraagd het ritme ongeveer 65-70% in een concentratie-afhankelijke manier tot 10 µM (figuur 2B). Het effect ontwikkelt binnen de eerste 5 min en het doet niet variëren binnen de volgende 60 min. Andere selectieve IKr-blokkers produceren een soortgelijk resultaat oplevert, hoewel de maximale verlaging tarief variëren kan (b.v., 35-40% voor cisapride, 70% voor E-4031, en 90% - 95% voor dofetilide). De basis voor deze ongelijkheid is niet bekend.
Tetrodotoxine, een blocker van de snelle Na kanalen11, wordt vertraagd het ritme ongeveer 15% op een concentratie-afhankelijke manier, tot 1-30 µM (figuur 2C). Het effect is goed ontwikkeld binnen de eerste 5 min en het doet niet veel binnen de volgende 60 min variëren. Echter, boven 30 µM, tetrodotoxine arresteert de afstraffing binnen de eerste 5 min, overwegende dat na 30 min, het het boven 1 µM arresteert. Andere nb kanaal blokkers, zoals lidocaïne of mexiletine, veroorzaken soortgelijke niks effecten.
Bepridil, een gemengde Bloqueur van cardiale nb, Ca en K kanalen9, produceert ook een niks effect (figuur 2D). Dit suggereert dat in dit preparaat, een blok van nb kanalen de primaire actie voor bepridil is. Een versnelling als gevolg van Ca kanaal blok is niet gezien, en de meer progressieve vertragen als gevolg van IKr blok verschijnt gemaskerde door het nb kanaal effect.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> Figuur 1: vertegenwoordiger basislijn Ca golven over een 384-well-plate. (A) alle putjes in de plaat tonen een regelmatige kloppend tarief met variëren. Dit beeld is gevangen rechtstreeks vanuit de software van de lezer van de plaat. Elke trace is 10 s in duur. De intensiteit van de fluorescentie is willekeurig (relatieve licht eenheden afgeleid van de videocamera grijswaarden). (B) deze blow-up van één 10 s trace toont de lage ruis van het signaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> Figuur 2: vertegenwoordiger effecten van cardiale ion kanaal blokkers. Deze panelen weergeven concentratieresponskrommen met (A) de selectieve Ca kanaal blocker amlodipine, (B) de selectieve IKr blocker E-4031, (C) de selectieve nb kanaal blocker TTX, en (D) het niet-selectieve kanaal Blocker bepridil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Spontaan verdragsluitende syncytia van cardiomyocytes afgeleid van mens-geïnduceerde pluripotente zijn stamcellen nuttige modellen van menselijke cardiale fysiologie en farmacologie. Hier presenteren we een high-throughput screening systeem voor het kwantificeren van de effecten van exogene verbindingen op het verslaan van de frequentie, met behulp van een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof en een temperatuurgevoelig imaging multi goed afleesapparaat.

Contracties van mens-iPSC-afgeleide Cardiomyocyte Syncytia gemeten met een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof in temperatuurgevoelig 384-Wells-platen

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hartveiligheid farmacologie. Heeft een nieuw menselijk geneesmiddel bijvoorbeeld het risico om het normale hartritme aan te passen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het grote aantallen verbindingen snel en tegen een gematigde prijs kan evalueren.Het aantonen van de procedure zal Camille Forny zijn, een onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium. Om voor te bereiden op de meting van de samentrekkingen van syncytia van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, of HIPSCCMs, beginnen met het plaatsen van CryoTubes met bevroren cellen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten. Breng de volledige ontdooide gecelleerde suspensie van elke buis over naar één enkele, verse conische buis van 50 milliliter.Om de overgebleven cellen op te halen, was elke buis met een milliliter van 37 graden Celsius voorverwarmd beplating medium en voeg dit medium toe aan de 50 milliliter conische buis met ontdooide cellen. Voeg acht milliliter warm beplatingsmedium toe aan de buis en meng de suspensie voorzichtig door elkaar. Gebruik trypan blauwe uitsluitingsmethode en een hemocytometer om levende cellen te tellen.Door warme beplating medium toe te voegen, pas de concentratie aan 50.000 cellen per milliliter. Om de cellen te verdelen in twee nieuwe 384-well celkweekplaten, voeg 25 microliter aan elke put, die ongeveer 12.500 cellen per put zal opleveren. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in 384-goed platen in bevochtigde atmosfeer met 5% kooldioxide voor een totaal van drie tot vier weken.De volgende dag, vervang het beplating medium met 50 microliter van warm onderhoud medium. Vervang daarna de helft van het onderhoudsmedium om de twee tot drie dagen. Op dag zeven, 14 en 21 vervangt u het medium volledig.Zodra de cellen zijn gehandhaafd in de cultuur voor drie tot vier weken, ze hebben spontaan gecontracteerd syncytia gevormd, en het effect van verbindingen op deze samentrekkingen kan worden gemeten. Op de dag van de test moet ten minste twee uur voordat de eerste celplaat in de plaatlezer wordt geplaatst voor de meting, de lezer inschakelen en het verwarmingssysteem op 37 graden Celsius instellen. Ter voorbereiding van de samengestelde platen, warm tot kamertemperatuur 40 milliliter onderhoud medium aangevuld met 1%volume-per-volume penicilline streptomycine.Terwijl het medium is opwarmen, verdeel de testverbindingen en de controles in twee 384-well samengestelde platen door het toevoegen van 1,5 microliter van voorraad oplossing per goed. Centrifugeren de samengestelde platen op 100 G voor een minuut. Voeg 37 microliter onderhoudsmedium toe aan elke put en centrifuge de platen gedurende één minuut opnieuw op 100 G.Ter voorbereiding van de fluorescerende kleurstof, warme 100 milliliter onderhoud medium aangevuld met 1%volume-per-volume penicilline streptomycine in een 37 graden Celsius waterbad. Voeg vervolgens 10 milliliter van het opgewarmde medium toe aan de mix van calciumgevoelige fluorescerende kleurstof en quencher om ze opnieuw samen te stellen als een voorraadfluorescentiemedium. Start de plaatlezer software.Bereid de software voor om een twee minuten durende segment van calciumgolven op te nemen met een acquisitiefrequentie van ten minste 10 hertz. Om fluorescentie medium voor elke celplaat te maken, verdun drie milliliter voorraadfluorescentiemedium met 12 milliliter warm onderhoudsmedium met antibiotica. Vervang 20 microliter medium in elke put van de celplaat door 30 microliter fluorescentiemedium en meng door één keer op en neer te pipetten.Plaats de plaat direct daarna in een plaatlezer om de HIPSCCMs gedurende 60 minuten aan te passen aan de lezertemperatuur. Start vervolgens de software voor de plaatlezer. Noteer een twee minuten segment van calciumgolven met een acquisitiefrequentie van ten minste 10 hertz om de baseline beating rate voor elke put te definiëren.Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de celplaat niet uit het apparaat wordt overgebracht na het verkrijgen van gegevens. Bij sommige softwareversies moet u de opname stoppen voordat deze volledig eindigt. Gebruik de plaatlezerrobot om vijf microliter van de test- en referentieverbindingen goed tot wel van de samengestelde plaat in de celplaat te pipette.Daarna start u met de gegevensverwerving in de plaatlezersoftware om twee minuten segmenten calciumgolven op te nemen vanaf vijf, 15, 30, 45 en 60 minuten na de toevoeging van de verbinding. Als u gegevensanalyse wilt starten, exporteert u de ruwe gegevens voor elke opnameperiode uit de plaatlezersoftware in ASCII-tekstbestanden. En importeer ze dan in data-analyse software.Exporteer vanuit de data-analysesoftware de primaire afstraffingsfrequenties voor elke opnameperiode als klembordkopieën. Haal de primaire afstraffingsfrequentie voor elke put en elk keer punt. Ten slotte, importeer de afstraffingsfrequenties in een spreadsheetsoftware door klembord plakken en zet de gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol voort.Registratie van calciumgolven bij baseline over een 384-put plaat toont aan dat in de meeste gevallen alle putten onthullen een regelmatige paksnelheid met weinig variabiliteit over de plaat. Wanneer blokkers van cardiale ionenkanalen worden toegevoegd, beïnvloeden ze het ritme van de cardiomyocyten. Amlodipine, een blokker van de langzame calciumkanalen, versnelt het ritme meer dan 100% op een concentratieafhankelijke manier tot één micromolar.En daarboven arresteert Amlodipine de mishandeling. E-4031, een blokker van de snel vertraagde rectifier kaliumkanalen vertraagt het ritme ongeveer 65 tot 70% op een concentratie afhankelijke manier tot 10 micromolar. Tetrodotoxine, een blokker van de snelle natriumkanalen vertraagt het ritme ongeveer 15% op een concentratieafhankelijke manier tot één tot 30 micromolar, terwijl boven 30 micromolar, tetrodotoxine het slaan binnen de eerste vijf minuten arresteert.Bepridil, een gemengde blokker van cardiale natrium-, calcium- en kaliumkanalen produceert ook een alles-of-niets-effect, wat suggereert dat natriumkanaalblok de primaire werking van bepridil is. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om zeer zacht te zijn bij pipetting in de cel cultuur plaat. Deze weefsels zijn zeer kwetsbaar en gemakkelijk beschadigd als aangeraakt door pipetten.Vergeet niet dat het werken met menselijke cellen en actieve geneesmiddelen gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van veiligheidshandschoenen en een bril moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Medicine

Unit 1

Cardiovascular Drugs: Antihypertensive Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Voerdraad Assisted catheterisatie en kleurstof Injectie voor Vasculaire in kaart brengen van monochoriale placenta&#39;s Twin

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Ontwikkeling van een Audio-based Virtual Gaming Milieu om te helpen met Navigatie Vaardigheden in het Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Shrinkage of Dental Composite in Simulated Cavity Measured with Digital Image Correlation

Krimp van Dental Composite in Gesimuleerde Cavity Gemeten met Digital Image Correlation

Polymerization shrinkage of dental resin composites can lead to restoration debonding or cracked tooth tissues in composite-restored teeth. In order to ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Noninvasive bepaling van Vortex vorming tijd met behulp van Transesophageal echocardiografie tijdens Cardiale Heelkunde

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Een Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury met Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Intrathecal Application of a Fluorescent Dye for the Identification of Cerebrospinal Fluid Leaks in Cochlear Malformation

Intrathecale toepassing van een fluorescerende kleurstof voor de identificatie van cerebrospinale vloeistoflekken in cochleaire misvorming

In cases of cerebrospinal fluid (CSF) leaks, reliable detection of their origins is needed to seal the leak sufficiently and prevent complications, such ...