Name: contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00
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	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

दो पहलुओं की धड़कन आवृत्तियों की सफल रिकॉर्डिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैं. पहले सेल चढ़ाना और संस्कृति के साथ सावधानी बरतें । विशेष रूप से, यह प्रयास करने के लिए और माध्यम का आदान प्रदान जब कुओं के तल पर सेल परत scratching से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यह पिपेट के साथ कुओं के नीचे छूने के लिए स्वीकार्य है, लेकिन एक ही कोण हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जिससे सेल परत में केवल एक छोटे खरोंच उत्पादन और परख प्रदर्शन को प्रभावित नहीं । reproducible सजातीय लय प्राप्त करने का दूसरा महत्वपूर्ण पहलू माप की अवधि के लिए सेल प्लेट भर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर अच्छा तापमान नियंत्रण प्रदान करने के लिए है । हम इस एकरूपता थाली पाठक के अलावा अंय उपकरणों का उपयोग कर प्राप्त नहीं कर सकता यहां इस्तेमाल किया, लेकिन यह तापमान विनियमन के लिए विशेष संशोधनों के साथ संभव हो सकता है: यह प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया जाएगा और अधिक मोटे तौर पर थाली का एक ब्रांड से परे प्रयोग करने योग्य रीडर. यहाँ प्रयुक्त डिवाइस के साथ प्रयोग की अवधि के लिए तापमान स्थिरता प्राप्त करने के लिए, यह एक रिकॉर्डिंग समाप्त होने से पहले बंद करने के लिए आवश्यक था; अंयथा, रोबोट मापा सेल प्लेट बेदखल होगा । इस तकनीकी मुद्दे प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर के अगले रिलीज के साथ गायब हो सकता है, लेकिन यह अब के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है । यदि एक सेल प्लेट गलती से प्लेट रीडर के बाहर स्थानांतरित कर दिया है, यह वापस के रूप में संभव के रूप में तेजी से अंदर लोड किया जाना चाहिए । फिर भी, प्रयोग की गुणवत्ता खराब हो जाएगी, क्योंकि तापमान परिवर्तन धड़कन दर को बेहद तेजी से प्रभावित करते हैं ।
कुछ अंय पहलुओं, जो अच्छी तरह से परीक्षण नहीं किया गया है, कम महत्वपूर्ण हो सकता है । उदाहरण के लिए, hiPSC-मुख्यमंत्री निर्माताओं की कोशिकाओं को बोने से पहले कोटिंग सेल संस्कृति प्लेट की सिफारिश, लेकिन इस विशिष्ट परख में, कोटिंग इस्तेमाल नहीं किया गया था, क्योंकि कोशिकाओं विभिन्न सतहों पर काफी आसानी से पालन, और यह ठीक से बहुत मुश्किल है कोट ३८४-अच्छी तरह से प्लेटें. अभी तक, सेल प्लेट कोटिंग अभी भी स्वीकार्य हो सकता है, या यह भी परख गुणवत्ता में सुधार हो सकता है । हम यह भी परीक्षण किया कि सॉल्वैंट्स DMSO के अलावा अंय स्वीकार्य होगा कभी नहीं, लेकिन यह अंय रिकॉर्डिंग प्रौद्योगिकियों कि ेतोः या MeOH के समान सांद्रता भी संतोषजनक होगा के साथ अनुभव से उंमीद है । हम आम तौर पर एक ही निर्माता से hiPSC सीएमएस का उपयोग करें, और केवल एक अतिरिक्त आपूर्तिकर्ता से कोशिकाओं का परीक्षण किया गया, जो एक समान तरीके से काम दिखाई दिया । इसी तरह, हम hiPSC-सीएमएस के विभिंन बैचों की केवल एक छोटी संख्या का इस्तेमाल किया है कि उंहें जांच करने के लिए सत्यापित करें कि वे प्रारंभिक बैच के समान व्यवहार से चुना गया । एक या दो बैचों को अनुपयुक्त समझा गया क्योंकि उनके syncytia ने यहाँ प्रयुक्त संस्कृति स्थितियों के अंतर्गत खराब स्थिरता या reproducibility की थी. अंयथा, औषध विज्ञान "ठेठ" यौगिकों (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से endothelin, isoproterenol, amlodipine, और ponesimod) के एक सीमित पैनल परीक्षण जब बैचों भर में बहुत समान दिखाई दिया । हम केवल hiPSC-मुख्यमंत्री स्वस्थ दाताओं से व्युत्पंन का इस्तेमाल किया । यह आकलन करने के लिए सार्थक हो सकता है कि hiPSC-मुख्यमंत्री हृदय रोग के साथ रोगियों से व्युत्पंन अलग परिणाम प्रदान करेगा, हालांकि स्वस्थ दाताओं और रोगियों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था जब tyrosine कळेनासे अवरोधकों के cardiotoxicity का मूल्यांकन 12. अंत में, हम आम तौर पर 22 इंतजार-संस्कृति में 28 दिनों के लिए दवा प्रभाव को मापने से पहले: एक ही कोशिकाओं के प्रतिबाधा रिकॉर्डिंग के साथ हमारे अनुभव में, धीमी गति से प्रतिबाधा के लिए एक स्थिर राज्य (कोशिका परत स्थिरता का एक संकेतक) और तेजी से प्रतिबाधा (एक संकेतक की धड़कन आवृत्ति) संस्कृति में 12-15 दिनों के बाद पहुंच जाता है । हालांकि, हम 22 प्रतीक्षा करने का फैसला किया-28 दिन, क्योंकि यह समय है जब कार्डियक चैनल और परिपक्वता मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल13स्थिर है । यह जांच नहीं की गई कि क्या तुलनीय परिणाम प्राप्त किए जाएंगे यदि कक्षों का पहले या बाद में उपयोग किया गया था ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर संभावित दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए hiPSC के सहज पिटाई की दर का एक बहुत ही सरल माप का उपयोग करता है । इसके अंय तरीकों से अधिक मुख्य लाभ कर रहे है कि मैं) यह एक उच्च प्रवाह जांच पर्यावरण के लिए उत्तरदाई है, द्वितीय) यह cardiomyocytes की गतिविधि और शारीरिक तापमान पर दवाओं के प्रभाव, और iii) रिकॉर्ड यह आवश्यकता नहीं है निष्पादन के लिए या परिणामों के आकलन के लिए विशेषज्ञता electrophysiological ।
एक मांयता कई मानव उपयोग के लिए अनुमोदित दवाओं के साथ प्रदर्शन का अध्ययन में, हमने दिखाया है कि परख मानव चिकित्सा में इस्तेमाल के रूप में मौजूदा नैदानिक डेटा5द्वारा भविष्यवाणी की दवाओं के प्रति प्रतिक्रिया करता है । क्योंकि यह विधि हृदय ताल पर सभी संभावित प्रभाव समझता है, यह इन विट्रो Proarrhythmic परख (सिपा) पहल14 कि विशेष रूप से प्रो-arrhythmic क्षमता का आकलन में व्यापक पूरक ।
भविष्य में, इस विधि को सहज पिटाई की दर को प्रभावित दिखाया दवाओं की विधा की कार्रवाई की एक और समझ प्रदान कर सकता है । यह संभावना है कि अतिरिक्त यंत्रवत जानकारी सीए यात्रियों (जैसे, उनके आयाम या आकार में) की प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग में मौजूद है । प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग उच्च अधिग्रहण दर (जैसे, 30 हर्ट्ज) पर प्रदर्शन कर रहे हैं, तो इन मापदंडों की धड़कन दर के अलावा आसानी से निकाले जाते हैं, और यह ज्ञात प्रभाव के साथ इन मापदंडों में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए दिलचस्प हो सकता है चिकित्सकीय इस्तेमाल किया दवाओं ।

वर्तमान प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से प्रासंगिक लय में hiPSC के syncytia की सहज धड़कन आवृत्ति पर दवा प्रभाव को मापने के लिए एक विधि को दर्शाया गया है. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं कार्यात्मक cardiomyocytes है कि सहज इन विट्रो1,2,3,4में syncytia धड़कन की स्थापना में अंतर कर सकते हैं । इन hiPSC-सेमी बड़ी संख्या में वाणिज्यिक प्रदाताओं के माध्यम से या प्रयोगशाला में उत्पादन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, और वे कोशिकाओं का एक उपयोगी स्रोत मानव कार्डियक फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के मॉडल उत्पन्न कर रहे हैं. विशेष रूप से, वे भविष्यवाणी करने के लिए या हृदय प्रभाव है कि जब एक दवा मनुष्यों5के लिए प्रशासित किया जाता है हो सकता है की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
hiPSC की धड़कन आवृत्ति-सेमी syncytia microelectrode arrays या1संवेदन प्रतिबाधा का उपयोग शारीरिक स्थितियों के तहत मापा जा सकता है: इन गैर इनवेसिव तकनीक दवा प्रभाव पर बहुत विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन वे कर रहे हैं बल्कि कम प्रवाह और वे यथार्थवादी समय और बजट की कमी के भीतर बड़े यौगिक पुस्तकालयों परीक्षण सक्षम नहीं है । एक अधिक प्रभावी प्रणाली एक ३८४-अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्लेट रीडर और एक Ca-संवेदनशील डाई6का उपयोग कर सविस्तार किया जा सकता है, लेकिन शास्त्रीय प्लेट पाठकों को इष्टतम तापमान नियंत्रण और अधिग्रहण आवृत्ति द्वारा रुकावट हैं । इन सीमाओं को दैहिक धड़कन दर से सचित्र (~ 15 bpm, 35 की तुलना में कर रहे है-55 नियंत्रित वातावरण में bpm1) और गरीब Ca संकेत संकल्प (8 हर्ट्ज की एक अधिग्रहण आवृत्ति के लिए कम सीमा पर है रिकॉर्ड दरों कि तक पहुंच सकते है १२० bpm उत्तेजित शर्तों के अंतर्गत, और यह जानकारी जैसे प्रवणता या अवधि नहीं निकाल सकता) । विधि यहां वर्णित शारीरिक लय में पिटाई पैटर्न की रिकॉर्डिंग को जोड़ती है और पर्याप्त संकल्प पर इन चिंताओं को बाधा ।
सकारात्मक पक्ष पर, इस विधि सरल, विश्वसनीय है, और उच्च प्रवाह, जो उचित मूल्य पर यौगिकों की बड़ी संख्या के तेजी से परीक्षण की अनुमति देता है । नकारात्मक पक्ष पर, इस विधि प्रभावी तापमान नियंत्रण है, जो एक महंगा निवेश है के साथ एक तेज प्लेट रीडर की आवश्यकता है, और यह मनाया दवा प्रभाव है, जो और अधिक विस्तृत के साथ आगे परीक्षण जरूरत सकता है पर थोड़ा यंत्रवत जानकारी प्रदान करता है विधियों.
Approximatively 6 x 106 hiPSC-CM १ ३८४-well सेल प्लेट में एक माप के लिए आवश्यक हैं । hiPSC-सेमी आमतौर पर 1 मिलीलीटर में ~ 4 x 106 कोशिकाओं के जमे हुए aliquots के रूप में वाणिज्यिक आपूर्ति कर रहे हैं । इसलिए, यह तीन जमे हुए aliquots के साथ दो सेल प्लेट तैयार करने के लिए सुविधाजनक है । ज्यादातर मामलों में, इस परख की कम परिवर्तनशीलता के कारण, यह परीक्षण यौगिकों के डुप्लिकेट माप प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है और, प्रत्येक कोशिका थाली में, सकारात्मक नियंत्रण के quadruplicate माप (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१), और 20-नकारात्मक नियंत्रण के plicate माप (अकेले DMSO) । इसलिए, ३५२ यौगिक/एकाग्रता जोड़े की एक अधिकतम २ ३८४-well सेल प्लेट के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । निंन प्रोटोकॉल मानता है कि इस तरह के एक प्रयोग ३५२ परीक्षण यौगिकों, दो सेल प्लेटें, और १२,०००,००० तीन जमे हुए aliquots के रूप में आपूर्ति की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया; यदि अतिरिक्त डेटा बिंदुओं की आवश्यकता हो तो इसे आसानी से स्केल किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

सहज मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC-सेमी) से व्युत्पंन cardiomyocytes के syncytia करार मानव कार्डियक फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान का एक उपयोगी मॉडल हैं । विभिंन तरीकों के लिए इस सहज गतिविधि रिकॉर्ड और नशीली दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने का प्रस्ताव किया गया है, लेकिन इन तरीकों के कई सीमित प्रवाह से ग्रस्त है और/ हम एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रणाली विकसित करने के लिए hiPSC पर exogenous यौगिकों के प्रभाव-मुख्यमंत्री की पिटाई आवृत्ति, एक सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एक तापमान नियंत्रित इमेजिंग बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर । हम कैसे सेल प्लेटें और यौगिक प्लेटें तैयार करने के लिए और कैसे उच्च संवेदनशीलता और reproducibility प्राप्त करने के लिए स्वचालित परख चलाने के लिए वर्णन । हम यह भी वर्णन कैसे प्रतिदीप्ति डेटा को बदलने और विश्लेषण करने के लिए सहज लय पर नशीली दवाओं के प्रभाव के विश्वसनीय उपाय प्रदान करते हैं । इस परख दवा खोज कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया जा सकता से दूर रासायनिक अनुकूलन गाइड, या की ओर, मानव हृदय समारोह को प्रभावित यौगिकों ।

चित्रा 1 १ ३८४-अच्छी तरह से थाली में आधारभूत पर सीए तरंगों के एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग से पता चलता है । ज्यादातर मामलों में, सभी कुओं थाली भर में थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ एक नियमित रूप से धड़कन दर पता चलता है (मतलब ± एसडी = ४०.१ ± ३.५ बीपीएम; रेंज = 34 – 54 बीपीएम). बहुत समय से (10 प्रयोगों में से कम 1 से), कुछ कुओं (5 से कम) अतालता या लय के अभाव है । ३ ३८४ में अच्छी तरह से प्लेटें, हम भी एक और आपूर्तिकर्ता से cardiomyocytes की कोशिश की है ( सामग्री की तालिकादेखें) और सहज धड़कन के लिए बहुत ही आधारभूत मूल्यों प्राप्त की ।
हृदय आयन चैनलों के ब्लॉकर्स एक reproducible तरीके से5में cardiomyocytes की लय को प्रभावित करते हैं । Amlodipine, धीमी गति से सीए चैनल9के एक अवरोधक, लय में १००% से अधिक एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से तेज 1 µ m (चित्रा 2a) । प्रभाव अच्छी तरह से पहले 5 मिनट के भीतर विकसित की है, लेकिन यह अभी भी बढ़ जाती है approximatively ५०% अगले 30 मिनट के भीतर इससे पहले कि स्थिर । 1 µ मीटर से ऊपर, amlodipine गिरफ्तारी (धराशायी लाइनें), के रूप में तथ्य यह है कि सीए सायक्लिंग सहज संकुचन के लिए महत्वपूर्ण है से उंमीद की जा सकती है । अन्य चुनिंदा dihydropyridine सीए चैनल ब्लॉकर्स बहुत इसी तरह के प्रभाव का उत्पादन ।
ई-४०३१, तेजी से देरी दिष्टकारी कश्मीर10चैनलों के एक अवरोधक, decelerates के बारे में लय ६५-७०% एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से 10 µ एम (चित्रा बी8) के लिए । प्रभाव पहले 5 मिनट के भीतर विकसित करता है और यह अगले ६० मिनट के भीतर भिंन नहीं है । अंय चुनिंदा यकृ ब्लॉकर्स इसी तरह के प्रभाव का उत्पादन, हालांकि दर में अधिक से अधिक कमी (जैसे, ३५-४०% cisapride के लिए, ई के लिए ७०%-४०३१, और ९०%-९५% dofetilide के लिए भिंन हो सकते हैं) । इस असमानता का आधार ज्ञात नहीं है ।
Tetrodotoxin, तेजी से ना चैनलों के एक अवरोधक11, decelerates एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके में 15% के बारे में लय, अप करने के लिए 1–30 µ m (चित्रा 2c). प्रभाव अच्छी तरह से पहले 5 मिनट के भीतर विकसित की है और यह अगले ६० मिनट के भीतर ज्यादा भिंनता नहीं है । हालांकि, 30 µ मीटर से ऊपर, tetrodotoxin पहले 5 मिनट के भीतर पिटाई की गिरफ्तारी, जबकि 30 मिनट के बाद, यह 1 µ मीटर से ऊपर गिरफ्तार । ऐसे lidocaine या mexiletine के रूप में अंय एनए चैनल ब्लॉकर्स, समान सभी या कुछ प्रभाव का उत्पादन ।
Bepridil, कार्डियक एनए, Ca के एक मिश्रित अवरोधक, और कश्मीर चैनल9, यह भी एक सब या कुछ नहीं प्रभाव (चित्रा 2d) पैदा करता है । यह पता चलता है कि इस तैयारी में, एनए चैनलों के एक ब्लॉक bepridil की प्राथमिक कार्रवाई की है । सीए चैनल ब्लॉक के कारण एक त्वरण नहीं देखा जाता है, और यकृ ब्लॉक के कारण अधिक प्रगतिशील धीमा न चैनल प्रभाव से नकाबपोश प्रतीत होता है.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> चित्रा 1: एक ३८४-अच्छी तरह से थाली भर प्रतिनिधि आधारभूत Ca तरंगों । (क) थाली भर में सभी कुओं थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ एक नियमित रूप से धड़कन दर का प्रदर्शन । इस छवि को प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से सीधे कब्जा कर लिया है । प्रत्येक ट्रेस अवधि में 10 एस है । प्रतिदीप्ति तीव्रता मनमाना है (सापेक्ष प्रकाश इकाइयों वीडियो कैमरा greyscale से व्युत्पंन) । (B) १ १० s ट्रेस का यह झटका सिग्नल के कम शोर से पता चलता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> चित्रा 2: कार्डियक आयन चैनल ब्लॉकर्स के प्रतिनिधि प्रभाव. इन पैनलों दिखाने एकाग्रता-प्रतिक्रिया के साथ घटता (क) चुनिंदा सीए चैनल अवरोधक amlodipine, (ख) चयनात्मक यकृ अवरोधक ई-४०३१, (ग) चयनात्मक ना चैनल अवरोधक TTX, और (घ) गैर चयनात्मक चैनल अवरोधक bepridil । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

सहज मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन cardiomyocytes के syncytia करार मानव हृदय फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के उपयोगी मॉडल हैं । यहाँ हम धड़कन आवृत्ति पर exogenous यौगिकों के प्रभाव यों तो एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रणाली वर्तमान, एक सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एक तापमान नियंत्रित इमेजिंग बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर.

मानव-iPSC-व्युत्पंन Cardiomyocyte Syncytia के संकुचन तापमान में एक Ca-संवेदी फ्लोरोसेंट डाई-नियंत्रित ३८४-well प्लेट्स के साथ मापा

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

यह विधि कार्डियक सुरक्षा फार्माकोलॉजी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। उदाहरण के लिए, क्या एक नई मानव दवा सामान्य हृदय लय को संशोधित करने का जोखिम लेती है? इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह बड़ी संख्या में यौगिकों का तेजी से और मध्यम लागत पर मूल्यांकन कर सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन केमिली Forny, मेरी प्रयोगशाला में एक अनुसंधान सहयोगी होगा । मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, या HIPSCCMs के सिंक्सिटिया के संकुचन की माप के लिए तैयार करने के लिए, दो मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जमे हुए कोशिकाओं वाले क्रायोट्यूब रखकर शुरू करें। प्रत्येक ट्यूब से पूरे गल कोशिकित निलंबन को एक एकल, ताजा 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें।बचे हुए कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस प्रीवार्म्ड प्लेटिंग माध्यम के एक मिलीलीटर से धोएं और इस माध्यम को गल कोशिकाओं वाले 50 मिलीलीटर शंकु नली में जोड़ें। ट्यूब में गर्म चढ़ाना माध्यम के आठ मिलीलीटर जोड़ें और ध्यान से निलंबन मिश्रण। लाइव कोशिकाओं को गिनने के लिए ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।गर्म चढ़ाना माध्यम जोड़कर, प्रति मिलीलीटर 50, 000 कोशिकाओं के लिए एकाग्रता को समायोजित करें। कोशिकाओं को दो नए 384-अच्छी तरह से कोशिका संस्कृति प्लेटों में वितरित करने के लिए, प्रत्येक कुएं में 25 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो प्रति अच्छी तरह से लगभग 12, 500 कोशिकाओं को निकलेगा। कुल तीन से चार सप्ताह के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ आर्द्र वातावरण में ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।अगले दिन, प्लेटिंग माध्यम को गर्म रखरखाव माध्यम के 50 माइक्रोलीटर के साथ बदलें। बाद में, हर दो से तीन दिनों में रखरखाव माध्यम के आधे की जगह । सात, 14 और 21 दिनों में, माध्यम को पूरी तरह से बदल दें।एक बार कोशिकाओं को तीन से चार सप्ताह के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया है, वे अनायास सिंकिटिया करार का गठन किया है, और इन संकुचन पर यौगिकों के प्रभाव को मापा जा सकता है । परख के दिन, पहले सेल प्लेट को माप के लिए प्लेट रीडर के अंदर रखा जाना है, पाठक को चालू करना है और हीटिंग सिस्टम को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करना है। यौगिक प्लेटों को तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान के लिए गर्म रखरखाव माध्यम के 40 मिलीलीटर 1% मात्रा-बाय-वॉल्यूम पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक होते हैं।जबकि माध्यम वार्मिंग है, परीक्षण यौगिकों और नियंत्रण में दो ३८४-अच्छी तरह से यौगिक प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति स्टॉक समाधान के १.५ माइक्रोलीटर जोड़कर वितरित । एक मिनट के लिए 100 जी पर यौगिक प्लेटों को सेंट्रलाइज करें। प्रत्येक कुएं में रखरखाव माध्यम के 37 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेटों को एक मिनट के लिए 100 ग्राम पर फिर से अपकेंद्री करें।फ्लोरोसेंट डाई तैयार करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1% मात्रा-बाय-वॉल्यूम पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक रखरखाव माध्यम के गर्म 100 मिलीलीटर। फिर, कैल्शियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और क्वेंचर के मिश्रण में गर्म माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ताकि उन्हें स्टॉक फ्लोरेसेंस माध्यम के रूप में पुनर्गठित किया जा सके। प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर शुरू करें।कम से कम 10 हर्ट्ज के अधिग्रहण आवृत्ति के साथ कैल्शियम तरंगों के दो मिनट के खंड को रिकॉर्ड करने के लिए सॉफ्टवेयर तैयार करें। प्रत्येक सेल प्लेट के लिए फ्लोरेसेंस माध्यम बनाने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ गर्म रखरखाव माध्यम के 12 मिलीलीटर के साथ स्टॉक फ्लोरेसेंस माध्यम के तीन मिलीलीटर को पतला करें। सेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में माध्यम के 20 माइक्रोलीटर को फ्लोरेसेंस माध्यम के 30 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और एक बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।इसके तुरंत बाद, प्लेट को प्लेट रीडर में रखें ताकि HIPSCCMs को 60 मिनट के लिए पाठक तापमान में समायोजित किया जा सके। इसके बाद प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर शुरू करें। प्रत्येक अच्छी तरह से बेसलाइन बैटिंग रेट को परिभाषित करने के लिए कम से कम 10 हर्ट्ज की अधिग्रहण आवृत्ति के साथ कैल्शियम तरंगों का दो मिनट का सेगमेंट रिकॉर्ड करें।यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि डेटा अधिग्रहण के बाद सेल प्लेट को डिवाइस से बाहर स्थानांतरित नहीं किया गया है। कुछ सॉफ्टवेयर संस्करणों के साथ, आपको रिकॉर्डिंग को पूरी तरह से समाप्त होने से पहले रोकना होगा। प्लेट रीडर रोबोट का उपयोग परीक्षण के पांच माइक्रोलीटर पाइपेट करने के लिए और संदर्भ यौगिकों अच्छी तरह से यौगिक प्लेट से सेल प्लेट में अच्छी तरह से ।उसके बाद, यौगिक जोड़ के बाद पांच, 15, 30, 45, और 60 मिनट से शुरू होने वाले कैल्शियम तरंगों के दो मिनट के खंडों को रिकॉर्ड करने के लिए प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर में डेटा अधिग्रहण शुरू करें। डेटा विश्लेषण शुरू करने के लिए, ASCII टेक्स्ट फाइलों में प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से प्रत्येक रिकॉर्डिंग अवधि के लिए कच्चे डेटा का निर्यात करें। और फिर उन्हें डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात करें।डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर से, क्लिपबोर्ड प्रतियों के रूप में प्रत्येक रिकॉर्डिंग अवधि के लिए प्राथमिक पिटाई आवृत्तियों का निर्यात करें। प्रत्येक अच्छी तरह से और हर बार बिंदु के लिए प्राथमिक पिटाई आवृत्ति निकालें। अंत में, क्लिपबोर्ड चिपकाने के द्वारा एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में पिटाई आवृत्तियों आयात और पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित डेटा विश्लेषण जारी रखने के लिए।एक ३८४-अच्छी तरह से थाली में बेसलाइन पर कैल्शियम तरंगों की रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि ज्यादातर मामलों में सभी कुओं थाली भर में थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ एक नियमित रूप से पिटाई दर प्रकट करते हैं । जब कार्डियक आयन चैनलों के ब्लॉकर्स जोड़े जाते हैं, तो वे कार्डियोमायोसाइट्स की लय को प्रभावित करते हैं। एम्लोडिपाइन, धीमी कैल्शियम चैनलों का अवरोधक, एक माइक्रोमॉलर तक एकाग्रता निर्भर तरीके से 100% से अधिक लय को तेज करता है।और उसके ऊपर, amlodipine पिटाई को गिरफ्तार करता है । ई-4031, तेजी से देरी से सुधारक पोटेशियम चैनलों का एक अवरोधक 10 माइक्रोमोलर तक एकाग्रता निर्भर तरीके से लय के बारे में 65 से 70% तक कम हो जाता है। टेट्रोडोडॉक्सिन, फास्ट सोडियम चैनलों का एक अवरोधक एक से 30 माइक्रोमोलर तक एकाग्रता निर्भर तरीके से लय को लगभग 15% तक कम करता है, जबकि 30 माइक्रोमोलर से ऊपर, टेट्रोडोटॉक्सिन पहले पांच मिनट के भीतर पिटाई को गिरफ्तार करता है।बेप्रिडिल, कार्डियक सोडियम, कैल्शियम और पोटेशियम चैनलों का एक मिश्रित अवरोधक भी एक सभी या कुछ भी प्रभाव पैदा करता है, यह सुझाव देता है कि सोडियम चैनल ब्लॉक बेनिडिल की प्राथमिक कार्रवाई है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, सेल कल्चर प्लेट में पिपटिंग करते समय बेहद कोमल होना याद रखना महत्वपूर्ण है। ये ऊतक बहुत नाजुक होते हैं और आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाते हैं यदि पिपेट से छुआ जाता है।यह न भूलें कि मानव कोशिकाओं और सक्रिय दवाओं के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय सुरक्षा दस्ताने और चश्मा पहनने जैसी सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए।

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Cardiovascular Drugs: Antihypertensive Drugs

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Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

गाइड वायर असिस्टेड और Monochorionic जुड़वा placentas के संवहनी मानचित्रण के लिए रंग डाई इंजेक्शन कैथीटेराइजेशन

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भंवर गठन समय के हृदय शल्य चिकित्सा के दौरान Transesophageal इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग कर के इनवेसिव दृढ़ संकल्प

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A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

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Intrathecal Application of a Fluorescent Dye for the Identification of Cerebrospinal Fluid Leaks in Cochlear Malformation

कॉकलियर कुरूपता में सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड लीक की पहचान के लिए फ्लोरोसेंट डीका इंट्राथेकल एप्लीकेशन

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