Name: contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Авторы имеют без подтверждений.

1. Подготовка сотовый плит
Примечание: Подготовка клетки пластины 3–4 недели до начала измерения воздействия наркотиков.
<ol><li>День 0 эксперимента Примечание: для целей планирования, тест соединения приложение может выполняться на любой день между дней 22–28 эксперимента.<ol>
<li>Поверните на водяной бане при 37 ° C и теплый 40 мл среды покрытие (как поставляемые производителем). Примечание: Используйте клетки с их поставщик условии соответствия культуры и обслуживания средств массовой информации.</li>
		<li>Потепление hiPSC-CM, поместив cryotubes, содержащих замороженные клетки в водяной бане на 2 мин.</li>
		<li>Передать 1 мл суспензии клеток тщательно 50 мл Конические трубки.</li>
		<li>Мыть каждый cryotube с 1 мл теплой обшивка среднего для извлечения оставшихся клетки и добавить мыть СМИ же конической трубки от шаг 1.1.3 содержащих клеток.</li>
		<li>Смесь тщательно еще 8 мл теплой обшивка среднего в суспензию клеток.</li>
		<li>Количество живых клеток, используя метод исключения Трипановый синий и hematocytometer8. Примечание: требования 6 х 106 клеток для одной плиты клетки 384-ну рассматривает возможность до 20% мертвых клеток среди замороженных клеток, который является максимум в нашем опыте.</li>
		<li>Отрегулируйте суспензию клеток 5 x 105 живых клеток/мл с теплым обшивка среднего.</li>
		<li>Распределить суспензию клеток в двух пластин ячейки 384-Ну, добавляя 25 мкл для каждой скважины (около 12 500 ячеек на хорошо). Примечание: Сотовый плит не нужно быть ветротурбин с любой матрицы (см. обсуждение).</li>
		<li>Сохранить клетки пластины при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 день эксперимента<ol>
<li>Поверните на водяной бане при 37 ° C и теплым 50 мл среды обслуживания дополняется раствора пенициллина и стрептомицина 1% v/v.</li>
		<li>Замените среднего покрытие 50 мкл теплое обслуживание среды в каждой скважине сотовый плит.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Дни 2–21 (до 27-й день) эксперимента Примечание: hiPSC-CMs не нужно любой пассированый за этот период, как они, без деления клеток.<ol>
<li>Возобновить половину среднего обслуживания каждые 2–3 дня и возобновить его полностью на 7, 14 и 21 дней. Примечание: Измерения флуоресценции может производиться между дней 22 и 28 эксперимента. Более длинней продолжительности не пробовал, но все еще могут быть в порядке.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. подготовка инструмента, соединения плит и пластин Assay
Примечание: подготовка документа, составные плиты и пробирного пластины в день измерения воздействия наркотиков, между дней 22 и 28 эксперимента. Использование флуоресцентных пластины читателя, с контролем температуры и флуоресценции соответствующего фильтра kit и возбуждения света источника. Например, используйте комплект фильтров флуоресценции Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (возбуждения: 472 Нм; выбросов: 520–560 Нм) и блок источника света возбуждения 150 Вт.
<ol><li>По крайней мере за 2 ч до первой ячейки пластина быть размещены внутри читатель пластины для измерения, включите читателя и системе отопления при температуре 37 ° C. Примечание: это может быть также сделано накануне вечером.</li>
	<li>Подготовьте позитивные элементы, форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031 как фондовый решения 0,33 мм в ДМСО, 10 мм в ДМСО и 3.33 мм H2O, соответственно. Примечание: фондовая решения будет разбавленным 333-fold к тому времени они добавляются к клеткам, и целью является достижение финальный тест концентрации 1 мкм форсколин, 30 мкм N6-cyclopentyl аденозин и 10 мкм E-4031, которые производят надежных и воспроизводимых эффекты.</li>
	<li>Подготовьте 352 испытаний соединений как ДМСО акций решения при 333-fold запланированных испытаний концентрациях (например, 10 мм для теста на 30 мкм). Примечание: Цель – добиться конечной концентрации 0,3% (v/v) ДМСО в пластину клеток после составного приложения; Это самая высокая концентрация ДМСО, которая не влияет на ритмической активности кардиомиоцитов. Складе решения можно также готовить в день до. Для каждого дубликата измерения требуется минимум 5 мкл Стоковый раствор.</li>
	<li>Подготовьте составные пластины.<ol>
<li>Теплый 40 мл обслуживания среды дополняют раствором пенициллина и стрептомицина 1% v/v до комнатной температуры.</li>
		<li>Распределить в две составные 384-ну пластины, добавляя 1.5 мкл Стоковый раствор в хорошо: i тест соединения (по две скважины), ii) позитивные элементы управления (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031, четыре скважины на составные пластину) и iii) отрицательный управления (ДМСО, 20 скважин на составные пластину).</li>
		<li>Центрифуга для соединения плит на 100 x g за 1 мин.</li>
		<li>Мкл 37 обслуживания среды при комнатной температуре для каждой скважины (3,9% ДМСО в 38,5 мкл на данном этапе).</li>
		<li>Центрифуга для соединения плит на 100 x g за 1 мин.</li>
		<li>Загрузите соединения плит плиты читателя. Примечание: Следующие шаги следует быть выполнены как можно скорее к минимуму испарения в составные пластины.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовьте Люминесцентную краску.<ol>
<li>Поверните на водяной бане при 37 ° C и теплых 100 мл среды обслуживания дополняется раствора пенициллина и стрептомицина 1% v/v.</li>
		<li>Воссоздать Ca чувствительных Люминесцентную краску и утоления с 10 мл теплой обслуживания среды с помощью антибиотиков. Примечание: этот запасов флуоресценции носитель содержит Ca чувствительных Люминесцентную краску, обычно Fluo-4 и утоления, и любые остатки могут храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере 5 дней.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. сбор данных
Примечание: выполнить сбор данных в день измерения воздействия наркотиков. Выполните шаги 3.1–.10 полностью для первой ячейки пластины, затем повторять их для второй пластины ячейки.
<ol><li>Запустите программное обеспечение reader пластины (при необходимости) и загрузите накапайте советы.</li>
	<li>Настройка программного обеспечения для записи 2 мин сегмент кальция волны с частотой приобретение по крайней мере 10 Герц для определения базовых избиение ставки для каждой скважины.</li>
	<li>Для одной ячейки пластины разбавьте 3 мл запасов флуоресценции средних 12 мл теплой обслуживания среды с антибиотиками, чтобы сделать средство флуоресценции.</li>
	<li>Замените 20 мкл среды в каждой скважине клетки пластины с 30 мкл флуоресценции среды.</li>
	<li>Пипетка вверх и вниз, 1 x смешивать.</li>
	<li>Место пластину клеток в считывающее устройство пластины как быстро, как можно скорее, чтобы акклиматизироваться к температуре hiPSC см.</li>
	<li>Подождите 60 минут до начала сбора данных.</li>
	<li>Начало сбора данных в программное обеспечение читателя пластины для записи 2 мин сегмент Ca волны с частотой приобретение по крайней мере 10 Гц, чтобы определить базовые, победив ставки для каждой скважины. Примечание: для каждой записи последовательности, убедитесь, что плита ячейки не переносится автоматически из устройства после сбора данных. Это предотвращает пластину клетки от охлаждения при комнатной температуре. С некоторыми версиями программного обеспечения пластины читателя может быть необходимо остановить каждую запись, прежде чем он полностью заканчивается для достижения этой цели.</li>
	<li>Добавьте тест и ссылки соединений с роботом читателя пластины, закупорить скважины 5 мкл от составной плиты в пластину клетки (после того, концентрация ДМСО-0,3% [v/v]).</li>
	<li>Начало сбора данных в пластине читателя программное обеспечение для записи 2 мин сегменты волн Ca, начиная примерно 5, 15, 30, 45 и 60 мин после нанесения смеси (убедитесь, что каждый раз, что клетки пластина остается в устройстве).</li>
</ol>4. анализ данных
Примечание: анализ данных могут выполняться в любое время после измерения.
<ol><li>Экспорт необработанных данных для каждой записи период от программ чтения пластины как ASCII текстовых файлов.</li>
	<li>Импорт необработанных данных в программное обеспечение для анализа данных.</li>
	<li>Для каждой скважины и все моменты времени Извлеките основной избиение частоты. Примечание: С программным обеспечением анализа данных, перечисленные в Таблице материалов, победив частоты могут быть рассчитаны с обычной Пользовательский анализ, используя функцию LombPeriodogram, основанный на методе Lomb – Скарджла спектрального анализа наименьших квадратов7 . Периодограмм должна быть рассчитана на диапазон частот от 0,01 до 5 Гц. Основной частоты могут быть извлечены из периодограмм, с помощью процедуры PeakAutoFind. Этот метод анализа обеспечивает более точные измерения, избиение частотах, чем метод поставляется как опция с программным обеспечением чтения пластины. Однако последний может все еще использоваться если настройки программного обеспечения не является альтернативой.</li>
	<li>Экспорт основной избиение частоты для каждой записи период с программное обеспечение для анализа данных как копии буфера обмена или как текстовые файлы ASCII.</li>
	<li>Импортируйте частоты первичного избиение в программного обеспечения таблицы буфера обмена вставки или импорта текстового файла. Примечание: шаги 4.5–4.9 могут быть выполнены в любой современной электронной таблицы программного обеспечения.</li>
	<li>Для каждой скважины, нормализовать к базовой частоты биений в каждый момент времени после применения препарата (5, 15, 30, 45 и 60 мин) путем деления частоты первичного избиение в то время точки по частоте основного избиение в базовых.</li>
	<li>Рассчитать средний эффект ДМСО в каждый момент времени после применения препарата (5, 15, 30, 45 и 60 мин) путем усреднения нормализованных значений для 20 скважин, где была применена ДМСО.</li>
	<li>Для каждой скважины и каждый раз точки после применения препарата (5, 15, 30, 45 и 60 мин), вычесть среднее ДМСО эффект (время соответствия) для же пластины.</li>
	<li>Средняя повторяющихся измерений. Примечание: Если соединение изменения частоты или программное обеспечение не может найти основной частоты после соединения того, визуальный осмотр избиение шаблон может оценить ли соединение производится аритмий.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+their+derivatives:+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research.">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li><li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+An+In-Vitro+Model+to+Predict+Cardiac+Effects+of+Drugs.">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).</li><li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells.">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li><li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Lomb-Scargle+Periodogram.">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+blockers+and+calcium+channels.">Calcium channel blockers and calcium channels.</a> Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).</li><li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs.">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li><li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels.">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li><li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue.">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Два аспекта являются наиболее важными для успешной записи избиения частоты. Первый — проявлять осторожность с обшивкой клеток и культуры. В частности важно, чтобы попытаться избежать царапин слоя клеток в нижней части скважины при обмене среды. Это приемлемо для сенсорных в нижней части скважины с пипетки, но тот же угол должен использоваться каждый раз, тем самым производить только крошечные нуля в слой клетки и не влияет на производительность assay. Второй критический аспект получения воспроизводимых однородной ритмов является предоставление контроля температуры при 37 ° C на пластину клеток в течение измерения. Мы не могли получить эта однородность, использование устройств за исключением читателя пластины, используемые здесь, но это может быть возможным с специальные модификации для регулирования температуры: было бы сделать протокол, здесь представлены более широко использоваться за пределами единого бренда пластины читатель. Для достижения стабильности температуры в течение всего эксперимента с устройством, используемый здесь, было необходимо остановить каждую запись, прежде чем она закончилась; в противном случае робот будет извлечь измеренной пластину ячейки. Этот технический вопрос может исчезнуть в следующем выпуске программного обеспечения читателя пластины, но сейчас он остается критическим. Если плита клетки ошибочно передается вне читателя плита, он должен быть загружен обратно внутрь как можно быстрее. Тем не менее качество этого эксперимента будут ухудшаться, потому что изменения температуры влияют на скорость избиение чрезвычайно быстро.
Некоторые другие аспекты, которые не были тщательно протестированы, могут быть менее важными. Например hiPSC см производители рекомендуют покрытие культуры клеток пластины перед посевом клетки, но в этой конкретной assay, покрытие не используется, потому что клетки придерживаются довольно легко на различных поверхностях, и это очень трудно правильно пальто 384-Ну плиты. Тем не менее клеток плиты покрытия все еще может быть допустимой, или это может даже улучшить качество анализа. Мы также никогда не испытывал ли растворителей помимо ДМСО будет приемлемым, но из опыта с другими технологиями записи ожидается, что аналогичные концентрации EtOH или метанола также будет терпимой. Мы обычно используем hiPSC-CMs от того же производителя, и были протестированы клетки от только одного дополнительного поставщика, который, как представляется, работают аналогичным образом. Кроме того мы использовали лишь небольшое количество различных серий hiPSC-CMs, которые были выбраны путем prechecking их, чтобы убедиться, что они вели себя подобным образом в первоначальный пакет. Один или два пакетов были сочтены неуместными, потому что их syncytia бедных стабильность и воспроизводимость в условиях культуры используется здесь. В противном случае фармакологии появился очень похож по всей партии, при тестировании ограниченной группы «типичного» соединений (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031, а также эндотелина, isoproterenol, амлодипина и ponesimod). Мы только использовали hiPSC-CM, полученные от здоровых доноров. Это может быть целесообразным оценить ли hiPSC-CM, полученных от пациентов с заболеваниями сердца будет предоставлять различные результаты, хотя никакой разницы между здоровых доноров и пациентов наблюдалось при оценке кардиотоксичности ингибитора киназы тирозина 12. и наконец, мы обычно ждать 22 – 28 дней в культуре до измерения наркотиков эффекты: в нашем опыте с записями сопротивления те же клетки, установившемся для медленно импеданс (показатель стабильности слоя клеток) и быстро импеданса (показатель избиение частоты) достигается после 12–15 дней в культуре. Однако мы решили ждать 22–, 28 дней, потому что это время, когда выражение профиль сердца каналов и маркеры созревания стабилизировалась13. Он не рассматривался ли сопоставимые результаты будут получены, если клетки использовались раньше или позже.
Протокол, в описанный здесь использует очень простой измерения скорости спонтанного избиение hiPSC см для оценки потенциального воздействия препарата на человека сердечной электрофизиологии. Его основные преимущества перед другими методологиями, что i) оно поддается среде высокопроизводительного скрининга, ii) он записывает деятельность кардиомиоцитов и эффекты препаратов при физиологических температурах, и iii) не требует Электрофизиологические опыт для выполнения или для оценки результатов.
В исследовании проверки выполняется с много лекарств, одобренных для использования человеком мы показали, что assay реагирует на лекарства, используемые в человеческой медицине как предсказано существующих клинических данных5. Так как этот метод учитывает все потенциальные последствия для сердечного ритма, он дополняет всеобъемлющий в пробирке Proarrhythmic проба (CiPA) инициативы14 , специально оценивает про аритмических потенциал.
В будущем этот метод может обеспечить дальнейшее понимание режима действия препаратов, показано, что влияет на уровень спонтанной избиение. Вполне вероятно, что дополнительные механистическая информация присутствует в флуоресценции записей Ca транзиентов (например, в их амплитуда или форму). Если флуоресценции записи выполняются на более высокие цены приобретения (например, 30 Гц), эти параметры легко извлекаются помимо избиение скорость, и это может быть интересно соотнести изменения этих параметров с известных последствий клинически употребляли наркотики.

Настоящий Протокол описывает метод для измерения воздействия наркотиков на частоте спонтанных избиение syncytia hiPSC-см на физиологически соответствующих ритмов. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток могут дифференцироваться в функциональных кардиомиоцитов, которые устанавливают спонтанно syncytia избиение в пробирке3,1,2,4. Эти hiPSC см могут быть получены в большом количестве через коммерческих провайдеров или производства в лаборатории, и они являются полезным источником клеток для создания модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. В частности они могут использоваться для прогнозирования или характеризовать сердечных эффектов, которые могут произойти, когда препарат вводят людей5.
Частота биений hiPSC-CM syncytia может быть измерена в физиологических условиях, с использованием микроэлектродные массивы или импеданса зондирования1: эти неинвазивные методы обеспечивают очень подробную информацию о воздействии наркотиков, но они скорее низкая пропускная способность и они не позволяют тестирование большого комплекса библиотек в реалистичные сроки и бюджетные ограничения. Более эффективной системы может быть разработан с использованием 384-ну флуоресценции воображения читателя пластины и Ca чувствительных красителя6, но классическая пластины читателей препятствуют субоптимальные температуры контроля и приобретение частоты. Эти ограничения могут быть проиллюстрированы unphysiological избиение ставки (~ 15 bpm, по сравнению с 35-55 bpm в контролируемых условиях1) и бедных Ca разрешение сигнала (приобретение частота 8 Гц — нижний предел для записи ставки, которые могут достигать 120 bpm стимулируется условиях, и не может извлекать информацию, такую как склон или длительность). Метод, описанный здесь сочетает в себе запись избиения узоры на физиологические ритмы и достаточным разрешением для предотвращения этих проблем.
На положительной стороне этот метод является простым, надежным и высокой пропускной способности, которая позволяет быстрое тестирование большого числа соединений по разумной цене. На отрицательной стороне этот метод требует Быстрый плита читателя с эффективной температуры, который является дорогим инвестиций, и он содержит мало механистический информацию о наблюдаемых наркотиков эффекты, которые могут потребовать дальнейших испытаний с более подробными методы.
Для одного измерения в одном плита клетки 384-ну необходимо приблизительно 6 x6 hiPSC 10СМ. hiPSC см обычно поставляются коммерчески замороженных аликвоты ~ 4 x 106 клеток в 1 мл. Таким образом это удобно подготовить две ячейки пластины с тремя замороженными аликвоты. В большинстве случаев, вследствие низкой изменчивости этот assay, это достаточно для выполнения повторяющихся измерений испытаний соединений и в каждой ячейке пластина, quadruplicate измерения положительных элементов управления (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031), и 20-складчатых измерения отрицательного контроля (ДМСО только). Таким образом максимум 352 соединения/концентрации пар может оцениваться с двумя пластинами 384-ну клеток. Следующий протокол считает такой эксперимент с 352 тест соединения, две клетки пластины и 12 миллионов клеток, поставляется как три аликвоты замороженные; Это может быть легко увеличен, если нужны дополнительные данные точек.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

Спонтанно Договаривающихся syncytia кардиомиоцитов, производный от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC см) являются полезной модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. Были предложены различные методы для записи этой спонтанной активности и оценить эффекты наркотиков, но многие из этих методов страдают от ограниченной пропускной способности и/или физиологической значимости. Мы разработали систему высокопроизводительного скрининга для количественного определения воздействия внешних соединений на hiPSC-CM частоты биений, используя Ca чувствительных Люминесцентную краску и контролем температуры изображений несколькими хорошо пластины читателя. Мы опишем, как подготовить сотовый плит и составные пластин и как запускать автоматизированные assay для достижения высокой чувствительностью и воспроизводимость. Мы также описывают, как для преобразования и анализа данных флуоресценции для предоставления надежных мер воздействия препарата на спонтанный ритм. Этот assay может использоваться в программах обнаружения наркотиков для руководства химических оптимизация, или выгнутых, соединений, влияющих на функции человеческого сердца.

На рисунке 1 показана запись представителя Ca волн на базовом через одну плиту 384-хорошо. В большинстве случаев, все скважины показывают курс регулярных биений с маленькой изменчивости через пластину (означает ± SD = 40.1 ± 3.5 bpm; диапазон = 34-54 bpm). Очень редко (менее чем 1 из 10 экспериментов), несколько скважин (менее 5) имеют аритмии или отсутствие ритма. В трех 384-ну пластины, мы пробовали кардиомиоцитов от другого поставщика (см. Таблицу материалы) и получил очень похожи исходных значений для спонтанного избиение.
Блокаторы сердечной ионных каналов влияют на ритм кардиомиоцитов в воспроизводимый способом5. Амлодипин, блокатор медленных Ca каналы9, ускоряет ритм, более чем на 100% в зависимости от концентрации до 1 мкм (рисунок 2A). Эффект хорошо развита в течение первых 5 минут, но он по-прежнему увеличивается приблизительно 50% в течение следующих 30 минут прежде, чем она стабилизируется. Выше 1 мкм, Амлодипин аресты биений (пунктирные линии), как можно ожидать от факта что Ca Велоспорт имеет решающее значение для спонтанного схватки. Другие блокаторы кальциевых каналов Ca селективного dihydropyridine производят очень похожие эффекты.
E-4031, блокатор каналы быстрой задержки выпрямителя K10, замедляет ритм около 65–70% в зависимости от концентрации до 10 мкм (рис. 2B). Эффект развивается в течение первых 5 минут, и она не меняется в течение следующих 60 мин. Другие селективного блокаторы IKr производят аналогичные последствия, хотя максимальное снижение ставки может меняться (например, 35–40% для цизаприда, 70% для E-4031 и 90% - 95% для dofetilide). Основой для этого неравенства не известна.
Тетродотоксин, блокатор быстро Na каналы11, замедляет ритм около 15% в зависимости от концентрации, до 1–30 мкм (рис. 2 c). Эффект хорошо развита в течение первых 5 минут, и она не меняется многое в течение следующих 60 мин. Однако выше 30 мкм, Тетродотоксин аресты избиение в течение первых 5 мин, тогда как после 30 мин, она арестовывает его выше 1 мкм. Другие блокаторы кальциевых каналов Na, например лидокаина или мексилетин, аналогичный эффект все или ничего.
Бепридил, блокатор смешанного сердечной Na, Ca и K каналы9, также производит эффект все или ничего (Рисунок 2D). Это свидетельствует о том, что в этом препарате, блок Na каналов является основным действием бепридил. Ускорение, вызванное Ca канал блок не видели, и более прогрессивный, замедляется вследствие IKr блока появляется масках Na канал эффекта.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> Рисунок 1: представитель базовых Ca волн через 384-ну плита. (A) все скважины через пластину демонстрируют курс регулярных биений с маленькой изменчивости. Этот образ записывается непосредственно из программ чтения пластины. Каждый след-10 s в продолжительности. Интенсивность флуоресценции является произвольным (относительная свет единиц производные от серого видео камеры). (B) этой раздутии одной 10 s трассировки показывает низкий шум сигнала. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> Рисунок 2: представитель эффекты сердечных иона канал блокаторы. Эти панели показывают концентрация реакция кривых с (A) селективного Ca канала блокатор Амлодипин, (B) IKr Селективный блокатор E-4031, (C), Селективный блокатор канала Na TTX и (D) неселективной канал блокатор бепридил. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Спонтанно Договаривающихся syncytia кардиомиоцитов, производный от человека индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются полезной модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. Здесь мы представляем систему высокопроизводительного скрининга для количественного определения эффектов экзогенных соединений на избиение частоты, используя Ca чувствительных Люминесцентную краску и контролем температуры изображений несколькими хорошо пластины читателя.

Схватки Syncytia человека iPSC производные Cardiomyocyte измеряется с Ca чувствительных Люминесцентную краску в контролируемой температурой 384-ну пластины

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фармакологии сердечной безопасности. Например, несет ли новая человеческая медицина риск изменения нормального сердечного ритма? Основным преимуществом этого метода является то, что он может оценить большое количество соединений быстро и при умеренных затратах.Демонстрацией процедуры будет Камилла Forny, научный сотрудник в моей лаборатории. Чтобы подготовиться к измерению сокращений синцитии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов, или HIPSCCMs, начните с размещения CryoTubes содержащие замороженные клетки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение двух минут. Перенесите всю талую сотовую суспензию с каждой трубки на одну, свежую 50 миллилитровую коническую трубку.Чтобы получить оставшиеся клетки, мыть каждую трубку с одним миллилитр 37 градусов по Цельсию довоенной среды покрытия и добавить эту среду в 50 миллилитров конической трубки, содержащей талые клетки. Добавьте восемь миллилитров теплой пластины среды в трубку и тщательно перемешайте подвеску. Используйте метод trypan голубого исключения и гемоцитометр для подсчета живых клеток.Добавляя теплую среду покрытия, отрегулируйте концентрацию до 50 000 клеток на миллилитр. Чтобы распределить клетки на две новые пластины культуры клеток на 384 колодец, добавьте по 25 микролитров к каждой колодец, что даст около 12 500 клеток на колодец. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 384-хорошо пластин во влажной атмосфере с 5%углекислого газа в общей сложности от трех до четырех недель.На следующий день замените покрытие среды на 50 микролитров теплой среды обслуживания. После этого заменяем половину среды обслуживания каждые два-три дня. В дни семь, 14 и 21, заменить средний полностью.После того, как клетки были сохранены в культуре в течение трех-четырех недель, они сформировались спонтанно контракт синцитии, и влияние соединений на эти сокращения могут быть измерены. В день анализа, по крайней мере за два часа до того, как первая пластина ячейки должна быть помещена внутри считывателя пластины для измерения, включите считыватель и установите систему отопления на 37 градусов по Цельсию. Для приготовления составных пластин, теплой до комнатной температуры 40 миллилитров среднего обслуживания дополняется 1%объем за объем пенициллина стрептомицин.В то время как среда разогревается, распределить тестовые соединения и элементы управления на две 384-хорошо соединения пластин, добавив 1,5 микролитров запасного раствора на колодец. Центрифуга соединения пластин при 100 G в течение одной минуты. Добавьте 37 микролитров среднего обслуживания к каждой хорошо и центрифуга пластин снова на 100 G в течение одной минуты.Для приготовления флуоресцентного красителя, теплые 100 миллилитров среднего обслуживания дополняется 1% объема за объемом пенициллина стрептомицин в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем добавьте 10 миллилитров разогретой среды в смесь чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя и утолите их в качестве среды флуоресценции запасов. Запустите программное обеспечение для чтения пластин.Подготовь программное обеспечение для записи двухминутного сегмента кальциевых волн с частотой приобретения не менее 10 герц. Чтобы сделать флуоресценцию средней для каждой клеточной пластины, разбавить три миллилитров стока флуоресценции среды с 12 миллилитров теплой среды обслуживания с антибиотиками. Замените 20 микролитров среднего в каждом колодеце клеточной пластины 30 микролитров флуоресцентной среды и смешайте с помощью трубок вверх и вниз один раз.Сразу после этого поместите пластину в считыватель пластин, чтобы HIPSCCMs приспособиться к температуре читателя в течение 60 минут. Затем запустите программное обеспечение для чтения пластин. Запись двухминутный сегмент кальциевых волн с частотой приобретения не менее 10 герц, чтобы определить базовую скорость избиения для каждой хорошо.Важно убедиться, что пластина ячейки не передается из устройства после получения данных. С некоторыми версиями программного обеспечения, вы должны остановить запись, прежде чем она заканчивается полностью. Используйте робота-считыватель пластин для пипетки пять микролитров теста и ссылки соединений хорошо от соединения пластины в клеточной пластине.После этого начните сбор данных в программном обеспечении для считыватель пластин для записи двухминутных сегментов волны кальция, начиная с 5, 15, 30, 45 и 60 минут после добавления соединения. Для начала анализа данных экспорт необработанных данных за каждый период записи из программного обеспечения для чтения пластин в текстовых файлах ASCII. А затем импортировать их в программное обеспечение для анализа данных.Из программного обеспечения для анализа данных экспорт основных частот избиения для каждого периода записи в качестве копий буфера обмена. Извлекайте первичную частоту избиения для каждого хорошо и каждый раз точки. Наконец, импортируют частоты избиения в программное обеспечение электронной таблицы путем буфера обмена и продолжают анализ данных, описанный в текстовом протоколе.Запись волны кальция на базовом уровне через один 384-хорошо пластины показывает, что в большинстве случаев все скважины показывают регулярную скорость избиения с небольшой изменчивостью по всей пластине. При добавлении блокаторов сердечных ионных каналов они влияют на ритм кардиомиоцитов. Амлодипин, блокатор медленных кальциевых каналов, ускоряет ритм более чем на 100% в зависимости от концентрации до одного микромолара.И выше этого, амлодипин арестовывает избиение. E-4031, блокатор быстрого задержки выпрямителя калийных каналов замедляет ритм около 65 до 70% в зависимости от концентрации образом до 10 микромолей. Тетродотоксин, блокатор быстрых каналов натрия замедляет ритм около 15% в концентрации зависимой образом до одного до 30 микромолей, в то время как выше 30 микромолейных, тетродотоксин арестовывает избиение в течение первых пяти минут.Bepridil, смешанный блокатор сердечного натрия, кальция и калия каналов также производит все или ничего эффект, предполагая, что блок канала натрия является основным действием bepridil. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы быть чрезвычайно мягким, когда трубопроводов в пластине культуры клеток. Эти ткани очень хрупкие и легко повреждаются при прикосновении пипеток.Не забывайте, что работа с клетками человека и активными препаратами может быть опасной, и такие меры предосторожности, как ношение защитных перчаток и очков, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Medicine

Unit 1

Cardiovascular Drugs: Antihypertensive Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Руководство Wire Assisted катетеризации и цветные краски для закачки сосудистой Картирование монохориальной Твин плаценты

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Развитие Audio на основе виртуальной игровой среды для оказания помощи навыки навигации в слепых

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Shrinkage of Dental Composite in Simulated Cavity Measured with Digital Image Correlation

Усадка Стоматологическое Composite в имитации полости Измеряется с цифровой корреляции изображения

Polymerization shrinkage of dental resin composites can lead to restoration debonding or cracked tooth tissues in composite-restored teeth. In order to ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Неинвазивный определение Vortex время формирования с помощью Чреспищеводная эхокардиография при сердечной хирургии

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Крыса сонной артерии Давление контролируемых сегментальных воздушный шар травмы с Периавентициального терапевтического применения

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Электромеханическая оценка оптогенетически модулированной кардиомиоцитной активности

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Intrathecal Application of a Fluorescent Dye for the Identification of Cerebrospinal Fluid Leaks in Cochlear Malformation

Внутритекальное применение флуоресцентного красителя для идентификации черневого жидкости в кохлеарных пороках

In cases of cerebrospinal fluid (CSF) leaks, reliable detection of their origins is needed to seal the leak sufficiently and prevent complications, such ...