Name: contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Författarna har inga bekräftelser.

1. beredning av Cell plattor
Obs: Förbereda cell plattorna 3–4 veckor före mätning av läkemedelseffekter.
<ol><li>Dag 0 av experimentet Obs: för planering, sammansatta testprogrammet kan utföras på någon dag mellan dagar 22–28 i experimentet.<ol>
<li>Slå på vattenbad vid 37 ° C och värma 40 mL plätering medium (som tillhandahålls av tillverkaren). Obs: Använd cellerna med deras leverantör-förutsatt matchande kultur och underhåll media.</li>
		<li>Tina den hiPSC-CM genom att placera den frysrör som innehåller frusna celler i vattenbadet i 2 min.</li>
		<li>Överför 1 mL cellsuspensioner försiktigt till en 50 mL konisk tub.</li>
		<li>Tvätta varje cryotube med 1 mL varm plätering medium att hämta överblivna cellerna och lägga till wash media i samma koniska rör från steg 1.1.3 innehållande celler.</li>
		<li>Blanda noggrant ytterligare 8 mL varm plätering medium i cellsuspension.</li>
		<li>Räkna levande celler med hjälp av metoden trypan blå utslagning och en hematocytometer8. Obs: kravet på 6 x 106 celler för en plattan med 384 brunnar cell anser möjligheten att upp till 20% döda celler bland de frusna cellerna, vilket är högst i vår erfarenhet.</li>
		<li>Justera cellsuspensionen till 5 x 105 levande celler/mL med varma plätering medium.</li>
		<li>Fördela cellsuspensionen i två 384-väl cell plattor genom att lägga till 25 µL till varje brunn (ca 12 500 celler per brunn). Obs: Cell plattorna behöver inte vara förbelagts med någon matris (se diskussion).</li>
		<li>Upprätthålla cell plattorna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dag 1 av experimentet<ol>
<li>Slå på vattenbad vid 37 ° C och varm 50 mL underhåll medium kompletteras med 1% v/v penicillin-streptomycin lösning.</li>
		<li>Ersätta plätering medium med 50 µL av varma underhåll medium i varje brunn av cell pläterar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dagar 2–21 (upp till dag 27) av experimentet Obs: hiPSC-CMs behöver inte någon passaging under denna period, eftersom de är icke-dela celler.<ol>
<li>Förnya hälften av underhåll medium varje 2–3 dagar och förnya det helt på dagar 7, 14 och 21. Obs: Fluorescens mätningen kan utföras mellan dagar 22 och 28 i experimentet. Längre löptider har inte prövats men kan fortfarande vara bra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beredning av Instrument, sammansatta tallrikar och Assay plattor
Obs: förbereda de instrument, sammansatta plåtar och assay plattor på dagen för mätning av läkemedelseffekter, mellan dagar 22 och 28 i experimentet. Använda en fluorescerande Plattläsare utrustad med temperaturkontroll och en lämplig fluorescens filter kit och excitation ljus källa. Till exempel använda ett Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescens filter kit (excitation: 472 nm, emission: 520–560 nm) och en 150 W excitation ljuskälla.
<ol><li>Minst 2 h innan den första cell-plattan är att placeras inuti plattan läsaren för mätning, slå på läsaren och Ställ värmesystemet vid 37 ° C. Obs: Detta kan också göras kvällen före.</li>
	<li>Förbereda den positiva kontroller, forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin och E-4031 som stamlösningar av 0.33 mM DMSO, 10 mM i DMSO och 3.33 mM i H2O, respektive. Obs: lager lösningar kommer att spädas 333-fold när de läggs till cellerna, och syftet är att uppnå slutliga testkoncentrationer 1 µM Forskolin, 30 µM N6-cyclopentyl-adenosin och 10 µM E-4031, som producerar tillförlitliga och reproducerbara effekter.</li>
	<li>Förbereda de 352 test föreningarna som DMSO stamlösningar på 333-fold de planera testkoncentrationerna (t.ex., 10 mM för ett test på 30 µM). Obs: Syftet är att uppnå en slutlig koncentration på 0,3% (v/v) DMSO i cell plattan efter sammansatta ansökan. Detta är den högsta koncentrationen av DMSO som inte påverkar hjärtmuskelcellerna rytmisk aktivitet. De Lagerföra lösningarna kan också förberedas dagen innan. Minst 5 µL av stamlösning krävs för varje dubblerade mätning.</li>
	<li>Laga sammansatta plattorna.<ol>
<li>Varma 40 mL underhåll medium kompletteras med 1% v/v penicillin-streptomycin lösning till rumstemperatur.</li>
		<li>Fördela i två 384-väl sammansatta plåtar genom att lägga till 1,5 µL av stamlösning per brunn: i) de test föreningarna (två brunnar varje), ii) de positiva kontrollerna (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin och E-4031, fyra brunnar varje per förening platta) och iii) negativa kontroll (DMSO, 20 brunnar per förening platta).</li>
		<li>Centrifugera sammansatta plattorna vid 100 x g för 1 min.</li>
		<li>Tillsätt 37 µL av underhåll medium vid rumstemperatur till varje brunn (3,9% DMSO i 38,5 µL i detta skede).</li>
		<li>Centrifugera sammansatta plattorna vid 100 x g för 1 min.</li>
		<li>Läsa in sammansatta plattorna i plattan läsaren. Obs: Nästa steg bör utföras så snart som möjligt för att minimera avdunstning i sammansatta tallrikar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbereda den fluorescerande färgen.<ol>
<li>Slå på vattenbad vid 37 ° C och varma 100 mL underhåll medium kompletteras med 1% v/v penicillin-streptomycin lösning.</li>
		<li>Rekonstruera den Ca-känsliga fluorescerande färgämne och törstsläckare med 10 mL varm underhåll medium med antibiotika. Obs: detta lager fluorescens medium innehåller den Ca-känsliga fluorescerande färgen, vanligtvis Fluo-4 och en törstsläckare och eventuella överblivna kan lagras vid 4 ° C i minst 5 dagar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. data Acquisition
Obs: utföra dataförvärvet på dagen för mätning av läkemedelseffekter. Utför steg 3.1–.10 helt för den första cell plattan, sedan upprepa dem för andra cell plattan.
<ol><li>Starta programvaran plate reader (vid behov) och hämta Pipettera tips.</li>
	<li>Justera Programvaruinställningar för för att spela in en 2 minuters segment av kalcium vågor med förvärvet frekvens på minst 10 Hertz att definiera baslinjen slå priset för varje brunn.</li>
	<li>För en cell plåt, späd 3 mL lager fluorescens medium till 12 mL varm underhåll medium med antibiotika att göra fluorescens medium.</li>
	<li>Ersätta 20 µL av medium i varje brunn av cell plattan med 30 µL av fluorescens medium.</li>
	<li>Pipettera upp och ner 1 x att blanda.</li>
	<li>Placera cell plattan i plattan läsaren så snabbt som möjligt att låta den hiPSC-CM acklimatisera sig till temperaturen.</li>
	<li>Vänta 60 min innan du börjar dataförvärvet.</li>
	<li>Starta dataförvärvet i programvaran plate reader att spela in en 2 minuters segment av Ca vågor med förvärvet frekvens på minst 10 Hz, att definiera baslinjen slog för varje brunn. Obs: Kontrollera cellen plattan inte överförs automatiskt av enheten efter dataförvärvet för varje inspelning sekvens,. Detta förhindrar att cellen plattan kylning vid rumstemperatur. Med vissa versioner av plattan läsare programvara, kan det vara nödvändigt att stoppa varje inspelning innan det slutar helt för att uppnå detta.</li>
	<li>Lägg till de test- och referensartiklar föreningarna med plattan läsaren roboten genom pipettering väl-att-väl 5 µL från sammansatta plattan i cell plattan (efter tillökning DMSO är 0,3% [v/v]).</li>
	<li>Starta dataförvärvet i programvaran plate reader till rekord 2 minuters segment av Ca vågor börjar om 5, 15, 30, 45 och 60 min efter sammansatta tillägg (se till att varje gång som cell plattan sitter i enheten).</li>
</ol>4. dataanalys
Obs: dataanalys kan utföras när som helst efter mätningen.
<ol><li>Exportera rådata för varje inspelningsperiod från programvaran plate reader som ASCII-textfiler.</li>
	<li>Importera raw-data i data analys programvara.</li>
	<li>För varje brunn och alla tidpunkter, extrahera den primära stryk frekvensen. Obs: Med data analys programvara som anges i Tabellen för material, slog frekvenser kan beräknas med en anpassad analys rutin använda funktionen LombPeriodogram, utifrån metoden Lomb – Scargle av minstakvadratmetoden spektralanalys7 . Periodogrammet ska beräknas för en rad frekvenser mellan 0,01 och 5 Hz. Primära frekvensen kan extraheras från den periodogrammet använder PeakAutoFind rutiner. Denna analysmetod ger mer exakta mätningar av slog frekvenser än metoden levereras som tillval med programvaran plate reader. Men kan den senare fortfarande användas om programvaran anpassning inte är ett alternativ.</li>
	<li>Exportera de primära stryk frekvenserna för varje inspelningsperiod från data analys programvara som Urklipp exemplar eller som ASCII-textfiler.</li>
	<li>Importera de primära stryk frekvenserna till ett kalkylprogram av Urklipp klistra eller text-filimport. Obs: steg 4,5–4,9 kan utföras i alla moderna kalkylprogram.</li>
	<li>För varje brunn, normalisera till baslinjen stryk frekvensen vid varje tidpunkt efter programmet drog (5, 15, 30, 45 och 60 min) genom att dividera den primära stryk frekvensen då peka av primära stryk frekvensen vid baslinjen.</li>
	<li>Beräkna den genomsnittliga DMSO effekten vid varje tidpunkt efter programmet drog (5, 15, 30, 45 och 60 min) av de normaliserade värdena för de 20 brunnar där DMSO applicerades i genomsnitt.</li>
	<li>För varje brunn och varje gång pekar efter programmet drog (5, 15, 30, 45 och 60 min), subtrahera den genomsnittliga DMSO effekten (tidsmatchade) för samma platta.</li>
	<li>Genomsnittliga dubblerade mätningarna. Obs: om en förening ändrar frekvens eller programvaran inte kan hitta en primär frekvens efter sammansatta tillägg, en visuell undersökning av misshandeln mönstret kan utvärdera om föreningen producerade arytmier.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+their+derivatives:+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research.">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li><li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+An+In-Vitro+Model+to+Predict+Cardiac+Effects+of+Drugs.">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).</li><li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells.">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li><li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Lomb-Scargle+Periodogram.">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+blockers+and+calcium+channels.">Calcium channel blockers and calcium channels.</a> Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).</li><li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs.">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li><li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels.">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li><li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue.">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Två aspekter är mest kritiska för framgångsrik registrering av slog frekvenser. Först är att iaktta försiktighet med cell plätering och kultur. Det är särskilt viktigt att försöka undvika repor celllagrar på botten av brunnarna vid utbyte av mediet. Det är acceptabelt att röra botten av brunnarna med pipetterna, men samma vinkel bör användas varje gång, vilket framkallar endast en liten repa i det cell-lagret och inte påverkar analysens prestanda. Den andra viktiga aspekten av att erhålla reproducerbara homogen rytmer är att tillhandahålla bra temperaturkontroll vid 37 ° C över cell plattan under hela mätningen. Vi kunde inte erhålla denna homogenitet med andra enheter än den spektrofotometer som används här, men det kan vara praktiskt med särskilda ändringar i temperaturreglering: det skulle göra det protokoll som presenteras här i huvudsak användbara utöver ett enda märke av plattan läsare. För att uppnå temperaturstabilitet för varaktigheten av experimentet med den enhet som används här, var det nödvändigt att stoppa varje inspelning innan det slutade; annars skulle roboten matar den uppmätta cell-plattan. Denna tekniska fråga kan försvinna med nästa utgåva av programvaran plate reader, men det är fortfarande kritisk för nu. Om en cell platta överförs av misstag utanför plattan läsaren, måste det läsas tillbaka släpper så fort som möjligt. Dock försämras kvaliteten på experimentet, eftersom temperaturförändringar påverkar andelen slog extremt snabbt.
Några andra aspekter, som inte har testats ordentligt, kanske mindre viktigt. Till exempel hiPSC-CM tillverkare rekommenderar beläggning cellkultur plattor innan sådd cellerna, men i denna särskilda analys, beläggning användes inte, eftersom cellerna följer helt enkelt på olika ytor, och det är mycket svårt att korrekt päls 384-väl plattorna. Men cell platta beläggning kan fortfarande vara tillåtna, eller det kan även förbättra analysen. Vi testade också aldrig om lösningsmedel än DMSO skulle vara godtagbar, men det förväntas från erfarenhet med andra inspelning teknik att liknande koncentrationer av EtOH eller MeOH också skulle vara acceptabel. Använder vi i allmänhet hiPSC-CMs från samma tillverkare och celler från endast en ytterligare leverantör testades, som verkade fungera på liknande sätt. Likaså har vi använt endast ett litet antal olika partier av hiPSC-CMs som valdes genom prechecking dem att verifiera att de betett sig på samma sätt i första batchen. Ett eller två partier ansågs olämpligt eftersom deras syncytia hade dålig stabilitet eller reproducerbarhet enligt villkor som kultur används här. Annars, farmakologi verkade mycket liknande över partier när du testar en begränsad panel av ”typiska” föreningar (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin, och E-4031, samt endotelin, isoproterenol, amlodipin och ponesimod). Vi använde endast hiPSC-CM härrör från friska donatorer. Det kan vara värt att bedöma om hiPSC-CM härrör från patienter med hjärtsjukdom skulle ge olika resultat, även om ingen skillnad mellan friska donatorer och patienter observerades vid utvärdering av kardiotoxicitet av tyrosinkinashämmare 12. Slutligen vi normalt vänta på kultur 22 – 28 dagar innan du mäter läkemedelseffekter: vår erfarenhet med impedans inspelningar av samma celler, en steady-state för långsam impedans (en indikator på cell lager stabilitet) och snabb impedans (en indikator på slå frekvens) uppnås efter 12–15 dagar i kultur. Men beslöt vi att vänta 22–28 dagar, eftersom detta är den tid när uttrycket profilen hjärt kanaler och mognad markörer har stabiliserats13. Det var inte undersökt huruvida jämförbara resultat skulle uppnås om cellerna användes tidigare eller senare.
Protokollet beskrivs använder här en mycket enkel mätning av den spontana slog hiPSC-CM för att utvärdera potentiella läkemedelseffekter på mänskliga hjärtats elektrofysiologi. Dess främsta fördelar över andra metoder är att i) det är mottagliga för en high-throughput screening miljö, ii) Det registrerar verksamhet i hjärtmuskelcellerna och effekterna av droger vid fysiologiska temperaturer och iii) kräver inte elektrofysiologiska expertis för utförandet eller för en utvärdering av resultaten.
I en valideringsstudie utförd med många läkemedel godkänd för humant bruk, visade vi att analysens reagerar på läkemedel som används inom humanmedicinen som förutspådde av befintliga kliniska data5. Eftersom denna metod anser alla potentiella effekter på hjärtrytmen, kompletterar det det omfattande i vitro proarytmiska assay (CiPA) initiativ14 som specifikt bedömer proarytmisk potential.
Denna metod kan i framtiden, ge en ytterligare förståelse för den mode-för-action av läkemedel visat sig påverka spontana misshandeln som. Det är troligt att ytterligare mekanistiska information är närvarande i fluorescens inspelningarna av Ca transienter (t.ex., i deras amplitud eller form). Om fluorescens inspelningarna utförs på förvärvet högre (t.ex., 30 Hz), dessa parametrar utvinns enkelt förutom slog takt, och det kan vara intressant att korrelera förändringar i dessa parametrar med de kända effekterna av kliniskt används droger.

Protokolls skildrar en metod att mäta läkemedelseffekter på spontana stryk frekvensen av syncytia av hiPSC-CM vid fysiologiskt relevanta rytmer. Människans pluripotenta stamceller kan differentieras till funktionella hjärtmuskelceller som upprättar spontant slår syncytia in vitro-1,2,3,4. Dessa hiPSC-CM kan erhållas i stora skaror genom kommersiella leverantörer eller produktion i laboratorium, och de är en värdefull källa av celler för att skapa modeller av mänskliga hjärtats fysiologi och farmakologi. De kan i synnerhet användas att förutsäga eller att karakterisera kardiella effekter som kan uppstå när ett läkemedel administreras till människor5.
Misshandeln frekvensen av hiPSC-CM syncytia kan mätas under fysiologiska betingelser med mikroelektrod matriser eller impedans avkänning1: dessa noninvasiv teknik ger mycket detaljerad information om läkemedelseffekter, men de är snarare Aktivera inte testa stora sammansatta bibliotek inom realistiska tid och budget tvången låg genomströmning och de. Ett effektivare system kan utarbetas med hjälp av en 384-väl fluorescens imaging plate reader och en Ca-känslig färga6, men klassiskt plattan läsare hindras av suboptimal temperatur kontroll och förvärv frekvens. Dessa begränsningar är illustrerad av unphysiological slå priser (~ 15 bpm, jämfört med 35 – 55 bpm i kontrollerade miljöer1) och dålig Ca signal upplösning (ett förvärv frekvensen 8 Hz är i den lägre limiten till postens priser som kan nå 120 bpm stimulerad villkor, och det kan inte extrahera information såsom lutning eller varaktighet). Den metod som beskrivs här kombinerar inspelningen av slå mönster vid fysiologiska rytmer och tillräcklig upplösning för att hindra dessa farhågor.
På den positiva sidan är denna metod enkel, tillförlitlig och hög genomströmning, som tillåter snabb testning av ett stort antal föreningar till rimliga kostnader. På den negativa sidan, den här metoden kräver en snabb Plattläsare med effektiv temperaturkontroll, som är en dyr investering, och det ger lite mekanistiska information om observerade läkemedelseffekter, vilket kan nödvändiggöra ytterligare tester med mer detaljerade metoder.
Approximativt 6 x 106 hiPSC-CM behövs för en mätning i en plattan med 384 brunnar cell. hiPSC-CM levereras vanligtvis kommersiellt som frysta alikvoter av ~ 4 x 106 celler i 1 mL. Därför är det bekvämt att förbereda två cell plattor med tre frysta portioner. I de flesta fall på grund av den låga variationen av denna analys, är det tillräckligt att utföra dubbla mätningar av de test-föreningarna och, i varje cell platta, quadruplicate mätningar av de positiva kontrollerna (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin och E-4031), och 20-plicate mätningar av den negativa kontrollen (DMSO ensam). Därför kan högst 352 förening eller koncentration par utvärderas med två 384-väl cell plattor. Följande protokoll anser sådant experiment utförs med 352 test föreningar, två cell plattor och 12 miljoner celler levereras som tre frysta portioner; Det kan vara skalas upp lätt om ytterligare datapunkter behövs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

Spontant avtalsslutande syncytia av hjärtmuskelceller som härrör från mänskliga-inducerade pluripotenta är stamceller (hiPSC-CM) en användbar modell för mänskliga hjärtats fysiologi och farmakologi. Olika metoder har föreslagits att registrera detta spontan aktivitet och för att utvärdera läkemedelseffekter, men många av dessa metoder lider begränsade genomströmning och/eller fysiologiska betydelse. Vi utvecklade ett high-throughput screening system för att kvantifiera effekterna av exogena föreningar på hiPSC-CM: s stryk frekvens, med ett Ca-känsliga fluorescerande färgämne och en temperatur-kontrollerad imaging flera Plattläsare. Vi beskriver hur du förbereder cell plattorna och sammansatta plattorna och hur du kör den automatiska analysen för att uppnå hög känslighet och reproducerbarhet. Vi beskriver även hur att omvandla och analysera fluorescens data för att ge tillförlitliga åtgärder av läkemedelseffekter på spontan rytm. Denna analys kan användas i drug discovery program för att vägleda kemisk optimering från, eller mot, föreningar som påverkar människors hjärtfunktion.

Figur 1 visar en representativ inspelning av Ca vågor vid baseline över ena plattan med 384 brunnar. I de flesta fall avslöja alla brunnar en regelbunden slog takt med liten variabilitet över plattan (genomsnitt ± SD = 40,1 ± 3,5 bpm; intervall = 34 – 54 bpm). Mycket sällsynt (mindre än 1 av 10 experiment), några brunnar (mindre än 5) har arytmi eller avsaknad av rytm. I tre 384 brunnar, vi har också försökt hjärtmuskelcellerna från annan leverantör (se Tabell av material) och fått mycket liknande utgångsvärden för spontana misshandeln.
Blockerare av hjärtats jonkanaler påverka rytmen i hjärtmuskelcellerna i ett reproducerbart sätt5. Amlodipin, en blockerare långsam Ca kanaler9, accelererar den rytm som är mer än 100% i en koncentrationsberoende sätt upp till 1 µM (figur 2A). Effekten är väl utvecklad inom de första 5 min, men fortfarande ökar approximativt 50% inom de nästa 30 min innan det stabiliserar. Ovan 1 µM, amlodipin gripanden misshandeln (streckade linjer), som kan förväntas från faktumen att Ca cykling är kritiska till de spontana sammandragningarna. Andra selektiva dihydropyridin Ca kalciumantagonister producera mycket liknande effekter.
E-4031, en blockerare av snabba fördröjd likriktare K kanaler10, decelererar rytmen ungefär 65–70% i ett koncentrationsberoende sätt upp till 10 µM (figur 2B). Effekten utvecklar inom de första 5 min och det varierar inte inom de nästa 60 min. Andra selektiva IKr-blockerare producera liknande effekter, även om den maximal minskningen av frekvensen kan variera (t.ex., 35–40% för cisaprid, 70% för E-4031 och 90-95% för dofetilid). Grunden för denna skillnad är inte känt.
Tetrodotoxin, en blockerare snabb Na kanaler11decelererar rytmen ca 15% i en koncentrationsberoende sätt, upp till 1–30 µM (figur 2 c). Effekten är väl utvecklad inom de första 5 min och det varierar inte mycket inom de nästa 60 min. Dock över 30 µM gripanden tetrodotoxin misshandeln inom de första 5 min, medan efter 30 min, det gripanden det ovan 1 µM. Andra Na-kanal blockerare, såsom lidokain eller mexiletin, producera liknande alternativ effekter.
Bepridil, en blandad blockerare av hjärt Na, Ca och K kanaler9, producerar också en alternativ effekt (figur 2D). Detta tyder på att denna förberedelse, ett block av Na-kanaler är en primär åtgärd av bepridil. En acceleration på grund av Ca Kanalblockering syns inte, och den mer progressiva sakta på grund av IKr block visas maskerade av Na kanal effekten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> Figur 1: representativa baslinjen Ca vågor över en plattan med 384 brunnar. (A) alla brunnar i plattan visar en vanlig slog takt med liten variabilitet. Denna bilden är tagna direkt från plattan läsarprogrammet. Varje spår är 10 s varaktighet. Fluorescensintensiteten är godtycklig (relativa ljus enheter härrör från den videokamera gråskalan). (B) denna blow-up av en 10 s spår visar att lågt brus på signalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> Figur 2: representativa effekterna av hjärt ion kanal blockerare. Dessa paneler visar koncentration-respons kurvor med (A), selektiva Ca kanal blockerare amlodipin, (B), den selektiva IKr blockerare E-4031, (C) selektiv Na kanal blockerare TTX och (D), icke-selektiv kanal blockerare bepridil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Spontant avtalsslutande syncytia av hjärtmuskelceller härrör från människans pluripotenta är stamceller användbara modeller för mänskliga hjärtats fysiologi och farmakologi. Här presenterar vi ett high-throughput screening system för att kvantifiera effekterna av exogena föreningar på slog frekvens, använder en Ca-känsliga fluorescerande färgämne och en temperatur-kontrollerad imaging flera Plattläsare.

Sammandragningar av mänskliga-iPSC-härledda hjärtmuskelcellen Syncytia mätt med ett Ca-känsliga fluorescerande färgämne i temperaturreglerade 384 brunnar

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området hjärtsäkerhetsfarmakologi. Medför till exempel en ny humanmedicin en risk att modifiera den normala hjärtrytmen? Den största fördelen med denna teknik är att den kan utvärdera stora mängder föreningar snabbt och till en måttlig kostnad.Demonstrerar proceduren blir Camille Forny, forskarassistent i mitt laboratorium. För att förbereda för mätning av sammandragningar av syncytia av människa-inducerad pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter, eller HIPSCCMs, börja med att placera CryoTubes som innehåller frysta celler i en 37 grader Celsius vattenbad i två minuter. Överför hela den tinade cellade suspensionen från varje rör till ett enda, färskt koniskt rör på 50 milliliter.För att hämta de överblivna cellerna, tvätta varje rör med en milliliter på 37 grader Celsius förvärmda pläteringsmedium och tillsätt detta medium till 50 milliliter koniska röret som innehåller tinade celler. Tillsätt åtta milliliter varmpläteringsmedium till röret och blanda försiktigt suspensionen. Använd trypan blå uteslutningsmetod och en hemocytometer för att räkna levande celler.Genom att lägga till varmpläteringsmedium, justera koncentrationen till 50, 000 celler per milliliter. För att fördela cellerna i två nya 384-väl cellodlingsplattor, tillsätt 25 mikroliter till varje brunn, vilket kommer att ge cirka 12, 500 celler per brunn. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius i 384-brunnsplattor i befuktad atmosfär med 5%koldioxid i totalt tre till fyra veckor.Följande dag, ersätta plätering mediet med 50 mikroliter av varmt underhåll medium. Därefter byter du ut hälften av underhållsmediet varannan till var tredje dag. På dag sju, 14 och 21, ersätta mediet helt.När cellerna har bibehållits i kultur i tre till fyra veckor, de har bildats spontant upphandlande syncytia, och effekten av föreningar på dessa sammandragningar kan mätas. På analysens dag, minst två timmar innan den första cellplattan ska placeras inuti plattläsaren för mätningen, sätt på läsaren och ställ värmesystemet på 37 grader Celsius. För att förbereda de sammansatta plattorna, varm till rumstemperatur 40 milliliter underhållsmedium kompletteras med 1%volym-för-volym penicillin streptomycin.Medan mediet värmer upp, fördela testföreningarna och kontrollerna i två 384-brunnsföreningar plattor genom att lägga till 1,5 mikroliter stamlösning per brunn. Centrifugera de sammansatta plattorna vid 100 G i en minut. Tillsätt 37 mikroliter underhållsmedium till varje brunn och centrifug plattorna igen vid 100 G i en minut.För att förbereda fluorescerande färgämne, varma 100 milliliter underhållsmedium kompletteras med 1%volym-för-volym penicillin streptomycin i en 37 grader Celsius vattenbad. Tillsätt sedan 10 milliliter av det uppvärmda mediet till blandningen av kalciumkänsligt fluorescerande färgämne och quencher för att rekonstruera dem som ett aktiefluorescensmedium. Starta programvaran för plattans läsare.Förbered programvaran för att spela in en två minuters segment av kalcium vågor med en förvärvsfrekvens på minst 10 hertz. För att göra fluorescensmedium för varje cellplatta, späd tre milliliter lager fluorescens medium med 12 milliliter varmt underhållsmedium med antibiotika. Ersätt 20 mikroliter medium i varje brunn av cellplattan med 30 mikroliter av fluorescensmedium och blanda genom pipettering upp och ner en gång.Omedelbart efter det, placera plattan i en tallrik läsare för att låta HIPSCCMs anpassa sig till läsarens temperatur i 60 minuter. Starta sedan programvaran för tallriksläsaren. Spela in ett två minuters segment av kalciumvågor med en förvärvsfrekvens på minst 10 hertz för att definiera baslinjen slå hastighet för varje brunn.Det är viktigt att se till att cellplattan inte överförs ut ur enheten efter datainsamling. Med vissa programversioner måste du stoppa inspelningen innan den avslutas helt. Använd plattläsarroboten för att pipettera fem mikroliter av testet och referensföreningar väl till brunn från den sammansatta plattan in i cellplattan.Efter det, starta datainsamlingen i plattan läsaren programvara för att spela in två minuters segment av kalcium vågor börjar vid fem, 15, 30, 45 och 60 minuter efter föreningen tillägg. För att starta dataanalys exporterar du rådata för varje inspelningsperiod från plattläsarprogramvaran i ASCII-textfiler. Och sedan importera dem till dataanalys programvara.Från dataanalysprogramvaran exporterar du de primära svävningsfrekvenserna för varje inspelningsperiod som urklippskopior. Extrahera den primära svävningsfrekvensen för varje brunn och varje tidspunkt. Slutligen, importera svävning frekvenser i ett kalkylblad programvara genom urklipp klistra in och fortsätta dataanalysen som beskrivs i textprotokollet.Inspelning av kalciumvågor vid baslinjen över en 384-brunnsplatta visar att i de flesta fall alla brunnar avslöjar en regelbunden svävningsfrekvens med liten variation över plattan. När blockerare av hjärtjonkanaler tillsätts påverkar de kardiomyocyternas rytm. Amlodipin, en blockerare av den långsamma kalciumkanalerna, accelererar rytmen mer än 100%i en koncentration beroende sätt upp till en mikromolar.Och ovanför det, amlodipin arresterar misshandeln. E-4031, en blockerare av den snabba fördröjd likriktare kalium kanalerna bromsar rytmen om 65 till 70%i en koncentration beroende sätt upp till 10 mikromolar. Tetrodotoxin, en blockerare av det fastar natrium kanaliserar decelerates rytmen omkring 15%i ett koncentrationsberoende sätt upp till en till 30 micromolar, eftersom över 30 micromolar, tetrodotoxin arresterar misshandeln inom de första femna noterar.Bepridil, en blandad blockerare av hjärt natrium, kalcium och kalium kanaler ger också en allt-eller-ingenting effekt, vilket tyder på att natrium kanalblock är den primära effekten av bepridil. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att vara extremt mild när pipettering i cellkultur plattan. Dessa vävnader är mycket ömtåliga och lätt skadade om de vidrörs av pipetter.Glöm inte att arbeta med mänskliga celler och aktiva droger kan vara farligt, och försiktighetsåtgärder som att bära skyddshandskar och glasögon bör alltid tas när du utför detta förfarande.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Medicine

Unit 1

Cardiovascular Drugs: Antihypertensive Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Guidekabel Assisted Kateterisering och färgade Dye injektion för Vascular Kartläggning av monochorionic Twin moderkakor

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av kardiomyocetisk Kärnor från Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Utveckling av en ljud-baserad virtuell spelmiljö för att bistå med kunskaper i navigering i Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Shrinkage of Dental Composite in Simulated Cavity Measured with Digital Image Correlation

Krympning av Dental Composite i Simulerad Cavity Mätt med Digital Image Korrelation

Polymerization shrinkage of dental resin composites can lead to restoration debonding or cracked tooth tissues in composite-restored teeth. In order to ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerande färgämnesmärkning av erytrocyter och leukocyter för att studera flödesdynamiken i muskelspiralcirkulationen

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Icke-invasiv bestämning av Vortex bildandet tid använda Transesophageal ekokardiografi under hjärtkirurgi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

En råtta halsartären tryckkontrollerad segmental ballong skada med periadventitial terapeutisk tillämpning

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Elektromekanisk bedömning av optogenetiskt modulerad kardiomyocytaktivitet

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Intrathecal Application of a Fluorescent Dye for the Identification of Cerebrospinal Fluid Leaks in Cochlear Malformation

Intrathecal Tillämpning av ett fluorescerande färgämne för identifiering av Cerebrospinal Fluid Läckor i Cochlear Missbildning

In cases of cerebrospinal fluid (CSF) leaks, reliable detection of their origins is needed to seal the leak sufficiently and prevent complications, such ...