Name: rigid embedding of fixed and stained, whole, millimeter-scale specimens for section-free 3d histology by micro-computed tomography
Uploaded: 2018-10-17T13:30:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Roland Myers pour aimablement les protocoles originaux de TEM. En outre, nous tenons à remercier m. John Colbourne pour fournir l’échantillon de daphnies , Dr Santhosh Girirajan pour fournir l’échantillon de drosophile et Dr Fadia Kamal permettant à l’embryon de souris. Les enquêteurs reconnaissent la contribution financière de la NIH (1R24OD18559-01-A2, PI : KCC), les laboratoires de Gittlen Jake pour la recherche sur le Cancer et d’un pilote prix financement des instituts Huck PSU de Sciences de la vie et de l’Institut pour la CyberScience.

Toutes les procédures sur les animaux vivants ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à la Pennsylvania State University.
1. jour 1 : Fixation
<ol><li>Pour améliorer la fixation et réduire le volume des contenus stomacaux, mourir de faim les poissons juvéniles pendant au moins 24 h pour un spécimen de 10 mm ou plus pour les plus gros spécimens (e.g., 72 h pour un échantillon de 14 mm).</li>
	<li>Avant de réfrigérer 10 % neutre tamponné au formol (NBF) et 2 x tricaïne-s (MS-222, 400 mg/L) sur la glace à 4 ° C.</li>
	<li>Double le poisson d’eau volume réfrigéré 2 x MS-222 d’euthanasie rapide et sans cruauté.</li>
	<li>Attendre 30 s (larves) à 60 s (juvéniles) après le poisson ne bouge.</li>
	<li>Plonger le poisson réfrigéré 10 % NBF pendant 10 min.</li>
	<li>Fixer le poisson dans une solution NBF 10 % réfrigérée pendant la nuit dans des récipients à fond plat à température ambiante. Remarque : Les récipients à fond plat sont nécessaires afin de minimiser la flexion de l’échantillon. Le volume du fixateur et les solutions de toutes les étapes subséquentes devraient être au moins 20 fois le volume de l’échantillon, sauf indication contraire. 1-5 larves poisson-zèbre, le volume de la solution recommandée est au moins 1 mL. Résultats insuffisants de fixateur dans mauvaise fixation et un surplus de volume de réactif n’influe pas négativement les résultats de la procédure décrite. Pour la fixation complète de gros poissons, entailler le ventre commence légèrement antérieur du pore anal. Utilisez une pénétration minimale de ciseaux ou un couteau et appliquez douce force loin le poisson lors de la coupe afin de minimiser les dommages aux organes internes. Protocoles de fixation ont été décrites par d’autres31,32,,33.</li>
</ol>2. jour 2 : Déshydratation & coloration
<ol><li>Rincer les échantillons fixés 3 fois en 1 x tamponné phosphate salin (PBS) pH 7.4 pendant 10 min.</li>
	<li>Submerger les échantillons à 35 % d’éthanol (EtOH) pendant 20 min à température ambiante avec agitation douce. Remarque : Pour toutes les étapes de l’agitation douce, utiliser un shaker table et définir pour un effet de mixage tout en évitant soigneusement de se cogner et en frottant de l’échantillon contre la surface du récipient.</li>
	<li>Submerger les échantillons dans 50 % EtOH pendant 20 min à température ambiante avec agitation douce.</li>
	<li>Dissoudre la poudre de (PTA) acide phosphotungstique dans l’eau pour préparer une solution 1 % p/v.</li>
	<li>Diluer la solution mère de PTA de 1 % à 100 % de 3:7 EtOH pour obtenir une solution colorante de PTA de 0,3 %.</li>
	<li>Tacher les échantillons du jour au lendemain dans la solution de PTA de 0,3 % à température ambiante avec agitation douce.</li>
</ol>3. jour 3 : Infiltration
<ol><li>Préparer le mélange 1:1 v/v d’une résine acrylique EtOH et LR blanc 100 % et mettre de côté.</li>
	<li>Rincer 3 fois à 70 % EtOH pendant 10 min.</li>
	<li>Submerger les échantillons dans 90 % EtOH pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce.</li>
	<li>Submerger les échantillons dans 95 % EtOH pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce.</li>
	<li>Submerger les échantillons deux fois en 100 % EtOH pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce.</li>
	<li>Submerger les échantillons dans le mélange de résine acrylique 1:1 EtOH et LR blanc du jour au lendemain à la température ambiante en agitant doucement.</li>
</ol>4. jour 4 : intégration
<ol><li>Submerger les échantillons 100 % LR blanc résine pendant 2 h à température ambiante avec agitation douce.</li>
	<li>Remplacer la résine à l’étape 4.1 avec frais 100 % LR blanc résine et incuber pendant 1 heure à température ambiante avec agitation douce.</li>
	<li>Assembler l’appareil encastrement (Figure 1).</li>
	<li>Couper polyimide tube de diamètre approprié et la longueur. NOTE : Le tuyau d’un diamètre intérieur qui est plus grand que le diamètre de l’éprouvette au moins 0,1 mm est recommandé. Pour les spécimens typiques, une longueur standard de 30 mm de tube est utilisée pour chaque échantillon. Quand vous le souhaitez, allongée de spécimens peuvent être logés en utilisant des tubes plus longues.<ol>
<li>Attacher une micropipette P1000 à l’extrémité la plus large de l’adaptateur de l’encastrement et insérez le tube de polyimide à l’extrémité la plus étroite (Figure 1). Si l’adaptateur de l’encastrement n’est pas disponible, passez à l’étape 4.3.3. Dans le cas contraire, continuer à 4.4 étape.</li>
		<li>Attache l’extrémité d’une pointe de micropipette tout droit de telle sorte que le tube de polyimide s’adapte parfaitement. Couper à 44 mm de l’extrémité la plus large d’une pointe de jaune micropipette 200 µL pour le 0,0403" tubes et 59 mm du bas de pointe de 1 mL de bleu pour le 0,105" tube. Ajuster au besoin.</li>
		<li>Fixez l’embout de micropipette coupées à une micropipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les échantillons à une pesée petit bateau ou un bassin en forme de V de solution et immerger complètement les échantillons en 100 % résine LR blanc.</li>
	<li>Avec le dispositif d’encastrement de 4,3 étape, viser le tube à l’extrémité la plus large de l’échantillon fixe (ou vers la tête dans le cas de spécimens animaux) et Pipeter le spécimen lentement dans le tube. Position de l’échantillon dans le milieu de la tubulure et que le tube au-dessus et au-dessous de l’échantillon est rempli avec de la résine.<ol>
<li>Pipetter l’échantillon dans le tube tel que l’échantillon se déplace dans le sens naturel, en avant. NOTE : Pipetage lente évite les bulles d’air et spécimen dégâts par abrasion contre le bord du tube. Déplacement vers l’arrière dans le tube peut facilement endommager les extrémités (membres, ailes, ailerons, etc.). Il est recommandé de laisser quelques débordement de résine dans l’appareil d’encastrement afin que, plus tard, air n’entre pas dans le tube au moment du retrait.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immédiatement joint l’extrémité ouverte avec glaise à modeler souple à base d’huile.<ol>
<li>Aplatissez l’argile dans une feuille de mm d’épaisseur 1.</li>
		<li>Stabiliser le tuyau entre l’index et le majeur.</li>
		<li>Appuyez lentement sur l’argile contre l’extrémité du tuyau avec le pouce.</li>
		<li>Enlever l’argile excédentaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez l’appareil de l’encastrement de la micropipette.</li>
	<li>Tirez le tube par rotation douce et sceller l’autre extrémité avec l’argile.<ol>
<li>Maintenez un doigt contre l’extrémité scellée afin d’éviter l’éjection de l’argile.</li>
		<li>Pousser doucement l’extrémité non scellée du tube dans l’argile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déposer le tube horizontalement et polymériser la résine pour 24h à 65 ° C. NOTE : Positionnement Horizontal permet d’éviter le mouvement de l’échantillon lors de la polymérisation. Si une petite quantité d’air était coincée à l’étape 4.8, la fin avec la bulle d’air soit plus élevée légèrement pour empêcher le mouvement de bulle d’air vers le spécimen. Ce qui est important, trop d’altitude lors de la polymérisation peut causer le spécimen à tomber vers le bas de gamme due à la pesanteur. Un échantillon bien incorporé est montré par rapport à un avec une bulle d’air, qui doit être évitée car la réfraction des interfaces air/résine peut dégrader la qualité de l’image (Figure 2).</li>
</ol>5. jour 5 : Collection
<ol><li>Recueillir les échantillons destinés à l’acquisition d’images à la fin du jour 5. Remarque : La suppression du tube de polyimide est possible mais pas nécessaire pour l’imagerie. Imagerie de micro-CT axés sur le rayonnement synchrotron pour l’échantillon de poisson-zèbre était jouée à Beamline 2-BM à Advanced Photon Source (APS) en Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). Pour poisson zèbre teinté PTA, une gamme d’énergie de rayons x optimale de 5 à 30 keV a été déterminée et une énergie de rayons x de 13,8 keV a été utilisé pour imagerie. 1501 les projections ont été obtenues à 13,8 keV sur 180 degrés (1 projection chaque 0,12 °) avec un appareil photo 2048-par-2048 pixels. En outre, deux images de terrain plat (gain) (un au début) et l’autre à la fin de l’acquisition et une image de fond noir ont été également acquis. Corrections de champ plat et fond noir, réduction des artefacts anneau et reconstruction de l’image ont été effectuées à l’aide de l’open source TomoPy toolkit34. PTA-teinté Daphnia et Drosophila échantillons ont été projetés sur un microscope à rayons x12,35. Les paramètres micro-CT spécifiques dépendent de l’objet et la qualité de la tache. Par exemple, l’échantillon de drosophile a été scanné à 40 kVp, 74 mA et 15 s à une résolution de voxel de 3,10 x 3.10 x 3.10 µm3.</li>
</ol>

<ol>
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Tous les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé pour l’immobilisation rigide millimètre-échelle fixe et tachée de spécimens (0,5 à 2,5 mm de diamètre) pour l’imagerie micro-CT. Compte tenu de la progression rapide de la technologie micro-CT en ce qui concerne la résolution et la vitesse, une méthode de conservation des échantillons permanentes avec Re-imaging fonctionnalités est hautement souhaitable. Traditionnellement, résine enrobage dense sont couramment en microscopie électronique pour apporter un soutien structurel pour coupes ultraminces et minimiser les dégâts au modèle de formulaire. Notre méthode adapté à son utilisation pour l’immobilisation rigide pendant la formation image non destructive. Pour réduire les artefacts d’imagerie de la présence de l’excès de résine, nous avons mis en place l’utilisation de tubes de polyimide transparent aux rayons x pour créer des échantillons sans bords ronds et de limiter le volume de résine autour de l’échantillon.
Résultat optimal de la procédure d’incorporation est subordonnée à l’exécution minutieuse de plusieurs étapes critiques et d’attention à l’intégrité des échantillons tout au long de la procédure. En effet, endommageant l’échantillon entraînera une image finale compromise indépendamment du succès de l’exécution de l’imagerie. Comme au froid contribue à une diminution des réactions de douleur et interprétations tissus se dégradent plus rapidement à des températures plus élevées, nous utilisons réactifs préalablement réfrigérées. Gros spécimens devrez peut-être être découpé pour permettre l’entrée de fixateur à l’intérieur de l’échantillon pour que les organes internes comme le foie, du pancréas et l’intestin sont complètement fixe. Tissus non fixées se détériorent et perdent l’intégrité structurale, détruisant la structure biologique. Une autre étape clé consiste à maintenir le spécimen dans son alignement naturel. Par conséquent, nous plaidons pour l’utilisation des conteneurs à fond plat, que nous utilisons tout au long de la procédure et sont particulièrement important lors de la fixation. Tubes de fixation en polypropylène ou tubes coniques qui ont généralement un fond en forme de V sont à proscrire car ils peuvent provoquer des échantillons allongées à plier, qui déforme la morphologie naturelle du spécimen. En outre, pour minimiser l’utilisation de résine, le diamètre intérieur du tuyau polyimide est seulement légèrement plus grand que la largeur de l’échantillon. Flexion du spécimen peut également entraîner des dommages au spécimen lorsqu’elle entre dans le tube. Il est également recommandé de transférer le spécimen dans le tube de manière naturelle vers l’avant afin d’éviter des extrémités dommageables. Bonne déshydratation est une autre étape critique. Ceci est effectué par petits incréments de l’augmentation des concentrations de EtOH lentement remplacer l’eau par EtOH, qui est plus miscible avec de la résine. Fortes augmentations de concentration EtOH sont associées par rétrécissement des tissus et peuvent être atténuées par tranche supplémentaire de EtOH incubation pour rendre la transition plus graduelle. Enfin, pour minimiser le mouvement de l’échantillon ou de poches d’air, s’il y a lieu, les échantillons sont placés horizontalement au cours de la polymérisation de la résine (fin du jour 4). Poches d’air ou de produit d’étanchéité à côté de l’échantillon provoque des artefacts optiques avec imagerie par rayons x associé à diffraction de bord, affecter la qualité de l’image.
En ce qui concerne les éventuelles modifications au protocole, autres encastrement résines et métal taches peuvent être utilisés à la place d’acrylique blanc LR et PTA, respectivement. Embed812, une résine époxy couramment utilisée en microscopie électronique, est très visqueux, plus difficile à transférer, peut entraîner la distorsion des spécimens et est associé à fond plus élevé que les résines de méthacrylate acrylique ou glycol. Alors que JB4 Plus, un méthacrylate de glycol, est moins visqueux que EMbed812 et a fond inférieur, formation aléatoire des poches d’air apparaissent fréquemment dans le voisinage de l’échantillon. Comme mentionné, les poches d’air dégrader la qualité d’image et sont particulièrement problématiques pour les précieux échantillons. Il est à noter que Technovit 7100, un autre méthacrylate de glycol, interfère avec la coloration de PTA, aboutissant à faible contraste dans l’image finale. Comparativement, acrylique blanc LR a une viscosité comme l’eau, faible bruit de fond et n’interfère pas avec la coloration de la PTA. Dans nos mains, le taux de réussite de l’incorporation en LR blanc sans bulles d’air ou de dommages échantillon est supérieur à 95 %. Pour ces raisons, nous recommandons son utilisation comme la résine d’enrobage pour tissu micro-CT. En ce qui concerne les taches, les résultats de divers métaux tels que le tétroxyde d’osmium, iode, et taches PTA en imagerie micro-CT a été comparé et discutés ailleurs15,16,17 et déborde le cadre de la présente manuscrit.
La taille de l’échantillon est une limitation majeure à notre protocole actuel. Puisque nous employons d’aspiration pour transférer les échantillons dans le tube, la possibilité de voir le spécimen est essentielle pour l’orientation et de veiller à ce qu’il est en effet dans le tube. Ainsi, submillimétrique échantillons comme le Tardigrade (i.e., ours de l’eau) sont extrêmement difficiles à incorporer car ils nécessitent l’utilisation de microscope pour être visualisées. Une fois que la succion est appliquée, échantillons microscopiques sont facilement perdus de plan focal et devient difficiles à redécouvrir, rendant difficile de déterminer si elles passées trop loin par l’extrémité du jointe du tube. Plus grands échantillons, tels que des embryons de souris, (3-10 mm) peuvent être incorporés avec de légères modifications au protocole encastrement (Figure 4). En particulier, le tube de polyimide était rempli à 1/3 avec de la résine liquide, qui est polymérisée avant incorporation. L’échantillon fixe et Taché a été placé sur le dessus de la résine polymérisée pre. Le tube était alors entièrement rempli de résine non polymérisée et suivi d’une polymérisation deuxième.
L’importance de notre protocole d’encastrement est multiple. Rigidement immobilisée tout animal ou un tissu spécimens sont souhaitables pour des raisons notamment : (1) créer des dépôts à long terme des échantillons qui sont difficiles à produire ou à préparer ; (2) ré-acquisition de données ; (3) activation de série d’imagerie utilisant plusieurs modalités d’imagerie ; et (4) fourniture normes d’étalonnage et de développement technologique. Échantillons préparés avec notre procédure d’incorporation sont réunis dans une résine solide qui est résistante contre les dommages et peuvent donc être facilement stockés peut-être indéfiniment. Entreposage à long terme est particulièrement utile pour des spécimens rares ou laborieusement générés tels que ceux associés aux projets d’autant. En outre, dans le cas où les données numériques sont perdues, les données peuvent être générées sur l’échantillon original. La capacité de re-imaging sur une longue période de temps potentiellement permet le même échantillon à interroger avec plus avancé dans l’avenir, des modalités d’imagerie. Puisque les échantillons sont physiquement stables entre instances d’imagerie, les images sont acquises du même spécimen dans la même orientation, facilitant l’enregistrement entre les ensembles de données antérieures et postérieures. Par exemple, une image basse résolution accorde seulement segmentation des tissus dans une larve de poisson-zèbre. La même larve peut plus tard être reconfigurée à haute résolution afin que des analyses informatiques à résolution cellulaire plus détaillées. Cette capacité de comparaison directe entre les balayages enregistrés suggère échantillons enrobées dans la résine comme un potentiel standard pour le développement de la technologie de micro-CT. Les effets d’une modification à la méthode d’imagerie peuvent être évaluées par imagerie du même échantillon pour que toutes les variables dans l’étape de préparation d’échantillon sont contrôlés. Enfin, un échantillon standard enrobées dans la résine peut servir pour l’étalonnage de l’instrument pour tester la cohérence de l’imagerie.
Nos travaux antérieurs en examinant l’histologie des poissons mutants et malades a montré que résolution cellulaire permet de détecter des anomalies subtiles dans la structure des tissus qui sont négligés dans examen brut à l’aide de la dissection de microscope36, ou une faible puissance microscope stéréo. Nous souhaitons développer nos analyses à haute résolution pour les échantillons humains. Les larves de poisson zèbre, qui constituent l’objet principal de notre travail de développement, sont semblables aux biopsies à l’aiguille humain dans leur fragilité, l’hétérogénéité des tissus cellulaires et intercellulaires, taille (1-3 mm de diamètre) et allongée. Basé sur notre expérience avec le poisson-zèbre et d’autres travaux montrant que micro-CT avec succès souillé et analysé les tissus humains, mais à plus faible résolution37, nous attendons de nos approches pour apporter une valeur ajoutée à l’imagerie et l’analyse de biopsies à l’aiguille. Nous avons estimé que l’assemblage d’un kit suffit pour une préparation d’échantillons jusqu'à 20 de la même condition d’être potentiellement moins de 30 USD. Les échantillons préparés par notre méthode d’encastrement sont résistant aux dommages physiques et donc facile à transporter. Le faible coût et la facilité de transport laissent entrevoir la possibilité de prélèvement d’échantillons sur à travers le monde, particulièrement dans les zones où l’imagerie cellulaire de résolution avec micro-CT n’est pas facilement accessible. Notre vision est que les fichiers numériques haute résolution des biopsies à l’aiguille (allant de 0,1 à plusieurs téraoctets) pour permettre la création d’un atlas numérique de tissus humains et en même temps aux chercheurs affiner et améliorer les pipelines d’analyse actuel pour localisation et caractérisation quantitative de l’architecture cellulaire et tissulaire dans le cadre entièrement en 3D des tissus scannés.

Phénotypes sont des traits observables d’un organisme qui représentent les conséquences des interactions uniques entre son bagage génétique et l’environnement. Ces caractéristiques peuvent inclure des propriétés comportementales, biochimiques, morphologiques, perfectionnement ou physiologiques. Ce qui est important, différences dans les caractéristiques entre les organismes de type sauvage et des mutants génétiques peuvent fournir des clés mieux comprendre les mécanismes et les fonctions des gènes touchés. En ce qui concerne la morphologie, histopathologie est l’étalon-or pour l’évaluation des phénotypes au niveau cellulaire, mais souffre d’artefacts mécaniques et ne permet pas une analyse précise de volumétrie quantitative1. Notre laboratoire est motivé pour surmonter les obstacles à l’application de la puissance diagnostique d’histologie aux volumes de tissus pleine résolution submicronique.
Une enquête sur les technologies disponibles laisse entendre que l’imagerie par rayons x micro-calculé tomographie (micro-CT) peut fournir des capacités idéales requises pour histologie de millimètre-échelle animaux entiers 3 Dimensions (3D). Micro-CT permet la visualisation non destructifs, isotrope, 3D et la capacité d’effectuer une analyse quantitative des tissus architecture1,2. Ces dernières années, l’imagerie 3D du poisson-zèbre incolores et colorés à métal par micro-CT a acquis une traction accrue et a été utilisé pour l’analyse volumétrique des divers tissus, y compris le muscle, des dents, des os et des tissus adipeux3,4 ,5,6,7,8,9,10. Autres organismes modèles et échantillons de tissus se prêtent également à l’imagerie micro-CT. Par exemple, un pipeline a été introduit pour quantifier la neuroanatomie de méso-échelle dense de cerveaux de souris imagé par rayonnement synchrotron micro-CT11. De même, un protocole de coloration axée sur l’éosine s’est avéré être approprié pour l’imagerie des tissus mous micro-CT de souris tout organes12. L’analyse morphométrique des vertèbres de L3 humaines non colorés et la visualisation des poumons humains colorés à l’argent à l’aide de micro-CT ont démontré l’utilité de cette technologie pour homme échantillons13,14.
Afin d’actualiser la grande promesse de micro-CT pour complet phénotypage morphologique des animaux petits intacts et des échantillons de tissus, un certain nombre d’obstacles doivent être surmontés en ce qui concerne le débit, résolution, champ de vision complet cellule souillant, et la préservation à long terme. Alors que chacun de ces aspects est extrêmement important, la mise au point du présent manuscrit est l’optimisation des procédures de l’encastrement, avec des notes supplémentaires sur la fixation de l’échantillon et la coloration. Coloration des métaux lourds est utile parce que le contraste inhérent entre différents tissus mous dans les images de micro-CT est faible. Les taches de l’activité de divers métaux, comme le tétroxyde d’osmium, iode, l’acide phosphotungstique (PTA) et gallocyanin-chromalum, pour renforcer le contraste pour l’imagerie micro-CT a été étudié15,16,17. L’acétate d’uranyle a également servi comme agent de contraste pour l’imagerie micro-CT de l’os et le cartilage18,19. PTA tel qu’utilisé dans notre protocole conduit à une coloration uniforme de presque tous les tissus et cellules dans des échantillons de poisson zèbre ensemble, produisant des images qui sont potentiellement compatibles avec des études d’histologie-comme à travers des volumes complets du tissu.
Lors de l’acquisition de l’image de la micro-CT, une projection (2D) 2 dimensions est prise comme l’échantillon est tourné par une fraction de degré et répétée jusqu'à ce que l’échantillon a effectué une rotation de 180° ou 360°, production d’une série de milliers de projections 2D utilisées pour le reconstruction du volume 3D20. Dans ce processus, toute perturbation de l’échantillon entraînera les projections 2D correspondantes à être hors de l’alignement, résultant en des volumes 3D mal reconstruits. Immobilisation de l’échantillon est un moyen pour corriger ce problème et certaines stratégies actuelles impliquent submergeant l’échantillon dans de l’alcool ou l’incorporation dans l’agarose dans des tubes en polypropylène ou une micropipette conseils3,5,15, 16 , 21 , 22. méthodes d’immersion dans un liquide ne sont pas idéales car mouvement échantillon au cours de l’acquisition d’images peut se produire entre les ensembles d’imagerie, ayant pour résultat des reconstructions décalées des volumes 3D23. En outre, il est bien connu que la stabilité physique des échantillons de tissu liquide stocké est pauvre dans les échelles de temps des mois d’années, en raison de l’instabilité chimique et surface abrasion par déplacement des points de contact entre l’échantillon et le container mural ( observations personnelles avec des échantillons des tissus animaux et humains fixe).
Pour réduire le risque de mouvement de l’échantillon au cours de l’imagerie, les échantillons peuvent être incorporés dans d’agarose24,25,26, mais cette pratique est associée au risque de la tache de diffusion en gel d’agarose, réduisant ainsi l’image 26de contraste. En outre, les préparations liquides ou gel d’agarose sont sujettes à des dommages physiques et se dégradent au fil du temps, ce qui les rend impropres à la conservation à long terme de l’échantillon. Nous avons pensé qu’une méthode d’immobilisation échantillon potentiellement fructueuse et simple pourrait être adaptée de celui utilisé pour les échantillons au microscope électronique. Résines polymérisées telles que EPON 812 (supprimée et remplacée par incorporer 812) sont couramment utilisés pour fournir la dureté nécessaire pour produire des coupes ultrafines pour microscopie électronique27,28. En effet, plusieurs études comparatives entre imagerie par rayons x et microscopie électronique ont montré que les échantillons embarqués en résine peuvent être photographiées par rayons x microscopie29,30. Toutefois, certaines pratiques standards de la microscopie électronique ne se traduisent pas directement à l’imagerie micro-CT. Par exemple, l’imagerie micro-CT d’échantillons avec carré résine bords des blocs de résine typique et échantillons découpés de ces blocs est associé avec des artefacts de diffraction de bord qui peuvent interférer avec l’imagerie. Lissage des bords de résine, bien que possible, est long et laborieux.
Bien qu’une variété de résines encastrement plastique sont employés en microscopie électronique, le fond élevée associé à des résines plus difficiles comme Embed 812 nous a conduit à tester d’autres. Nous avons choisi LR blanc en raison de sa faible viscosité, faible retrait, faible tendance aux bulles de forme au cours de la polymérisation et fond inférieur. Pour créer des échantillons gratuits à bord et pour réduire au minimum la quantité de résine autour de l’échantillon, nous avons élaboré des protocoles pour dessiner des spécimens en résine liquide en tube de polyimide avant la polymérisation. Polyimide a été choisi pour sa grande stabilité thermique et haute transmittance de rayons x afin que le retrait du tube n’est pas nécessaire pour l’imagerie. Enfin, nous avons conçu un adaptateur personnalisé micropipette pour notre échantillon enrobage technique afin de tenir la tuyauterie et de prévenir la contamination des micropipettes de façon fiable. L’adaptateur peut être 3D imprimées à partir d’un fichier d’image de CAD. Pris ensemble, les méthodes de préparation d’échantillon présenté ici vise faire incorporant de petits échantillons de plus simples, atteindre amélioré coloration contraste, immobilisation rigide et le stockage à long terme des spécimens intacts à l’échelle du millimètre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X Neutral buffered formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotunstic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK282402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide tubing (ID 0.04&#34;)</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>141-0065</td>
			<td>The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based soft modeling clay</td>
			<td>Sculpey</td>
			<td>S302 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66015-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-shaped basin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L yellow micropipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL blue micropipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>M71735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rigid embedding of fixed and stained, whole, millimeter-scale specimens for section-free 3d histology by micro-computed tomography

Depuis plus de cent ans, l’étude histologique des tissus est l’étalon-or pour le diagnostic médical car l’histologie permet tous les types de cellules dans tous les tissus à être identifié et caractérisé. Notre laboratoire travaille activement à faire des avancées technologiques en rayons x micro-tomographie (micro-CT) qui apportera la puissance diagnostique d’histologie à l’étude des volumes de tissu plein à résolution cellulaire (i.e., une radiographie Modalité de histo-tomography). À cette fin, nous avons apporté des améliorations ciblées à la canalisation de préparation d’échantillon. Une optimisation des clés et l’objectif de ce travail, est une méthode simple pour l’enrobage rigide des échantillons de millimètre-échelle fixe et colorées. De nombreuses méthodes publiées pour immobilisation de l’échantillon et l’imagerie corrélative de micro-CT dépendent de placer les échantillons dans la paraffine, gel d’agarose ou liquides tels que l’alcool. Notre approche s’étend ce travail avec des procédures personnalisées et la conception d’un appareil de 3 dimensions imprimable pour incorporer les échantillons dans une résine acrylique directement à polyimide tube, qui est relativement transparent aux rayons x. Dans les présentes, procédures de préparation des échantillons sont décrits pour les échantillons de 0,5 à 10 mm de diamètre, ce qui serait approprié pour tout poisson zèbre larves et juvéniles ou d’autres animaux et des échantillons de tissu de dimensions semblables. Comme preuve de concept, nous avons incorporé les spécimens du Danio, drosophile, Daphniaet un embryon de souris ; les images représentant des analyses 3D pour trois de ces échantillons sont indiqués. Important, notre méthodologie conduit à des avantages multiples, y compris l’immobilisation rigide, la conservation à long terme des ressources créées par laborieusement et la possibilité de ré-interroger les échantillons.

Le protocole décrit ci-dessus détails la procédure de préparation d’échantillon pour les larves de poisson zèbre ensemble et juvéniles d’imagerie micro-CT. Notamment, cette méthode est facilement adaptée à d’autres types d’échantillons (e.g., drosophile, daphnies, Arabidopsis, organes de souris). Temps d’incubation dans les différentes étapes sont appropriés pour les larves de poisson zèbre et des échantillons de taille similaire ; plus grands échantillons peuvent exiger plus de temps d’incubation. Pour faciliter l’échantillon incorporant des étapes, nous avons conçu un adaptateur qui se fixe à une micropipette de 1 mL et peut être personnalisé pour différentes tailles de polyimide tube (Figure 1). Cet adaptateur personnalisé était 3D imprimées à partir d’un fichier de CAO qui est associé à ce manuscrit et disponible au téléchargement sur http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Étant donné que tous les lecteurs ne peuvent pas avoir accès à une imprimante 3D, assemblage d’un appareil d’encastrement maison utilisant une micropipette pointe est décrite dans le protocole (étape 4.3). Une larve de poisson zèbre avec succès embarqué est montrée par rapport à un modèle avec une bulle d’air (Figure 2), qui sera probablement dégrader la qualité d’image. Pour montrer la polyvalence de la procédure d’incorporation, nous montrons les spécimens de différents organismes modèles (i.e., Danio, drosophile, daphnies, embryon de souris) qui sont passés par l’échantillon préparation pipeline ( La figure 3). Des volumes 3D reconstruits toute spécimens Danio, Daphniaet Drosophila imagé par micro-CT s’affichent (Figure 4). Ce qui est important, comme en témoigne l’exemple de Danio , ces spécimens peuvent être stockés pendant une longue période de temps et réutilisés pour plusieurs sessions d’imagerie (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig1.jpg"> Figure 1. Incorporation des appareils. (A) un adaptateur a été conçu pour faciliter l’intégration à l’aide des outils communs de laboratoire. (B) une illustration transversale de l’adaptateur. (C) l’incorporation des appareils après l’insertion du tuyau à l’adaptateur point a polyimide et y attacher une micropipette au niveau de l’adaptateur (c). Segment d’adaptateur (b) est une chambre de dépassement de capacité conçue pour accueillir des excès de résine et de protéger la micropipette de toute contamination. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig2.jpg"> Figure 2. Intégré avec succès les spécimens est dépourvues de bulles d’air. (A) un incorporé 3 jours après la fécondation (dpf) larvaire zebrafish sans bulle d’air. (B) un poisson-zèbre 3 dpf embarqué avec une bulle d’air. Air emprisonné pendant le processus d’incorporation peut se déplacer vers l’échantillon si l’échantillon n’est pas placé horizontalement au cours de la polymérisation. Barreaux de l’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig3.jpg"> Figure 3. Une grande variété de spécimens peut être incorporée avec notre protocole. (A) larve de poisson-zèbre de dpf 7. (B) adulte drosophile. (C) adulte Daphnia. (D) embryon de souris. Plus grands échantillons comme l’embryon de souris sont hébergés par quelques modifications au protocole. En bref, la tubulure de polyimide était remplie de résine pour 1/3 de sa longueur et polymérisée avant incorporation. Échantillon fixe et Taché a été placé sur le dessus de la résine polymérisée pre. Le tube était ensuite rempli de résine non polymérisée, suivie d’une polymérisation deuxième. Le tube de polyimide a été retiré avant des photographier afin de permettre la meilleure visualisation de l’échantillon dans cette figure. Le retrait du tube n’est pas nécessaire pour l’acquisition d’images avec succès par des barres d’échelle micro-CT. : images de spécimen, 5 mm ; agrandi les EISN, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig4.jpg"> Figure 4. 3-dimensional rendus des échantillons embarqués. (A) reconstruit 3 larve de poisson-zèbre dpf à 0.743 × 0,743 × 0,743 µm3 voxel résolution. (B) reconstruit adultes Daphnia (3 × 3 × 3 µm3 voxel résolution). (C) reconstruit adulte Drosophila (résolution de voxel3 × 3,1 3,1 × 3,1 µm). Sections transversales numériques peuvent être générés à n’importe quel angle comme illustré sur la colonne de gauche. Rendus de surface sont affichés sur la droite, restitué à l’aide de logiciels commerciaux. Enrobage résine peut être vu dans tous les scans en dehors de l’échantillon (note *), mais n’interfère ne pas avec l’échantillon lui-même. La larve de poisson-zèbre a été photographiée à l’Argonne National Laboratory à l’Advanced Photon Source qui est axée sur le rayonnement synchrotron. Les daphnies ou Drosophila spécimens ont été imagées avec un microscope à rayons x commercial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig5.jpg"> Figure 5. Échantillons avec notre protocole peuvent être recréées avec micro-CT. La larve de poisson-zèbre 5 dpf même a été photographiée en 2011 (A) et (B) 2013, présentés comme les projections de l’intensité moyenne de la vue sagittale. Comparaison entre les balayages après que le stockage montre la préservation des caractéristiques anatomiques de l’image. C un gros plan de muscle des deux analyses est présentent, segmentés lignes qui indiquent les régions correspondantes utilisées pour la génération de profil intensité (D). Profils d’intensité normalisées à leurs moyennes correspondantes dans les deux sens indiquent dans l’espace correspondant à des pics les dans les deux scans. (E) moyenne des valeurs d’intensité dans certaines régions a et B appartenant à fond (Bg, pourpre), les noyaux neuronaux (N, vert), substance blanche (W, bleu) et le muscle (M, orange) ont été divisés en moyenne pour le fond (blanc) et utilisé pour générer le signal-bruit rapports (SNR), ce qui correspond bien entre les balayages. Barreaux de l’échelle = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Nous avons mis au point des protocoles et conçu un appareil personnalisé pour permettre l’incorporation de spécimens à l’échelle du millimètre. Nous présentons des méthodes de préparation d’échantillon en mettant l’accent sur l’incorporation dans la résine acrylique et de polyimide tube pour atteindre l’immobilisation rigide et le stockage à long terme des échantillons pour l’interrogatoire de morphologie architecture et cellules de tissus par micro-CT.

Rigide incrustation du fixe et tachée, ensemble, échelle millimétrique spécimens pour histologie exempt de Section 3D de Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Cette méthode vous permettra de générer des images histologiques tridimensionnelles à partir de petits échantillons à l’échelle millimétrique, y compris de petits organismes modèles. Le principal avantage de cette technique est que les échantillons intégrés sont très stables, vous permettant de garder les échantillons pendant de longues périodes de temps et de les imager plusieurs fois, par exemple avec différentes méthodes d’imagerie au fil des ans. La sortie de cette méthode sera très utile pour la phénomie du système de modèle à haut débit, la toxicologie, et potentiellement même le diagnostic des tissus humains.En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que les échantillons sont relativement petits et difficiles à orienter ou à manœuvrer. La démonstration visuelle est essentielle parce que l’attention est nécessaire pour éviter les dommages à l’échantillon. Pour les poissons zèbres juvéniles ou plus âgés, les affamer pendant au moins 24 heures afin de réduire le volume de contenu intestinal avant la fixation.Déplacez la formaline tampon neutre de 10 % ou NBF et le 2x Tricaine-S pré-refroidi à quatre degrés Celsius sur la glace. Doublez le volume d’eau de poisson avec le 2x MS-222 réfrigéré pour une euthanasie rapide et humaine. Soixante secondes après que les poissons ont cessé de bouger, après l’euthanasie sans cruauté, placez le poisson dans la solution réfrigérée de 10% NBF dans des flacons de verre à fond plat à température ambiante, et fixez-les pendant la nuit.Le deuxième jour, rincer les spécimens de poisson fixes trois fois en 1x PBS pH 7,4 pendant 10 minutes chacun. Après le lavage, submerger les échantillons dans 35% d’éthanol et incuber pendant 20 minutes à température ambiante avec une agitation douce. Répétez ensuite cette étape avec 50% d’éthanol.Incuber les échantillons dans de l’acide phosphotungsten fraîchement préparé ou de la solution PTA pendant la nuit à température ambiante avec une légère agitation pour les tacher. Commencez la troisième journée en préparant un mélange volume par volume de 100 % d’éthanol et de résine acrylique blanche LR. Rincer les échantillons trois fois dans 70% d’éthanol pendant 10 minutes chacun, puis incuber les échantillons dans 90% d’éthanol à température ambiante pendant 30 minutes avec une agitation douce.Répétez l’incubation dans les mêmes conditions, mais 95% d’éthanol, puis deux fois de plus avec 100% d’éthanol. À la fin, submergez les échantillons dans un mélange d’éthanol et de résine acrylique blanc LR, et incubez à température ambiante pendant la nuit avec une légère agitation. Le quatrième jour, retirer le mélange du flacon et ajouter de la résine blanche 100% LR pour submerger les échantillons.Incuber pendant deux heures à température ambiante avec une légère agitation. Après deux heures, remplacer la résine par de la résine blanche fraîche 100% LR, et incuber pendant une heure à température ambiante avec une légère agitation. Pour assembler l’appareil d’intégration, utilisez le tube poly MI d’un diamètre d’au moins 0,1 millimètre supérieur au diamètre de l’échantillon et coupez-le à une longueur standard de 30 millimètres.Attachez ensuite une tête de micro-tuyau P1000 à l’extrémité blanche de l’adaptateur d’intégration et insérez le tube poly MI à son extrémité étroite. Une fois que les échantillons ont incubé pendant une heure en résine blanche 100% LR, transférez-les sur un petit bateau de peseur et submergez-les complètement en résine blanche 100% LR. Visez le tube de l’appareil d’intégration à l’extrémité large de l’échantillon fixe, ou vers la tête, et pipet le spécimen lentement dans le tube.Placez l’échantillon au milieu du tube, en vous assurant que le tube au-dessus et au-dessous du spécimen est rempli de résine. Immédiatement après, pour sceller l’extrémité ouverte du tube, aplatissez un morceau d’argile douce à base d’huile dans une feuille d’environ un millimètre d’épaisseur et stabilisez le tube entre l’index et les doigts du milieu. Puis appuyez lentement sur l’argile contre l’extrémité du tube avec le pouce, et enlever tout excès d’argile.Retirez l’appareil d’intégration de la tête du micro-tuyau. Retirez le tube par rotation douce. Tout en tenant un doigt contre l’extrémité scellée pour empêcher l’éjection de l’argile, sceller l’autre extrémité en poussant lentement l’extrémité non scellée du tube dans l’argile.Placez le tube horizontalement sur une grille à tube et laissez la résine polymériser pendant 24 heures à 65 degrés Celsius dans le four. À la fin du lendemain, prélevez les échantillons pour l’acquisition d’images. Une larve de poisson zèbre intégrée avec succès n’a pas de bulles d’air piégées.Si l’air est emprisonné pendant le processus d’intégration, il peut se déplacer vers le spécimen si l’échantillon n’est pas placé horizontalement pendant la polymérisation, ce qui peut dégrader la qualité de l’image. Ce protocole a réussi à intégrer divers organismes modèles. Comme le poisson zèbre, la drosophile, la daphnie et l’embryon de souris.L’intégration réussie peut être montrée avec des rendus 3D reconstruits, photographiés par balayage de micro-CT pour zebrafish, Daphnia, et Drosophila. La résine d’intégration peut être vue dans tous les balayages à l’extérieur de l’échantillon, mais n’interfère pas avec l’échantillon lui-même. Ces spécimens peuvent être stockés pendant une longue période de temps et réutilisés pour plusieurs séances d’imagerie, comme le montre la larve de poisson zèbre photographiée en 2011.Et puis à nouveau en 2013. Les caractéristiques anatomiques sont conservées après le stockage, comme on le voit sur les gros plan des muscles des deux scans. En outre, les profils d’intensité normalisés à leurs moyennes correspondantes le long des lignes segmentées, montre spatialement correspondant pics locaux dans les deux scans.Les valeurs moyennes d’intensité pour certaines régions des deux scans ont été divisées par une moyenne pour l’arrière-plan et utilisées pour générer des rapports signal-bruit, ce qui correspondait bien entre les balayages. Tout en essayant cette méthode, il est important de travailler doucement pour éviter les dommages à l’échantillon et de travailler avec soin pour empêcher l’introduction de bulles d’air. Suivant cette procédure, d’autres méthodes telles que l’histologie ou la microscopie électronique peuvent être utilisées afin d’étudier les modèles d’expression des protéines, ou d’obtenir une résolution plus élevée des régions d’intérêt en 2D.Nous espérons que cette publication vous aidera à accéder à la puissance du micro-CT tissulaire haute résolution.

Research

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