Name: rigid embedding of fixed and stained, whole, millimeter-scale specimens for section-free 3d histology by micro-computed tomography
Uploaded: 2018-10-17T13:30:00
Duration: 7 min 41 s
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著者は、元の TEM プロトコルを提供する親切ローランド マイヤーズを感謝したいです。さらに、博士ジョン Colbourneミジンコ供試体を提供するため、ショウジョウバエの標本を提供する博士 Santhosh Girirajan と博士 Fadia カマル マウス胚を提供するために感謝したいと思います。捜査当局を NIH 資金認める (PI 1R24OD18559-01-A2: KCC)、癌研究と生命科学の PSU のハック所とサイバー サイエンス研究所からパイロット賞の資金からジェイク Gittlen 研究所。

生きている動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルベニア州立大学によって承認されました。
1. 1 日目: 固定
<ol><li>固定を改善し、消化管内容物の量を減らす、餓死 10 mm 試料 h 以上大きい標本の少なくとも 24 の稚魚 (e.g。、14 mm 供試体の 72 h)。</li>
	<li>事前チル 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) と 2 × Tricaine S (MS-222、400 mg/L) を 4 ° c の氷の上</li>
	<li>ダブル魚冷蔵 2 水量迅速かつ人道的な安楽死のため MS 222 x。</li>
	<li>30 を待つ 60 s (幼虫) s (稚魚)、魚の後の動きは止まります。</li>
	<li>冷蔵 10% で魚を浸す NBF 10 分。</li>
	<li>酒器常温で一晩冷蔵 10 %nbf ソリューションで魚を修正します。 注: 酒器は、供試体の曲げを最小限に抑える必要があります。定着剤量およびすべての後続のステップのソリューションは、特に指定しない限り、少なくとも 20 回サンプル ボリュームをする必要があります。1-5 幼虫ゼブラフィッシュの推奨される解決の容積は少なくとも 1 mL です。貧しい固定不十分な定着性結果と試薬分注量の黒字は、否定的記述されていたプロシージャの結果を影響しません。大きな魚の完全な固定のため少しアナル孔前方開始腹をスリットします。ハサミやナイフの最小限の浸透を使用し、内臓への損傷を最小限に削減しながら、魚から離れて穏やかな力を適用します。固定のプロトコルがされている31,32,33他記述されています。</li>
</ol>2. 2 日目: 脱水・染色
<ol><li>1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4 10 分 x 3 回固定標本をすすいでください。</li>
	<li>穏やかな攪拌と室温で 20 分間 35% エチルアルコール (エタノール) のサンプルが水没します。 注: すべての穏やかな攪拌ステップ卓上シェーカーを使用し、混合効果のバンプやコンテナー表面のサンプルのこすれを慎重に回避しながら。</li>
	<li>50% のサンプルを水没 EtOH 穏やかな攪拌と室温で 20 分間。</li>
	<li>リンタングステン酸 (PTA) 粉 1 %w/v のストック溶液を調製するために水に溶解します。</li>
	<li>3:7 で 100% 1 %pta 原液を希釈エタノール 0.3 %pta 染色液を取得します。</li>
	<li>穏やかな攪拌と室温で 0.3 %pta 液で一晩サンプルを染色します。</li>
</ol>3. 3 日目: 浸潤
<ol><li>100% エタノールと LR 白アクリル樹脂の 1:1 v/v の混合物を準備しておきます。</li>
	<li>すすぎ 3 回で 70% EtOH 10 分。</li>
	<li>90% のサンプルを水没 EtOH 穏やかな攪拌と室温で 30 分間。</li>
	<li>95% のサンプルを水没 EtOH 穏やかな攪拌と室温で 30 分間。</li>
	<li>100% で 2 回サンプルを水没 EtOH 穏やかな攪拌と室温で 30 分間。</li>
	<li>穏やかな攪拌と室温で一晩 1:1 エタノールと LR 白アクリル樹脂の混合のサンプルが水没します。</li>
</ol>4. 4 日目: 埋め込み
<ol><li>穏やかな攪拌と室温で 2 h の LR ホワイト樹脂 100% のサンプルが水没します。</li>
	<li>新鮮な 100 %lr 置き換えます手順 4.1 で樹脂樹脂を白し、穏やかな攪拌と室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>埋め込み装置 (図 1) を組み立てます。</li>
	<li>適切な直径と長さのポリイミド チューブをカットします。 注: 少なくとも 0.1 mm 供試体の直径より大きい内径のチューブをお勧めします。典型的な標本の各サンプルのチューブの 30 の mm の標準的な長さを使用します。必要に応じて、長いチューブを使用して細長い試料に対応できます。<ol>
<li>P1000 マイクロ ピペットを埋め込みアダプターのワイド端にアタッチし、ポリイミド チューブを狭いエンド (図 1) を挿入します。埋め込みのアダプターが利用できない場合は、4.3.3 のステップに移動します。そうでなければ、手順 4.4 続けます。</li>
		<li>ポリイミド チューブがぴったり収まるような真っすぐマイクロ ピペット チップの端をクリップします。0.0403"200 μ L 黄色マイクロ ピペット チップのワイド端から 44 mm でカット チューブと 0.105"1 mL ブルー チップの底から 59 mm チューブ。必要に応じてトリムします。</li>
		<li>マイクロ ピペットにカット マイクロ ピペット チップを取り付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>小さな重さのボートや V 字ソリューション盆地にサンプルを転送して 100% のサンプルを完全に水没 LR ホワイト樹脂。</li>
	<li>ステップ 4.3 から埋め込み装置、固定サンプル (または動物標本の場合頭に向かって) ワイド端チューブを目的し、チューブに試料をゆっくりピペットします。チューブの中にサンプルを置き、上と下の試料管は樹脂充填を確認します。<ol>
<li>ピペットのサンプル チューブにサンプルが自然、前方方向に移動。 注: 低速ピペッティング空気の泡とチューブのエッジに対して摩耗による試料損傷を回避できます。チューブに後方移動簡単に損傷四肢 (手足、翼、フィンなど) があります。後、空気が削除中にチューブを入らないように埋め込み装置のいくつかのガレージのオーバーフローを許可することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すぐにシールの石油ベースのソフト モデリング粘土で開放端。<ol>
<li>1 mm 厚のシート状に粘土を平らにします。</li>
		<li>人差し指と中指の間チューブを安定させます。</li>
		<li>ゆっくりと親指でチューブの終わりに対して粘土を押してください。</li>
		<li>余分な粘土を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロ ピペットから埋め込み装置を削除します。</li>
	<li>緩やかな回転により、チューブを抜くし、粘土でもう一方の端をシールします。<ol>
<li>粘土の放出を防ぐために、密封端に対して指を保持します。</li>
		<li>封印されていない管末を粘土にゆっくりと押し込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>管を置き水平 65 ° C で 24 h 用樹脂を重合と 注: 水平方向の配置は、重合中にサンプルの動きを回避します。空気の少量は、ステップ 4.8 に閉じ込められた、空気の泡と最後は試料に向かって空気泡の動きを防ぐために少し上がるかもしれない。重要なは、重合中にあまりにも多くの標高は、重力のためローエンドに向かって落ちるように標本を引き起こす可能性があります。正しく埋め込まれたサンプルは空気/樹脂インターフェイスから屈折率の低下を画質 (図 2) ために避けるべきである空気の泡を 1 つに比較されます。</li>
</ol>5. 5 日目: コレクション
<ol><li>日 5 の終わりに画像取得のためのサンプルを収集します。 注: 古河ポリイミド チューブの除去は可能ですが、画像については必要ありません。ゼブラフィッシュ サンプルの放射光マイクロ CT イメージングは、ビームライン 2 BM で高度な光子ソース (AP) のアルゴンヌ国立研究所 (レモント、イリノイ州、アメリカ合衆国) で行われました。PTA 染色ゼブラフィッシュの 5-30 keV の最適な x 線エネルギー範囲が決定され、13.8 の x 線エネルギー keV に使用された画像。1501 予測は 13.8 で得られた keV 以上 180 度 (1 投影 0.12 度ごと) 2048 で 2048 ピクセル カメラ。さらに、2 つのフラット フィールド (利得) 画像 (初めに 1 つ)、買収の端に 1 つと 1 つの暗視野画像も取得しました。フラット フィールドと暗視野の修正、リング アーチファクト低減、画像再構成が行われた TomoPy ツールキット34をソースを開くを使用します。X 線顕微鏡12,35PTA 染色のミジンコとショウジョウバエのサンプルをイメージしました。特定のマイクロ CT の設定、オブジェクト、汚れの質に依存します。例えば、ショウジョウバエの標本は 40 kVp、74 でスキャンされた mA、および 15 3.10 × 3.10 × 3.10 μ m3のボクセル解像度で s。</li>
</ol>

<ol>
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すべての作成者は、利害の衝突がないことを宣言します。

本稿では、マイクロ CT イメージング用 (0.5 から 2.5 mm 径) 標本固定と染色ミリ スケールの剛体の固定化のための詳しいプロトコルを提案します。解像度と速度に関してマイクロ CT 技術の急速な進歩を考えると、再イメージング機能を持つ恒久的なサンプル保存の方法は、非常に望ましいです。伝統的に、超薄切片を切り、試料へのダメージを最小限に抑えるために構造サポートを提供するために、密な埋め込み樹脂が電子顕微鏡でに使用されます。本手法は適応非破壊イメージング中に剛体の固定化のための使用です。余分な樹脂の存在から画像アーチファクトを最小限にするには、x 線透明ポリイミド チューブ サンプルの周りの樹脂量を制限して、エッジのないラウンドのサンプルを作成するの使用を実施いたします。
埋め込みの手順の最適な結果のいくつかの重要なステップとサンプル プロシージャ全体で整合性に注意慎重に実行に依存しています。確かに、供試体の損傷は、イメージングの実行の成功に関係なく危険にさらされた最終的なイメージになります。痛みの反応の減少に貢献する低温未固定組織が高温でより急速に低下するので、我々 は中古冷蔵試薬を使用します。大規模な標本は、肝、膵、腸などの内臓は完全に固定して試料の内部に定着剤のエントリを許可するようにカットする必要があります。固定されていない組織は、悪化し、生物学的構造を破壊する構造の健全性を失います。もう一つの重要なステップは、その自然な配置で供試体を維持することです。したがって、プロシージャと固定の間に特に重要なは全体を用いて平底の容器の使用を主張します。固定ポリプロピレン チューブまたは V 字の底を持っている通常の円錐管避けなければならない原因を曲げないように、細長いサンプル標本の自然な形態を歪められて。さらに、樹脂の使用を最小限に抑えるため古河ポリイミド チューブの内径は試料の幅よりわずかに大きいだけ。供試体の曲げでも、損傷試料管に入ってきた。また、管に有害な四肢を避けるために自然な前方方法で供試体を転送することをお勧めします。適切な脱水は、別の重要なステップです。ゆっくりより樹脂混和性であるエタノールと水を交換するエタノール濃度の増加の小さな単位で行われます。エタノール濃度の大きな増加は組織収縮に関連付けられ、江藤潜伏移行をより緩やかにするための追加の単位によって改善することができます。最後に、いずれかがある場合、試料または空気のポケットの動きを最小限に抑えるサンプル時は配置された水平樹脂重合 (第 4 日終了)。空気のポケットまたは標本の横にあるシール エッジ回折、画像品質を下げることに関連付けられている x 線イメージングと光のアーティファクトが発生します。
プロトコル、その他の埋め込み樹脂および金属に可能な修正に関して汚れそれぞれ LR ホワイト アクリル、PTA、代わりに使用することができます。Embed812、電子顕微鏡でよく使用されるエポキシ樹脂は高粘度、転送が難しく、試験片の歪みが生じる、アクリルまたはリコールのメタクリル樹脂よりも高いバック グラウンドに関連付けられています。JB4 プラス、グリコール メタクリル酸 EMbed812 よりも粘性が低くより低い背景には、空気のポケットのランダムな形成は試料近傍よく表示されます。前述のように、空気のポケットは画像品質が低下して、貴重なサンプルのため特に問題となります。それは最終的なイメージで貧しいコントラストをもたらす PTA 染色と干渉する Technovit 7100、メタクリル酸グリコール別、注目に値するです。比較的、LR ホワイト アクリルは水のような粘度、低バック グラウンド、PTA 染色と干渉しません。私たちの手で LR ホワイト サンプル損傷や気泡のない埋め込みの成功率は 95% 以上です。これらの理由から、我々 は組織のマイクロ CT の埋め込み樹脂として使用を提唱します。汚れに関して様々 な金属の結果ヨウ素、四酸化オスミウムなど汚れとマイクロ CT イメージングで PTA に比べて、他の場所で説明した15,16,17をされており、この範囲外は原稿。
サンプル サイズは、私たちの現在のプロトコルの主要な制限です。チューブに試料を転送するための吸引を用いて、供試体を見る能力オリエンテーションと確かにチューブであることを確保するため非常に重要です。結果として、クマムシなどサンプルのサブミリ (すなわち。、水クマ) 顕微鏡可視化することが要求されるので、埋め込むことは非常に困難です。吸引を適用すると、顕微鏡標本は焦点面から簡単に失われ、彼らはチューブの添付の終わりまであまり渡されるかどうかを決定するが難しく、再発見するに困難になります。マウス胚、(3-10 mm) などの大きなサンプル (図 4) プロトコルを埋め込むにわずかな変更で埋め込むことができます。特に、ポリイミド チューブは、1/3 埋め込む前に重合した液体の樹脂に満ちていた。固定と染色のサンプルは、事前重合樹脂の上に置かれました。チューブが完全に非重合樹脂を充填、2 番目の重合後に。
プロトコルを埋め込む、性は多様です。堅く固定化全体の動物や組織標本などの理由で望ましい: (1) 生成や準備が難しいサンプルの長期的なリポジトリの作成(2) データの再取得(3) シリアル複数の画像形式を使用してイメージングを有効にします。校正および技術開発のため (4) 基準。サンプルの埋め込み手順と準備は損傷に対して弾力性のある固体樹脂を包んだ、したがって簡単に保存できますおそらく無期限に。長期保管は稀または苦心して生成された標本フェノーム プロジェクトに関連付けられているなどの場合に特に便利です。さらに、デジタル データが失われた場合に、データは元のサンプルから生成できます。可能性のある長い期間にわたって再イメージングの能力は同じサンプルで尋問を画像診断、将来的に高度なことができます。サンプルがイメージング インスタンス間物理的に安定しているので、画像は以前とそれ以降のデータ セット間の登録を促進する、同じ方向に同じ標本から取得されます。たとえば、低解像度の画像がゼブラフィッシュ幼虫組織の分割に限定します。同じ幼虫は、携帯電話の解像度で計算解析の詳細に高い解像度で再イメージング後することができます。登録スキャン間の直接比較のためこの機能は、潜在的なマイクロ ct 技術開発のための標準として樹脂包埋試料を示唆しています。サンプルの準備のステップですべての変数を制御して、同一試料のイメージングによるイメージング法に変更の影響を評価できます。最後に、測定器の校正の場合、イメージングの一貫性をテストする樹脂に埋め込まれた標準的なサンプルを使用できます。
筆者らは突然変異と病気の魚組織を調べることを示した携帯電話の解像度が、解剖顕微鏡36、または低消費電力を使用して総検査で見落とされる組織構造の微妙な異常の検出を可能ステレオの顕微鏡。人間のサンプルを当社の高分解能解析を展開したいです。開発事業の主な対象を構成する、ゼブラフィッシュの幼虫は、脆弱性、細胞、細胞間の組織の不均一性、サイズ (直径 1-3 mm)、細長い形状でひと針生検に似ています。ゼブラフィッシュ、低い解像度37でとはいえそのマイクロ CT が正常に染色し、ヒト組織をスキャンを示す他の仕事と当社の豊富な経験に基づき、イメージングや針生検の解析に付加価値をもたらすための私たちのアプローチを見込んでいます。我々 と推定している 30 ドルよりも少ない可能性があります同じ条件の最大 20 のサンプルの 1 つの準備のため十分なキットのアセンブリ。物理的な損傷に耐性のため運搬しやすい埋め込み手法により作製したサンプル。低コストと輸送の容易さは特にエリア細胞分解能マイクロ CT 観察が容易にアクセス可能ではないの世界中からサンプルのコレクションの可能性を示唆します。私たちのビジョンは、針生検 (0.1 から数テラバイトまで) の高解像度デジタル ・ ファイル ヒト組織のデジタル地図の作成を有効にすると同時に改良、現在解析パイプラインを強化して研究者を許可します。ローカリゼーションとフル 3 D スキャン組織のコンテキスト内での細胞およびティッシュのアーキテクチャの定量的な特徴づけ。

表現型は、その遺伝的背景と環境のユニークな相互作用の結果を表す生物の観察可能な特徴です。これらの特徴は、行動、生化学的、形態学的、発達、および生理学的プロパティを含めることができます。重要なは、野生型生物と遺伝的変異の形質の違いは重要な洞察のメカニズムと影響を受けた遺伝子の機能を提供できます。形態、病理学的細胞レベルでの表現型を評価するためのゴールド スタンダードですが、苦しんでいる機械的な人工物および正確な定量容積測定分析1を許可しません。当研究室は、組織の診断力のサブミクロン分解能における組織ボリュームへの応用への障壁を克服するために。
利用可能な技術の調査では、x 線によるイメージング マイクロ-計算するマイクロ ct はミリ スケール全体動物 3 次元 (3 D) 組織学に必要な理想的な機能を提供することが示唆しています。マイクロ CT 非破壊、等方性、3 D の可視化と組織アーキテクチャ1,2の定量分析を行うことができます。近年、マイクロ CT を用いた金属染色無染色しゼブラフィッシュの 3 D イメージング増加トラクションを得ており、脂肪組織、骨、歯筋3,4 を含むいくつかの組織の容量分析用に利用されています。 ,5,6,7,8,9,10。他のモデル有機体および組織標本はマイクロ CT 画像に適しています。例えば、パイプラインはマウス脳放射光マイクロ CT11を介してイメージの密なメソスケールの神経解剖学を定量化するために導入されています。同様に、エオシン ベースの汚損のプロトコルは、全体マウス臓器12の軟部組織のマイクロ CT イメージングのために適していることが示されています。無染色人間 L3 椎体の形態計測学的解析とマイクロ CT を用いたひと肺の銀染色の可視化は、人間の技術の実用サンプル13,14を実証しています。
そのまま小動物や組織標本の完全な形態学的表現型解析のためのマイクロ CT の偉大な約束を実現するためにハードルの数がスループット、解像度、視野の染色、包括的なセルに関連して克服しなければなりません。長期保存。これらの各側面は非常に重要ですが、本稿の焦点、サンプル固定および汚損に関する追加のノートでの埋め込み手順の最適化です。重金属染色は、軟部組織の異なるマイクロ CT 画像間固有のコントラストが低いので便利です。四酸化オスミウム、ヨウ素、リンタングステン酸 (PTA)、gallocyanin chromalum など、様々 な金属の効力が汚れ、マイクロ CT 画像のコントラストを高めるため勉強15,16,17をされています。酢酸ウランは、骨と軟骨の18,19のマイクロ CT イメージングのための対照的なエージェントとして使用されています。PTA 私たちプロトコルで使用され、ほぼすべての組織の一貫性のある染色につながるイメージを降伏全体ゼブラフィッシュ標本における細胞、組織のボリュームを全体を通じて、組織のような研究と潜在的に互換性。
2 次元 (2 D) 投影マイクロ CT 画像集録中にサンプルがある程度の割合で回転を取られ、サンプルが投影用の何千ものシリーズを生成する、180 ° または 360 ° 回転を完了するまでを繰り返し、3 D ボリューム20の再建。この過程で、試料の任意摂動は、ずれて、不十分な再建された 3 D ボリュームで対応する 2D プロジェクションになります。この問題を修正する方法であり、いくつかの現在の戦略を含むアルコールのサンプルを水没またはポリプロピレン チューブやマイクロ ピペットのヒント3,5,15, agarose の埋め込みサンプル固定16,21,22. 画像集録中にサンプルを移動イメージングの 3 D ボリューム23のシフトの再構成の結果として発生するため液浸方法は理想的ではありません。さらに、液体貯蔵組織試料の物理的安定性は化学的不安定性と試料と容器壁 (間接点の動きに関連付けられている表面の摩耗の結果として、年に数ヶ月の時間スケールで貧しいことが知られています。固定の動物および人間のティッシュのサンプルと個人的な観察)。
イメージング中にサンプルを移動の可能性を減らすため、サンプルは agarose24,25,26, で埋め込むことができますが、これは汚れ画像を減らすアガロースに拡散のリスクと関連26をは対照的します。さらに、液体または agarose の準備は物理的な損傷に傾向があり時間の経過と共に低下する、サンプルの長期保存には不向き。我々 は潜在的成功と簡単なサンプルの固定法が電子顕微鏡標本で使用する合わせることができることを推論します。EPON 812 (中止し、埋め込む 812 に置き換え) など重合樹脂は、超薄切片電顕27,28を生成に必要な硬さを提供するために使用されます。確かに、いくつかの比較研究 x 線イメージング、電子顕微鏡は、樹脂に埋め込まれたサンプル x 線顕微鏡29,30によって視覚化されることを実証しています。しかし、電子顕微鏡の標準的なプラクティスのいくつかはマイクロ CT 画像に直接変換はできません。たとえば、マイクロ CT イメージングによる試料の乗典型的な樹脂ブロックの樹脂エッジとこれらのブロックからカット サンプルは画像に干渉することができますエッジ回折の成果物に関連付けられています。可能であれば中の樹脂エッジを平滑化は面倒で時間がかかるです。
さまざまな埋め込み樹脂は、電子顕微鏡で採用されて、難しく樹脂埋め込む 812 などに関連付けられている高いバック グラウンドつながって私たちは他のものをテストします。低粘度、低収縮、低気泡を形成傾向のため低バック グラウンドと重合中に LR ホワイトを選びました。エッジ無料サンプルを作成し、サンプルを囲む樹脂の量を最小限に抑えるため、重合前にポリイミド チューブに液体樹脂標本を描画するプロトコルを開発しました。ポリイミドは、そのチューブの除去は撮影に必要なないので高い熱安定性、x 線透過率が高いため選ばれました。最後に、我々 は確実に管を保持し、マイクロ ピペットの汚染を防止するために技術を埋め込むサンプルのカスタム マイクロ ピペット アダプターを設計しました。アダプターには、3 D CAD イメージ ファイルから印刷をすることができます。一緒に取られて、ここで示したサンプル調製法の目的より簡単な小さな試料の埋め込みを実現する拡張コントラスト、剛体の固定化とそのままミリ スケール標本の長期保存の染色です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X Neutral buffered formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotunstic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK282402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-S (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide tubing (ID 0.04&#34;)</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>141-0065</td>
			<td>The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based soft modeling clay</td>
			<td>Sculpey</td>
			<td>S302 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66015-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-shaped basin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L yellow micropipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL blue micropipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>M71735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CoolSNAP HQ2 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Xradia 520 Versa</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rigid embedding of fixed and stained, whole, millimeter-scale specimens for section-free 3d histology by micro-computed tomography

100 年以上にわたって組織の組織学的研究は組織を発見し、特徴付けられるすべての組織ですべての細胞型を可能にするため医療診断のゴールド スタンダードをされています。私たちの研究室は x 線マイクロ-コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) 携帯電話の解像度でフル組織ボリュームの研究組織の診断力をもたらす技術の進歩を積極的に取り組んで (すなわち、x 線。Histo-tomography モダリティ)。この終わりの方は、サンプル準備のパイプラインに対し的確な改善をしました。1 つのキーの最適化と現在の仕事の焦点は、固定と染色ミリ スケール サンプルの剛体を埋め込むため簡単な方法です。公開されているサンプルの固定化と相関のマイクロ CT イメージング法の多くは、パラフィン ワックス、アガロース、またはアルコールなどの液体のサンプルを配置するのに依存します。我々 のアプローチは、カスタム プロシージャと x 線に比較的透明なアクリル樹脂のチューブ、ポリイミドに直接サンプルを埋め込むに 3 次元印刷装置の設計でこの動作を拡張します。試料調製方法は全体のゼブラフィッシュ仔と稚魚、または他の動物のために適している、直径 10 mm の 0.5 からサンプルと似たような寸法の組織サンプルの記載が。概念の証拠として、我々 は、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、ミジンコマウス胚の採取が埋め込まれています。これらのサンプルの 3 つの 3 次元スキャンから代表的なイメージが表示されます。重要なは、我々 の方法論は、剛体の固定化、苦心して作成のリソースの長期的な保全と再サンプルを調査する能力を含む複数の利点につながります。

プロトコルは上記詳細全体ゼブラフィッシュ幼虫のサンプル調製法とマイクロ CT イメージングの稚魚。特に、このメソッドは、他のサンプルの種類にすぐに適応 (e.g。、ショウジョウバエ、ミジンコ、シロイヌナズナ、マウスの臓器)。さまざまなステップのインキュベーション時間がゼブラフィッシュの幼虫と同じようなサイズのサンプルの適切です大きいサンプルは長いインキュベーションを必要があります。手順を埋め込むサンプルを支援するためには、1 mL ピペットにアタッチされ、ポリイミド チューブ (図 1) の様々 なサイズのカスタマイズすることができますアダプターを設計されています。このカスタム アダプターは、3 D はこの原稿を関連付け、http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ からダウンロード可能な CAD ファイルから印刷だったです。すべての読者が 3 D プリンターへのアクセスを持っていないので、ピペットの先端を使用して自家製埋め込み装置のアセンブリはプロトコル (手順 4.3) の説明です。正常に埋め込まれたゼブラフィッシュ幼虫は空気泡 (図 2)、画像の品質を低下する可能性が高い試料に比較されます。埋め込みのプロシージャの多様性を示すためには、種々 のモデル生物から標本を表示 (すなわち、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、ミジンコ、マウス胚)、サンプル準備のパイプライン (を通り抜けてきた。図 3)。マイクロ CT による撮像全体のダニオミジンコ、ショウジョウバエの標本の再構築した 3 D ボリュームには、(図 4) が表示されます。重要なは、ダニオのサンプルで示されているように、これらの標本を長期間保存し、複数イメージング セッション (図 5) で再利用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig1.jpg"> 図 1。装置の埋め込み。(A) アダプターは、埋め込みの共通の実験室のツールを使用して容易にするために設計されました。(アダプターの B) の断面図です。(C) (a) アダプターの時点で古河ポリイミド チューブの挿入後装置を埋め込みしてアダプター時点 (c) マイクロ ピペットをアタッチします。アダプター セグメント (b) は、余分な樹脂に対応し、マイクロ ピペットを汚染から保護するように設計オーバーフロー チャンバーです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig2.jpg"> 図 2。正常に埋め込まれた標本は、空気の泡を欠いて。(A) 埋め込まれた 3 日後受精 (dpf) ゼブラフィッシュ稚魚気泡なし。(気泡と B) の埋め込み 3 dpf のゼブラフィッシュ。サンプルは重合中に水平方向に配置されていない場合、埋め込みプロセスの中に閉じ込められた空気が試料に向かって前進できます。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig3.jpg"> 図 3。我々 のプロトコルとさまざまな試料を埋め込むことができます。(A) 7 dpf ゼブラフィッシュの幼虫。(B) 大人のショウジョウバエ。(C) 大人のミジンコ。(D) マウス胚。マウス胚などの大きいサンプルは、プロトコルのいくつかの変更によって収容されます。簡単に、ポリイミド チューブはその長さの 3 分の 1 に樹脂を充填し、埋め込む前に重合。固定と染色のサンプルは、事前重合樹脂の上に置かれました。チューブは、2 番目の重合後非重合樹脂に満ちていた。ポリイミド チューブは、この図では、サンプルのより良い視覚化できるように写真撮影前に削除されました。チューブの取り外すマイクロ CT スケール バーで成功イメージ獲得のため必要はありません: 標本画像、5 mm;インセット、1 mm. を拡大<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig4.jpg"> 図 4 埋め込まれた標本の 3 次元レンダリングします。 。(A) 3 の dpf ゼブラフィッシュ幼虫 0.743 × 0.743 × 0.743 μ m3ボクセル解像度で再構築。(B) 大人ミジンコ(3 × 3 × 3 μ m3ボクセル解像度) を再構築します。(C) 大人のショウジョウバエ(3.1 × 3.1 × 3.1 μ m3ボクセル解像度) を再構築します。デジタルの断面は、左の列に示すように、任意の角度で生成できます。表面のレンダリングは、右側に示されている商用ソフトウェアを使用してレンダリングされます。サンプルの外部のすべてのスキャンに見られる樹脂を埋め込み (注意 *)、サンプル自体を妨げることはありません。ゼブラフィッシュの幼虫は、アルゴンヌ国立研究所放射光科学基づいている高度な光子源でイメージしました。ミジンコやショウジョウバエの標本は、商業の x 線顕微鏡をイメージしました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig5.jpg"> 図 5。我々 のプロトコルに埋め込まれたサンプルはマイクロ CT を再イメージ化することができます同じ 5 dpf ゼブラフィッシュ幼虫 2011 (A) と (B) 2013 年、矢状ビューの平均強度突起として提示をイメージしました。スキャン ストレージは、解剖学的特徴の保存を示しています後の画像比較です。(D) 強度プロファイルの生成に使用される対応する領域を示す分割線両方のスキャンから筋肉の (C) クローズ アップが表示されます。両方の線に沿っての対応する平均を正規化輝度プロファイル表示空間両方のスキャンのローカル ピークと一致します。(E) A で選択した領域の輝度値の平均と神経核 (N, 緑) バック グラウンド (Bg、紫) に属する B、白質 (W、青) と (M, オレンジ) 筋肉が背景 (白) の平均で割った値し信号のノイズを生成するために使用比 (SNR)、スキャンの間にうまく対応します。スケール バー = 100 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

プロトコルを開発し、ミリ波スケール試料の埋め込みを有効化するカスタム装置を設計されています。アクリル樹脂、ポリイミドのマイクロ CT による剛体の固定化と組織アーキテクチャおよび細胞形態の尋問のための標本の長期保存を実現するためにチューブを埋め込むことに重点を置いたサンプル準備手順を提案します。

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

この方法により、小さなモデル生物を含む小さいミリメートルスケールのサンプルから3次元の組織学的画像を生成することができます。この手法の主な利点は、組み込みサンプルが非常に安定しており、サンプルを長期間保持し、それらを複数回画像化できるようにすることです。この方法の出力は、高スループットモデルシステムフェノミクス、毒物学、さらにはヒト組織診断にも非常に有用です。一般的に、この方法に新しい個人は、サンプルが比較的小さく、配向または操縦が困難であるため、苦労します。サンプルの損傷を避けるために注意が必要であるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。若年性または古いゼブラフィッシュの場合は、固定前に腸の含有量の量を減らすために、少なくとも24時間飢えさせる。10%中性バッファーホルマリンまたはNBFと2xトリケーヌ-Sを氷の上に4°Cに予め冷やします。急速かつ人道的な安楽死のために冷やされた2倍のMS-222で魚の水量を倍増します。魚が動かなくなった60秒後、人道的安楽死の後、魚を室温で平底ガラスバイアルに冷やした10%NBF溶液に入れ、一晩固定する。2日目には、1x PBS pH 7.4で固定魚片をそれぞれ10分間3回すすいでください。洗浄後、35%エタノールにサンプルを水没させ、穏やかな攪拌で室温で20分間インキュベートします。その後、このステップを50%エタノールで繰り返します。サンプルを調製したばかりの0.3%ホスホトゥングステン酸またはPTA溶液を室温で一晩、穏やかな攪拌でインキュベートして染色します。3日目は、100%エタノールとLR白色アクリル樹脂の1対1の体積ごとの混合物を調製して開始します。サンプルを70%エタノールでそれぞれ10分間3回リンスし、室温で90%エタノールでサンプルを穏やかな攪拌で30分間インキュベートします。同じ条件でインキュベーションを繰り返しますが、95%エタノールを、さらに2回100%エタノールで繰り返します。最後に、1対1のエタノールとLR白色アクリル樹脂混合物にサンプルを水没させ、穏やかな攪拌で一晩室温でインキュベートする。4日目に、バイアルから混合物を取り出し、サンプルを水没させるために100%LR白色樹脂を加える。穏やかな攪拌で室温で2時間インキュベートします。2時間後、フレッシュ100%LR白樹脂で樹脂を交換し、穏やかな攪拌で室温で1時間インキュベートします。埋め込み装置を組み立てるには、試料の直径より少なくとも0.1ミリメートル大きいポリMIチューブを使用し、標準長30ミリメートルに切断する。次に、P1000 マイクロパイプヘッドを埋め込みアダプタの白い端に取り付け、ポリ MI チューブをその狭い端に挿入します。サンプルを100%LR白樹脂で1時間インキュベートした後、小さな重量を量るボートに移し、100%LR白樹脂に完全に沈めます。固定サンプルの広い端で埋め込み装置のチューブを目指し、または頭部に向かって、試験体をチューブにゆっくりと配管に配管する。サンプルをチューブの中央に配置し、標本の上下のチューブが樹脂で満たされていることを確認します。その直後に、チューブの開いた端を密封し、油性軟調なモデリング粘土を厚さ約1ミリメートルのシートに平らにし、人差し指と中指の間の管を安定させる。その後、ゆっくりと親指でチューブの端に粘土を押し付け、余分な粘土を取り除きます。マイクロパイプヘッドから埋め込み装置を取り外します。優しい回転でチューブを引き出します。粘土の噴出を防ぐために密閉された端に指を持ちながら、密閉されていないチューブの端をゆっくりと粘土に押し込み、もう一方の端を密封します。チューブラックの上にチューブを水平に置き、樹脂をオーブンで摂氏65度で24時間重合させます。翌日の終わりに、画像取得用のサンプルを収集します。正常に埋め込まれたゼブラフィッシュの幼虫は、閉じ込められた気泡を持っていません。埋め込みプロセス中に空気が閉じ込められた場合、重合中にサンプルが水平に配置されないと、試料に向かって移動し、画質が低下する可能性があります。このプロトコルは、様々なモデル生物を埋め込むことに成功しました。例えばゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、ダフニア、マウス胚など。成功した埋め込みは、ゼブラフィッシュ、ダフニア、ショウジョウバエのマイクロCTスキャンで画像化された再構築された3Dレンダリングで示すことができます。埋め込み樹脂は、サンプル外のすべてのスキャンで見ることができますが、サンプル自体に干渉しません。これらの標本は、2011年に画像化されたゼブラフィッシュ幼虫で示すように、長期間保存し、複数のイメージングセッションに再利用することができます。そして2013年に再び。解剖学的特徴は両方のスキャンからの筋肉のクローズアップで見られるように、貯蔵の後に保存される。さらに、強度プロファイルは、セグメント化された線に沿って対応する平均に正規化され、両方のスキャンで空間的に一致する局所ピークを示す。両方のスキャンで選択した領域の平均強度値をバックグラウンドの平均で割り、スキャン間でうまく一致する信号対雑音比を生成するために使用されました。この方法を試みている間、サンプルの損傷を避け、気泡の導入を防ぐために慎重に働くために穏やかに働くことを重要です。この手順に従って、蛋白質発現のパターンを研究したり、2Dで関心領域の分解能を高くするために、構造学や電子顕微鏡などの他の方法を用いることができる。私たちの希望は、この出版物は、あなたが高解像度の組織マイクロCTの力にアクセスするのに役立つことを願っています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

全肝臓の細胞化とRecellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

灌流固定標本のコントラストコンピュータ断層撮影を用いた人間の心臓静脈系の解剖学的再建

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

生体溶解性接着剤で取り付けられている硬質補強材を用いた柔軟神経プローブの挿入

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

海綿骨の機械的性質を測定するためミリ スケール曲げテスト システム

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

強制的に垂直 V ベンドとシステム: 弾性体と剛体の長方形型の 3 Dの in Vitro評価

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

剛体の埋め込み固定し、ステンドグラス、全体、マイクロコンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本