Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

ونعترف Yawata شيومي واللجنة Owa للمساعدة التقنية من خلال الدراسات الأولية. تم دعم هذه الدراسة نيس/المعاهد الوطنية للصحة منح R01 ES023316 و R21ES024861 للملخص، ومنحة مضيفات معهد البحوث الطبية (فامري) إلى جه.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

إنتاج قوي من هبجكلكس استخدام بروتوكول الموصوفة هنا تأكدت باستنساخ المستقل ثلاثة من إيبسكس البشرية مع تناذر ضعفاني العادية10. استنساخ هذه اللجنة التوجيهية مستمدة من نفس جلد الإنسان عن طريق الجلد الولدان تنتجها الخلايا الليفية خلية الثقافة10. أنها ستقدم مؤلفين من هذه المادة إلى المحققين بناء على طلبها وفي إطار اتفاق نقل المواد الملائمة والشحن ترتيب الخلايا البشرية الحية المجمدة. من غير المعروف حاليا ما إذا كان تناذر العادية المطلوبة لإنتاج هبجكلك قوية باستخدام بروتوكول لدينا أو تلك التي أبلغ عنها بغيرها من المختبرات.
وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن إنتاج هبجكلكس من هيبسكس11 أو بتوليدا14 استخدام بروتوكول وصف سيتو للفريق التابع لجامعة كيوتو8 مرهون بالتعبير عن اوميسوديرمين، تي-مربع عامل نسخ المطلوبة تحريض SOX17. ويبدو SOX17 تعمل كنسب رئيسية تحديد عامل النسخ في germline تمايز الخلايا الجذعية pluripotent البشرية6. يتم ترميز اوميسوديرمين بالجينات اومس ، وخروج المغلوب كريسبر/Cas9 من اومس تسبب غياب شبه كامل لتحريض SOX17 في هبجكلك المنتجة للشرط11، والتعبير عن جينات أخرى تتبع نفس النمط من خلايا فارغة SOX17 بالضربة القاضية. أوفيريكسبريسيون اوميسوديرمين من متجه إيندوسيبلي في اوميس--إنقاذ خلايا فارغة بالضربة القاضية خلال الثقافة التعريفي هبجكلك كفاءة الإنتاج هبجكلك قوية فضلا عن تحريض الجينات الخط، بما في ذلك SOX17. وفي المقابل، أنقذ المستحث أوفيريكسبريشن SOX17 أيضا إنتاج بجكلك قوية ولكن دون حمل اومس. وهكذا، اوميسوديرمين محفز المراحل الأولى حرجة من SOX17، ويبدو أن هذا أهم دور واحد من اوميسوديرمين في تحريض هبجكلك من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية. لدينا بروتوكول يدفع SOX17 في هيبسكس10، ولكن اعتماده على الاستقراء اوميسوديرميني ينتظر أن يتحدد.
يحول هذا البروتوكول بلوريبوتينسي معبي إيبسكس البشرية الحفاظ على المتوسط mTeSR1 بلوريبوتينسي السذاجة إيرك مستقلة لمدة 96 ساعة في 4i إعادة برمجة متوسطة6، الذي هو بالسذاجة تعديل خلايا الجذعية بشرية متوسطة (نهسم)5. محاولاتنا لتوليد هبجكلكس بدءاً من استنساخ البشر اللجنة التوجيهية نفس ولكن الاحتفاظ بها في غيرها من وسائط النمو اللجنة التوجيهية البشرية المتاحة تجارياً قبل الثقافة في 4i إعادة برمجة المتوسطة أدى إلى تدني هبجكلك المحاصيل بدرجات متفاوتة. على الرغم من أن تحدد ما إذا كان يحسن إنتاج هبجكلك التكيف الأطول أجلاً في وسائل الإعلام الأخرى أو لا يبقى في الدراسات المستقبلية، وهذه الملاحظة تشير إلى أن الدولة الدقيق من بلوريبوتينسي معبي من إيبسكس البشرية قبل 4i إلى حد كبير في إعادة برمجة آثار تشكيل المجلس التنفيذي في المتوسط 4i والتمايز EB في المتوسط هبجكلك.
إنتاج هبجكلكس من هيبسكس بعد أن البروتوكول قوية وعالية استنساخه، جزئيا نتيجة لاستخدام لوحات ميكروويل التي تمكن الإنتاج الفعال لعدد كبير من EBs (~ 8,000 الحديدية كل دفعة) مع حجم موحد (هيبسكس 3,000 الواحدة EB). قد يكون عدد الحديدية سهولة إنتاجها في دفعة واحدة من التجربة باستخدام بروتوكول لدينا أكبر بكثير من أساليب استخدام الآبار ثقافة الخلية أسفل يو العادية. إنتاج عدد كبير من نفس القدر من الحجم الحديدية المرصعة موحد مع هبجكلكس قد توفر فرصاً فريدة للفحوص الكيميائية الفائق لتحديد وسائل تفعيل صغيرة الوزن الجزيئي أو الموانع التي تؤثر على مواصفات PGC أو بهم الخصائص البيولوجية مثل إعادة برمجة جينية. هذه الحديدية قد تكون مفيدة لتقييم السمية عدد كبير من germline سميات الخلية، بما في ذلك الملوثات البيئية بل والأدوية الموصوفة طبيا أيضا مثل وكلاء العلاج الكيميائي أيضا.
وتشمل العوامل الحاسمة لإنتاج قوية واستنساخه من هبجكلكس استخدام بروتوكول قدم (ط) استخدام هيبسكس صحية الاحتفاظ بها في mTeSR1 على البروتين المصفوفة خارج الخلية، (الثاني) لتطعيم العدد الدقيق للخلايا كما هو محدد وصارم اتبع أوقات التغير المتوسط وثقافة فرعية، (ثالثا) لتحديد الكثير جيدة BMP4 الماشوب البشري، و (رابعا) لتقليل الأضرار الجسدية للحديدية خلال ثقافة هزاز. فمن خلال تجربتنا التي عملت الكثير أفضل من كاشف BMP4 100 نانوغرام/مليلتر تركيز بينما الأخرى الكثير من الكواشف BMP4 المطلوب 2 X أو جرعات أكبر. العائد من هبجكلكس استخدام الإنتاج الكثير أفضل من BMP4 بدلاً من ذلك انخفضت في جرعات أعلى من BMP4 من ناحية أخرى (مثلاً 200 نانوغرام/ملليلتر). نوصي باختبار عدة الكثير مختلفة من المؤتلف الكواشف BMP4 البشرية التي تم الحصول عليها من بائعين متعددين لأدائها في دعم جيل هبجكلك وتأمين كمية كبيرة من الكثير أفضل.
ميزة فريدة من نوعها لدينا بروتوكول هبجكلك أن يتم ترجمة هبجكلكس على الطبقة السطحية الأبعد الحديدية10 (الشكل 8)، بينما يمكن أن تولد البروتوكولات الأخرى هبجكلكس في منتصف الخلية المجاميع6،8. الهيئات امبريويد تميل إلى تكوين طبقات متميزة متعددة مثل السطح والغلاف الخارجي وشل الداخلية والأساسية، وغالباً ما تكون المناطق الأساسية المركزية نخرية نظراً لمحدودية العرض من المغذيات والأوكسجين، فضلا عن الباقين على قيد الحياة للمحترفين عوامل النمو قدمت نموذج ثقافة المتوسطة بنشر20. قد يكون من المفيد للتعرض المباشر، تسيطر عليها الوقت والجرعة من هبجكلكس للأدوية أو المواد السامة لتعريب هبجكلكس على سطح الحديدية دون قيود ممكنة نظراً لمحدودية نشر نحو مركز الحديدية الدوائية أو الدراسات السمية.
بينما التحكم الماوس بجكلكس إظهار قوية على نطاق الجينوم الحمض النووي ديميثيلاتيون المتعلقة الطباعة المناطق جزئيا على الأقل7،،من1920درجة demethylation جدنا العالمية في هبجكلكس يبدو أضعف من الماوس بجكلكس أو بجكس6،7. ترانسكريبتومال الملامح تشير إلى أن هبجكلكس قد تتشابه في مرحلة مبكرة من بجكس الجنينية من الماوس بجكلكس10. وذكر أن ثقافة الحديدية تحت ظروف الإنتاج هبجكلك طويلة بسبب درجة زيادة من جدنا demethylation7؛ ومع ذلك، ما إذا كانت فترة ممتدة من ثقافة هبجكلكس الحديدية أو كخلايا معزولة يمكن تحقيق المراحل الأكثر تقدما من التمايز germline يحتاج إلى تحددها الدراسات المستقبلية.

الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة لكافة الخلايا germline في كلا الجنسين. قد تم الحصول على معظم معارفنا حول التنمية بجكس في أجنة الثدييات من خلال دراسة المختبر الفئران1،2. في يوم الجنينية 6.0-6.5 أجنة الفأر، تقع إعداد صغيرة 6 أو ما شابه ذلك من السلائف PGC في ابيبلاست، وعدد سكانها المؤسسين ~ 40 هي التي يسببها بجكس منها بطريقة تعتمد على البروتينات مورفوجينيتيك العظام Bmp2 و Bmp4 ويفرز من المتاخمة الخلايا. وكانت بجكس البشرية أقرب المحددة حتى الآن في الأجنة على الجدار اندوديرمال من كيس الصفار في حوالي نهاية الأسبوع الثالث من الحمل3. لأن هذا هو نفس المكان كما لوحظت بجكس المهاجرة في الأجنة الماوس، فمن المحتمل أن بجكس البشرية الملحوظة في طريق الهجرة ولكن لا السكان المؤسسين. غير أن دراسات تتبع المراحل السابقة العودة بجكس أو PGC السلائف في الأجنة البشرية كانوا في عداد المفقودين.
الوصول إلى بجكس الجنينية البشرية يمثل تحديا بسبب العقبات التقنية والأخلاقية على حد سواء. للتغلب على هذه العقبات، تولدت مؤخرا نماذج الثقافة PGC تشبه خلية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية (PSCs). بلوريبوتينسي هو القدرة على الهاتف الخلوي للتفريق في germline والطبقات الجرثومية الجنينية الثلاث4. في حين يحتفظ PSCs البشرية في المتوسط mTeSR1 (متوسط جاهزة للاستخدام، والمتاحة تجارياً المعدة لصيانة PSCs البشرية في الدولة بلوريبوتينسي معبي) على أطباق مغطاة بطبقة البروتين المصفوفة خارج الخلية لها بلوريبوتينسي الدولة أعدادا 4وفي عام 2013 ومختبر يعقوب حنا أظهرت أن الخلايا معبي بلوريبوتينسي يمكن أن تتحول إلى دولة بلوريبوتينسي ساذجة بتعريض للسذاجة الخلايا الجذعية البشرية المتوسطة (نهسم) التي تحتوي على مثبطات الكيميائي للبروتين مؤنزم ERK1/2، GSK3، جنك، روك، PKC، و p38 MAPK، فضلا عن عوامل النمو ليف، TGF، بفجف5. من PSCs البشرية السذاجة-بلوريبوتينسي، في عام 2015 إنجاز مجموعة بحوث يقودها حنا والصوراني العظيم أول إنتاج قوية من "الخلايا" البشرية بجكليكي (هبجكلكس) من PSCs6. في وقت لاحق، أفادت عدة مختبرات أخرى، بما في ذلك بلدنا، جيل هبجكلكس من شركات الأمن الخاصة التي تستخدم بروتوكولات مختلفة قليلاً7،،من89،10. دراستنا تقدم دليلاً على أن هبجكلكس التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكولات مختلفة (التي يرد موجز لها في الجدول S1 لدينا دراسة منشورة سابقا10) مماثلة لبعضها البعض10ترانسكريبتومالي. وتؤيد الأدلة المتاحة شبه بجكلكس البشرية إلى بجكس الجنينية البشرية في مرحلة مبكرة قبل المحو جينية العالمية7 و/أو الهجرة تشيموتاكتيك10.
دراسات للماوس بجكس الجنينية والماوس بجكلكس بجكلكس البشرية (مع فقط ولكن وصول محدود جداً إلى بجكس البشرية) قد كشفت عن أن الآليات الجزيئية لمواصفات PGC تختلف اختلافاً كبيرا بين الفأر و الإنسان1،6، 7،،من89،10،11،،من1213،14،15،16 ،17. على سبيل المثال، Prdm14 تلعب أدواراً حاسمة في مواصفات PGC في الأجنة الماوس، ولكن دورها في مواصفات PGC البشرية يبدو محدودة1،15. وفي المقابل، تحريض SOX17 من اوميسوديرمين ضروري ل PGC مواصفات6،،من1114، بينما تبدو هذه عوامل النسخ يمكن الاستغناء عنها للماوس PGC مواصفات15. دعم هذه الإنجازات الأولية للدراسات باستخدام هبجكلكس بشدة أهمية هذا النموذج ثقافة الخلية كبديل بجكس الجنينية البشرية.
وأظهرت دراسات نشرت مؤخرا، التي تنطوي على تقييم تسلسل عميق لدينا مختبر لتحليل عدد نسخ الحمض النووي الجينوم، أن صيانة طويلة الأمنية في الدولة بلوريبوتينسي السذاجة يزيد بشكل ملحوظ مخاطر عدم استقرار الكروموسومات و التشوهات الهيكلية. ولوحظ هذه الظاهرة مع الماوس18 و البشرية19 الأمنية الخاصة. بوضع بروتوكول هبجكلك الإنتاج الأصلي عنها حنا/الصوراني PSCs البشرية في متوسطة بلوريبوتينسي 4i ساذجة لمدة أسبوعين على الأقل6. للحفاظ على تناذر ضعفاني الطبيعي للبشرية PSCs وبجكلكس، قمنا بتطوير بروتوكول معدلة التي يتعرض فيها PSCs البشرية إلى متوسطة 4i لمدة 72 ساعة فقط10، التي ترد في هذه المادة. يتم الاحتفاظ إيبسكس البشرية (هيبسكس) في ظل حالة بلوريبوتينسي معبي. مباشرة قبل تشكيل المجلس التنفيذي، هي الخلايا المحتضنة في 4i السذاجة إعادة برمجة المتوسطة (متوسطة نهسم معدلة) لمدة 48 ساعة. ثم فصل الخلايا ومعبأة في ميكروويلس للنموذج الحديدية ل 24 ساعة إضافية في المتوسط 4i. يتم الاحتفاظ الحديدية في هبجكلك التعريفي المتوسطة التي تحتوي على تركيزات عالية من BMP4 البشري الماشوب تحت شرط هزاز للثقافة لا مرفق لمدة 8 أيام للحصول على أقصى عائد هبجكلكس. بعد 8 أيام EB الثقافة، هبجكلكس يمكن أن تكون معزولة عن ينتابها EB الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية CD38 + الخلايا مع ~ 40% العائد في نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز تعليق خلية مفردة. حين الأخرى نشر أساليب7،،من89، بما في ذلك البروتوكول الأصلي قبل أن التعديلات6، تولد عادة هبجكلكس في الخلية تلقائياً شكلت المجاميع دون محددة التعريب، يلاحظ هبجكلك التي تنتجها لدينا بروتوكول على سطح الهيئات امبريويد (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة لكافة germline الخلايا. في الأجنة الماوس، عدد سكانها المؤسسين بجكس ~ 40 هي الناجمة من الخلايا epiblast pluripotent مدبرة من التعرض إلى السيتوكينات، بما في ذلك البروتين العظام morphogenetic 4 (Bmp4). في الأجنة البشرية، تم تحديد بجكس أقرب على الجدار اندوديرمال من كيس الصفار حوالي نهاية الأسبوع 3rd للحمل، ولكن يعرف الكثير عن عملية مواصفات PGC البشرية وتنميتها في وقت مبكر. للالتفاف حول الحواجز التقنية والأخلاقية لدراسة بجكس الجنينية البشرية، تولدت نماذج ثقافة الخلية مركب مؤخرا من الخلايا الجذعية pluripotent. هنا، يمكننا وصف بروتوكول 13 يوما لقوى الإنتاج من "الخلايا بجكليكي" البشرية (هبجكلكس). الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) في الدولة بلوريبوتينسي معبي المحتضنة في السذاجة 4i إعادة برمجة المتوسطة لمدة 48 ساعة، وفصلها إلى الخلايا المفردة، ومعبأة في ميكروويلس. صيانة طويلة من هيبسكس في ولاية بلوريبوتينسي ساذجة الأسباب الكروموزومي كبيرة وينبغي تجنبها. هيبسكس في ميكروويلس يتم الاحتفاظ لمدة 24 ساعة في المتوسط 4i إلى هيئات النموذج امبريويد (EBs)، التي ثم إضافية المستزرعة في بلاستيكواري المنخفضة-التقيد بشرط هزاز في الأجلين المتوسط والاستقراء هبجكلك التي تحتوي على تركيزات عالية من BMP4 البشري المؤتلف. كذلك تستزرع الحديدية لمدة 8 أيام في حالة هزاز، غير المنتسب للحصول على الحد الأقصى من الغلة من هبجكلكس. طريق إيمونوهيستوتشيميستري، سهولة اكتشاف هبجكلكس كخلايا بقوة الإعراب عن OCT4 في تقريبا جميع الحديدية حصرا على سطحها. عند فصل انزيماتيكالي الحديدية وتعرض لإثراء نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن جمعها هبجكلكس ك CD38 + الخلايا بنسبة تصل إلى 40-45% العائد.

لوحة ميكروويل المستخدمة هنا في تنسيق 24-جيدا وقد 8 آبار عقد الأوراق ميكروويل، كل منها يدعم تشكيل يصل إلى 1200 الحديدية. من حوالي 24 مليون من 4i السذاجة بلوريبوتينسي الخلايا، تولد هذه اللوحة ميكروويل عادة ~ 8,000 الحديدية تتكون من خلايا ~ 3,000 الواحدة EB. خلال ثقافة غير ملتصقة الحديدية مع التأرجح المستمر، يتناقص عدد الحديدية سليمة تدريجيا بسبب تفكيك ذاتية عفوية، و 000 3 ~ الحديدية البقاء على قيد الحياة حتى اليوم 13 من البروتوكول. أن معظم هؤلاء الباقين على قيد الحياة الحديدية هبجكلكس 50-200 على سطحها (المقدر بالكشف المناعي OCT4 + الخلايا في مسلسل أبواب الحديدية؛ انظر الشكل 8)، الغلة ~ 100,000 OCT4 + هبجكلكس في المجموع. الهضم الأنزيمي للحديدية إلى الخلايا المفردة عملية غير فعالة نسبيا، خفض محصول CD38 أثري نظام مراقبة الأصول الميدانية + هبجكلكس للخلايا 9,000-47,000. في أيدينا، كان في متوسط ستة دفعات مستقلة لكن متتالية من تجارب ± 14,038 5,731 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة). لأن الخلايا خلايا EB CD38 سالب التعبير مرناً OCT4 (qPCR) أو البروتين (إيمونوهيستوتشيميستري) فقط ضعيفة جداً، أن لم يكن تماما غائبة، جميع EB خلايا بقوة معربا عن البروتين OCT4 عمليا أي ما يعادل مجموع سكان CD38 + هبجكلكس.
تتضمن المعلمة الحاسمة لهذا البروتوكول كثافة الخلية. عندما يتم تلقيح 2.0 × 105 إيبسكس البشرية في مصفوفة خارج الخلية البروتين المغلفة جيدا للخلية 6-بئر الثقافة لوحة (منطقة النمو2 سم 9.60 كل بئر) مع 2 مل Y27632 تكمل المتوسطة (2.2.9)، الخلايا ستصل إلى حوالي 20-30% كونفلوينسي في 24 ساعة بعد التلقيح (الشكل 1). بعد ثقافة 24 ساعة إضافية في المتوسط mTeSR1 في غياب Y7632 وخلايا الكلي وشكل المستعمرات، الاحتلال ~ 30% منطقة النمو (الشكل 2). ثم تستزرع خلايا في الأجل المتوسط إعادة برمجة 4i (2.3.2). وبعد 24 ساعة ثقافة في روافد 4i الخلايا تصبح متوسطة، (الشكل 3). ثقافة 24 ساعة إضافية في المتوسط 4i يجعل الخلايا المزدحمة (الشكل 4). التوقيت الدقيق لكثافة الخلية وتغير متوسط (كل 24 ساعة +/-4 ساعات) ذات أهمية حاسمة لنجاح تشكيل الحديدية وهبجكلكس.
بعد 48 ساعة الثقافة في المتوسط 4i، فصل الخلايا وتلقيح للوحة ميكروويل، التي لديها آبار 400 ميكرومتر في الحجم (2.4). على الرغم من أن هذه اللوحة ميكروويل المتاحة تجارياً هي مغلفة ليوصي بالتصاق منخفضة السطح حسب الشركة المصنعة، الطازجة إعادة طلاء مع المنظفات (2.4.3) الحد من خطر التصاق الخلايا غير المرغوب فيها. 800 ميكرون ميكروويلس أدى إلى انخفاض العائد من هبجكلكس، مما يشير إلى أهمية حجم المجلس التنفيذي للتمايز موجهة بشكل صحيح. وسوف تشكل خلايا تلقيح في المتوسط 4i الحديدية في ميكروويلس في ساعات 24-30، والتي يمكن ملاحظتها باستخدام المعيار، مقلوب مجهر تباين المرحلة (الشكل 5). كفاف دائرية من الحديدية أصبحت واضحة للعيان وبعد 24 ساعة من الحضانة. حصاد الحديدية في وقت سابق (مثلاً 16 ساعة بعد التطعيم) غير مستحسن قبل على المنحنى الدائري مرئية بوضوح لهذه الحديدية معرضة جداً للأضرار الميكانيكية وتفكيكها بسهولة. علما بأن كميات كبيرة من السذاجة هيبسكس ليست مدرجة في الحديدية، التي طبيعية. هذه الخلايا الفردية سوف تكون جرفت قبل الشروع في هزاز ثقافة الحديدية على سطح منخفض-تمسكا (2.5.2). لاحظ أيضا أنه لدينا بروتوكول، تتشكل الحديدية في المتوسط بلوريبوتينسي السذاجة 4i-ليس في المتوسط هبجكلك. ما قبل تشكيل الحديدية الصلبة في المتوسط 4i قبل التعرض إلى متوسط هبجكلك مهم لتوزيع هبجكلكس على سطح الحديدية.
تحتفظ الحديدية في المتوسط هبجكلك تحت هزاز، شرط الثقافة غير ملتصقة ستحافظ على شكلها كروي دون التجميع أو الانصهار(الرقم 6 و الرقم 7). جداً سوف يسبب ضعف هزاز شرط EB التجميع والانصهار، ولكن ظروف قاسية جداً سيتم تفكيك الحديدية. لا تظهر بجكلكس البشرية كخلايا معربا عن OCT4 على سطح الحديدية بعد أقرب ثقافة 5 أيام في المتوسط هبجكلك، وعلى زيادة عدد حتى الثقافة 8 أيام (الشكل 8). قد يسبب احتضان المزيد من الحديدية تفكيك الحديدية وفقدان هبجكلكس. يمكن إثراء البشرية بجكلكس من انزيماتيكالي منفصلان EB الخلايا بعد 5-8 أيام ثقافة في المتوسط هبجكلك بنظام مراقبة الأصول الميدانية ك CD38 + الخلايا (الشكل 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> رقم 1: اللجنة التوجيهية البشرية خلية ثقافة في تكملة Y27632 المتوسطة 24 ساعة بعد التطعيم. كثافة الخلية هو حوالي 20-30% المتلاقية. حضور مثبط روك Y27632، تميل الخلايا ينتشر جيدا مع استطالة طويلة، مثل ارتفاع. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> رقم 2: زراعة الخلايا البشرية [ايبسك] 48 ساعة بعد التطعيم. خلايا الكلي للمستعمرات النموذج، الاحتلال ~ 30% ناحية النمو. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> الشكل 3: زراعة الخلايا البشرية اللجنة التوجيهية المحتضنة في المتوسط 4i إعادة برمجة لمدة 24 ساعة. الخلايا تصل إلى كونفلوينسي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> الشكل 4: اللجنة التوجيهية البشرية خلية ثقافة المحتضنة في المتوسط 4i إعادة برمجة لمدة 48 ساعة. هي خلايا المتلاقية المزدحمة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> الرقم 5: اللجنة التوجيهية البشرية شكلت الحديدية في ميكروويلس بعد حضانة 24 ساعة في 4i إعادة برمجة المتوسطة- كفاف دائرية من الحديدية تصبح مرئية في 24-30 ساعة بعد التطعيم. عندما يتم تأكيد الكفاف تحت مجهر تباين المرحلة، على استعداد لنقل إلى حالة ثقافة هزاز الحديدية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> رقم 6: اللجنة التوجيهية البشرية الحديدية المحتضنة لمدة 24 ساعة في المتوسط هبجكلك. الحديدية الحفاظ إلى حد كبير على شكلها كروي. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> رقم 7: اللجنة التوجيهية البشرية المحتضنة الحديدية 192 ساعة في المتوسط هبجكلك. يتم توسيع الحديدية مقارنة بمظهرها في الثقافة 24 ساعة، ولكن أنها لا تزال إلى حد كبير الحفاظ على الأشكال الكروية مع لا التجميع أو الانصهار. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> الشكل 8: يتم ترجمة بجكلكس البشرية معربا عن OCT4 على سطح هيبسك الحديدية المحتضنة 192 ساعة في المتوسط هبجكلك. الحديدية كانت جزءا لا يتجزأ من البروتين المصفوفة خارج الخلية وتجهيزها للشريحة فب المناعي تلطيخ من OCT4 (الركيزة الدأب). مقياس بار = 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> الشكل 9: بجكلكس البشرية هي إثراء من انزيماتيكالي منفصلان EB الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية ك CD38+ الخلايا. بعد الحضانة في المتوسط هبجكلك لمدة 5-8 أيام، يمكن أن تنفصل الحديدية بالهضم الأنزيمي لإعداد تعليق خلية مفردة. يمكن إثراء هبجكلكس ك CD38+ الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية (النقاط الحمراء). EB الخلايا التي لا تعبر عن CD38 (تكون هذه النقاط زرقاء) ينبغي أن تجمع أيضا كمراقبة سلبية. يجب فصل نظام مراقبة الأصول الميدانية بوابات الخلايا CD38-الإيجابية والسلبية CD38 مع هامش واسع لتفادي التلوث من كل نوع من الخلايا (النقاط الخضراء). لوحات العلوي والسفلي إظهار التشكيلات الجانبية لنظام مراقبة الأصول الميدانية دون أو مع الأجسام المضادة-CD38 تلطيخ، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة للحيوانات المنوية والبيض على حد سواء. بجكس الجنينية البشرية المحددة من الخلايا pluripotent epiblast من خلال التفاعلات السيتوكينات. هنا، نحن وصف بروتوكول 13 يوما لحمل ترانسكريبتومالي الخلايا البشرية تشبه بجكس على سطح الهيئات امبريويد من الخلايا الجذعية pluripotent معبي-بلوريبوتينسي التي يسببها.

جيل من البشرية البدائية الخلية الجرثومية مثل الخلايا على سطح الهيئات امبريويد من بلوريبوتينسي جاهزة للانفجار الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم على الخط الجرثومي البشري، مثل كيفية إنشاء أو إصلاح الأضرار في جينوم الخلايا الجرثومية البدائية البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا الجرثومية البدائية البشرية يمكن أن تولد في غضون أسبوعين من خلايا iPS المتعددة القدرات التي تؤوي الخلفية الوراثية للمرض. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الوقاية من ضعف الجينوم في الخلايا الجرثومية البشرية ، لأن نموذج ثقافة الخلية لدينا يمكن أن يساعدنا على تقليل السمية الجرثومية للدواء العلاجي.لتبدأ مع توليد الخلايا الجرثومية البدائية الإنسان مثل الخلايا، أو PGCLCs الإنسان، وإعداد لوحات خارج الخلية مصفوفة المغلفة بالبروتين وتعليق الخلية من iPSCs الإنسان، كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد تعليق خلية واحدة من iPSCs الإنسان تستعد متعددة الأطراف في المتوسطة mTeSR1 التي تحتوي على مثبطات Y-27632 Rho كيناز. ضبط كثافة الخلية بعناية إلى 100,000 خلية لكل ملليلتر.تلقيح مليلترين من تعليق الخلية من iPSCs الإنسان تستعد في كل بئر من البروتين مصفوفة خارج الخلية المغلفة ستة جيدا لوحات، والتأكد من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي عن طريق هز لوحات عموديا وأفقيا. احتضان اللوحات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ثلاثية الغاز عند 37 درجة مئوية. من المهم جداً تلقيح 200,000 خلية بالضبط في كل بئر من ألواح الستة جيداً.يعد العد الدقيق للخلايا أمرًا بالغ الأهمية. بعد الانتهاء من التحويل العابر إلى تعدد السذاجة ، يجب أن تبدو الخلايا أكثر من التقاء ، وهو أمر طبيعي. التوقيت الدقيق للتغير المتوسط مهم لتحقيق معدلات عالية من PGCLCs البشرية والقابلية للتكرار التجريبي.كثافة من 4i hiPSC الثقافة عالية في ظل هذه الظروف، ومن المتوقع أن تصبح الخلية التقاء في 48 إلى 72 ساعة بعد التطعيم. بعد 24 ساعة من التطعيم، قم بتغيير الوسط بمليلترين في بئر mTeSR1 المتوسط بدون Y27632. بدء تحويل تستعد الدولة متعددة القدرات iPSCs الإنسان إلى 4i الخلايا الجذعية متعددة القدرات الساذجة، عن طريق الاحترار 50 ملليلتر من 4i المتوسطة كاملة في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.في 48 و 72 ساعة بعد التلقيح، وإزالة لوحات من الحاضنة، وتغيير المتوسطة مع 2 ملليلتر في بئر من 4i المتوسطة كاملة. الطرد المركزي المنظفات المغلفة لوحة microwell في 1، 000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. افحص الآبار باستخدام المجهر المقلوب لضمان عدم وجود فقاعات الهواء.شطف الآبار كما هو موضح في بروتوكول النص، وتكرار الطرد المركزي. إضافة 4i متوسطة كاملة إلى الآبار المشطفة. الطرد المركزي لوحة في 1،000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتفتيش الآبار مرة أخرى.لتطعيم iPSCs 4i الإنسان في لوحة microwell، وإعداد تعليق خلية iPSC الإنسان كما هو موضح في البروتوكول. تصفية هذا التعليق الخلية من خلال 40 ميكرومتر المسام حجم خلية مصفاة لإزالة مجاميع الخلية. غسل مصفاة مع ملليلتر واحد من 4i قبل الدافئة إكمال المتوسطة ثلاث مرات لجمع جميع الخلايا من مصفاة، وعد الخلايا مع عداد الثقافة.ثم، تمييع هذا التعليق خلية واحدة من iPSCs الإنسان ساذج 4i إلى 27 إلى 32.4 مليون خلية في 9 ملليلتر قبل warmed 4i المتوسطة كاملة تحتوي على Y27632. إزالة لوحة صغيرة تم إعدادها سابقا تحتوي على 1 ملليلتر من 4i المتوسطة كاملة في بئر من حاضنة ثلاثية الغاز. تلقيح 1 ملليلتر من 4i تعليق iPSC الإنسان الساذج في كل بئر, لتحقيق تركيز 3.0 إلى 3.6 مليون خلية في البئر.ماصة بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي. الطرد المركزي لوحة في 100 غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ثلاثية الغاز ، مع التأكد من عدم إزعاج الخلايا التي يتم وضعها في الwell الدقيقة ، واحتضانها لمدة 24 إلى 30 ساعة ، لأن الحضانة بين عشية وضحاها غير كافية لتشكيل الأجسام الجنينية الضيقة أو EBs.Prewarm 5 ملليلتر من الإنسان PGCLC المتوسطة القاعدية و 20 ملليلتر من PGCLC الإنسان المتوسطة كاملة لمدة خمس دقائق على الأقل في حمام الماء 37 درجة مئوية مكان بعناية 40 ميكرومتر المسام مصفاة خلية الحجم رأسا على عقب على أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 ملليلتر. لفصل EBs عن الآبار الصغيرة ، والماصات بلطف كل بئر من اللوحة. لإزالة الخلايا غير المدمجة في EBs، تصفية محتويات جميع الآبار من خلال مصفاة الخلية.غسل بلطف EBs الاحتفاظ بها على غشاء مصفاة الخلية مع 1 ملليلتر من قبل الدافئة الإنسان PGCLC المتوسطة القاعدية, وتكرار غسل خمس مرات. وضع أنبوب مخروطي 50 ملليلتر جديدة على مصفاة الخلية، بحيث يتم الآن وضع مصفاة الخلية الجانب الأيمن في أنبوب جديد. عكس بسرعة مصفاة الخلية مع أنبوب جديد، والتي سوف وضع ابس تحت غشاء مصفاة الخلية.إضافة 18 ملليلتر من PGCLC الإنسان قبل الدافئة متوسطة كاملة لغشاء مصفاة الخلية لجمع EBs في أنبوب مخروطي. ثم، لوحة 3 ملليلتر في بئر من تعليق EBs في آبار من لوحة مرفقة منخفضة ستة بئر. ضع اللوحة على الروك المناشار في حاضنة الغاز الثلاثي ، وحدد بعناية سرعة الهزاز في حوالي 20 منعطفًا في الدقيقة.في اليوم السابع إلى الثالث عشر من التجربة، أعد حديثا 20 ملليلتر من PGCLC الإنسان متوسطة كاملة كل يوم. إزالة لوحة من الروك، والتي سوف تجعل بالوعة EBs إلى الجزء السفلي من الآبار. إزالة المتوسطة القديمة دون تجفيف EBs بحيث يبقى حوالي 0.2 ملليلتر من المتوسطة القديمة في كل بئر.إضافة 3 ملليلتر في بئر من PGCLC الإنسان الطازجة المتوسطة كاملة, بعد إزالة المتوسطة القديمة اليومية. لتحديد PGCLCs الإنسان كخلايا إيجابية OCT4، حصاد EBs إلى أنبوب microcentuge منخفضة الربط 1.5 ملليلتر. دع الـ EBs بالوعة إلى الأسفل في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من الوسيطة.شطف EBs مع الجليد البارد 1X PBS. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، احتضان EBs في 1 ملليلتر من الجليد البارد 1٪ الوزن من قبل حجم أزيد الصوديوم في PBS على الجليد لمدة خمس دقائق. اسمحوا EBs بالوعة إلى أسفل في درجة حرارة الغرفة.بعد التخلص من المكبر ، شطف EBs مع PBS البارد الثلج. ذوبان 200 ميكرولترات من البروتين مصفوفة خارج الخلية على الجليد. إضافة البروتين إلى أنبوب يحتوي على ا.اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبًا ، حتى يتم تجمد الجل ، ويتم تضمين EBs. لإصلاح EBs ، أضف 1 ملليلتر من 4٪ الفورمالديهايد في PBS إلى الأنبوب ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف. بعد ذلك ، تجاهل الفورمالديهايد وشطف EBs مرة واحدة مع PBS الباردة الجليد.إضافة 1 ملليلتر من 70٪ الإيثانول. تخزين في 70٪ الإيثانول في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، أو المضي قدما في معالجتها مع بروتوكول FFPE القياسية. كثافة الخلية وحتى توزيع الخلايا على كل بئر هي حرجة.IPSCs الإنسان في 2 ملليلتر من Y27632 تكمل المتوسطة في بئر من لوحة ستة جيدا، تصل إلى 20 إلى 30٪ التقاء بعد 24 ساعة. بعد ثقافة إضافية 24 ساعة في المتوسط mTeSR1، في غياب Y27632، جمعت الخلايا وشكلت مستعمرات، وتحتل ما يقرب من 30٪ من منطقة النمو. بعد 24 ساعة من الثقافة في 4i إعادة برمجة المتوسطة، وصلت الخلايا التقاء.بعد 24 ساعة إضافية من الثقافة في الوسط 4i، أصبحت الخلايا أكثر كثافة معبأة. بعد 24 ساعة حضانة في microwells في 4i إعادة برمجة المتوسطة، شكلت الخلايا EBs مع كفاف دائري مرئية في 24 إلى 30 ساعة بعد التطعيم. حافظت الـ EBs في وسط PGCLC البشري ، تحت ظروف غير مُهتزة ، على شكلها الكروي دون تجميع بعد 24 ساعة.بعد 192 ساعة، كانت EBs أكبر، والحفاظ على نفس مورفولوجيا. بعد 5 أيام، ظهرت الخلايا كـ OCT4 التي تعبر عن الخلايا على سطح EBs، مما يزيد عددها بعد 8 أيام. تم إثراء الخلايا من تعليق خلية واحدة من PGCLCs الإنسان كالخلايا إيجابية CD38 بواسطة FACS.كانت الخلايا التي لا تعبر عن CD38 تحكمًا سلبيًا. ولتجنب التلوث، تم فصل الخلايا CD38-إيجابية وD38-سالبة للوبل، بـ FACS، بفارق كبير. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم لمتابعة العد الدقيق للخلية وتوقيتات التغيير المتوسط.قد يؤدي حذف التغيير المتوسط حتى في يوم واحد ، أو تقليل حجم هذه الوسيلة في أي خطوة ، إلى موت الخلايا الهائل. سرعة ثقافة هزاز من الهيئات الجنينية يجب أن يكون الأمثل بعناية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

المستمدة الشبكية الظهارة الصبغية (RPE) من المستحثة متعددة القدرات الجذعية (آي بي إس) الخلايا عن طريق أحجام مختلفة من الهيئات مضغي

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من سرطان الجلد البشري الخلايا اللمفاوية-التسلل الورم

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

محددة وقابلة للتطوير الجيل من الخلايا تشبه الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...