Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

我们感谢 shiomi yawata 和 chie owa 在初步研究期间提供的技术援助。这项研究得到了 niehssee nih 向 jhh 提供 re0023316 和 r21es024861 向 ts 的资助, 并得到了飞行辅助医学研究所 (famri) 的资助。

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	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

使用这里描述的协议的 hPGCLCs 的稳健生产得到了三个具有正常二倍体核型10的人 ipsc 独立克隆的证实。这些 ipsc 克隆体来源于同一人类新生儿真皮皮肤成纤维细胞培养10。本文作者将根据请求并根据适当的材料转让协议和冷冻活人牢房的运输安排, 向调查人员提供这些资料。目前尚不清楚是否需要正常的核型才能使用我们的协议或其他实验室报告的协议进行稳健的 hpgclc 生产。
最近的研究表明, 使用 saitou 的京都大学8组描述的协议从 hpsc 11 或 esc14中生产 hPGCLCs 取决于 eomesosermin 的表达, eomes功耗 min 是sox17 的诱导。sox17 似乎是决定转录因子的主系, 在人多能干细胞的种系分化中发挥着重要作用.eomesodemin 是由eomes基因编码的, 在 hpgclc 生产条件11中, eomes的 crispric/cas9 敲除导致几乎完全没有 sox17 诱导, 其他基因的表达遵循了相同的模式。sox17 空敲除细胞。在 hpgclc 诱导培养过程中, eomesodemin 在eomes-空敲除细胞中的诱导载体过度表达, 有效地挽救了 hpgclc 的强效产生以及对包括 sox17 在内的种系基因的诱导。相反, 诱导过度表达 sox17 也挽救了强大的 pgclc 生产, 但没有诱导 eomes。因此, eomesodemin 是 sox17 的关键上游诱导剂, 这似乎是 eomesodemin 在人类多能干细胞 hpgclc 诱导中最重要的作用。我们的协议在 hpsc10 中诱导 sox17, 但它对 eomesodemmine 诱导的依赖有待确定。
该协议将在 mtesr1 介质中维护96小时的初级多能人 ipsc 转换为与 erk 无关的天真多能, 在4i 重编程介质6中, 这是一种经过修饰的天真的人干细胞培养基 (nhsm)5。我们试图从相同的人类 ipsc 克隆开始生成 hPGCLCs, 但在4i 重新编程介质中的培养之前, 我们在其他商业上可获得的人类 ipsc 生长介质中进行了维护, 从而导致 hPGCLCs 的产量降低。尽管其他媒体的长期适应是否能提高 hpgclc 的生产仍有待在未来的研究中确定, 但这一观察表明, 在4i 重新编程之前, 人类 ipsc 的引贴多能性的确切状态仍有待确定影响4i 培养基的 eb 形成和 hpgclc 培养基中的 eb 分化。
按照我们的协议从高保安防中生产 hPGCLCs 是稳健和高度可重复的, 部分原因是使用了微井板, 能够高效生产大量尺寸均匀 (每片电子供应链 3, 000个 hpsc) 的 eb (每批约 8, 000个 eb)。使用我们的协议在单批实验中容易产生的 eb 数量可能远远大于使用常规 u 底细胞培养井的方法。生产大量同等大小的与 hPGCLCs 一致的 eb, 可以提供高通量化学筛选的独特机会, 以识别影响 pgc 规格或其规格的小分子量激活剂或抑制剂。生物特征, 如表观遗传重编程。这类 e b s 也可用于大量胚系细胞毒物的毒理评估, 不仅包括环境污染物, 还包括临床规定的药物, 如化疗药物。
使用所提交的协议可靠和可重复地生产 hPGCLCs 的关键因素包括: (一) 使用 mtesr1 中关于细胞外基质蛋白的健康高 psc, (ii) 按照规定和严格的方式接种确切数量的细胞遵循介质变化和亚培养的时间, (iii) 选择大量的人重组 bmp4, (iv) 在摇摇培养过程中最大限度地减少 eb 的物理损伤。我们的经验是, 最好的 bmp4 试剂工作在 100 ngml 浓度, 而其他很多 bmp4 试剂需要2倍或更大的剂量。另一方面, 在 bmp4 的较高剂量 (例如, 200 ng/ml) 下, 使用最佳 bmp4 量的 hPGCLCs 生产的产量则有所下降。我们建议测试从多个供应商获得的几种不同数量的重组人 bmp4 试剂, 以确保它们在支持 hpgclc 生成方面的性能, 并确保大量最佳批次。
我们的 hpgclc 协议的一个独特之处在于, hpgclc 在eb10最外层进行本地化 (图 8), 而其他协议可以在单元聚合6,8的中间生成 hpgclc。胚胎体往往形成多个不同的层, 如表面、外壳、内壳和核心, 而中央核心区域往往因营养物质、氧气供应有限以及培养中提供的促进存活的因素而坏死中通过扩散20。由于向 eb 中心扩散有限而在 eb 表面定位 hPGCLCs 而不受任何限制, 可能有利于 hPGCLCs 直接、时间和剂量控制接触药物或有毒物质的药理作用或毒理学研究。
小鼠 pgclc 显示出强大的全基因组 dna 脱甲基化, 至少部分涉及印迹控制区域,但 ppclc 中的全球 gdna 脱甲基化程度似乎弱于小鼠pgclcs 或 pgc6、7。转录谱表明, 与小鼠 pgclc 10 相比, hPGCLCs 可能类似于胚胎 pgc的早期阶段。据报道, 在 hpgclc 生产条件下, 长期培养 eb 导致 gdna 脱甲基化程度提高;然而, 在 eb 中长期培养 hPGCLCs 或作为孤立细胞是否能够达到更高级的种系分化阶段, 需要由未来的研究来确定。

原始生殖细胞 (pgc) 是所有两性生殖细胞的常见前体。我们关于哺乳动物胚胎中 pgc 发育的大部分知识是通过研究实验室小鼠1,2获得的。在胚胎期6.0-6.5 小鼠胚胎中, 6个或类似的少量 pgc 前体位于表爆中, 并以依赖于从相邻分泌的骨形态发生蛋白 bmp2 和 Bmp2 的方式从它们中诱导出大约 40个 pgc 的建立种群细胞。迄今在胚胎中发现的最早的人类 pgc 是在妊娠3周结束时的卵黄囊内皮壁上。由于这与在小鼠胚胎中观察到的迁移 pgc 相同的地方, 观察到的人类 pgc 很可能处于迁徙的道路上, 但不是建国人口。然而, 追踪人类胚胎中 pgc 或 pgc 前体早期阶段的研究一直缺失。
由于技术和道德障碍, 获得人类胚胎 pgc 具有挑战性。为了克服这些障碍, 最近从人类多能干细胞 (psc) 中产生了类似 pgc 的细胞培养模型。多能性是细胞分化为种系和三个胚胎胚芽层4的能力。而人类 psc 保持在 mtesr1 培养基 (一种随时可用的, 商业上可获得的介质, 用于维持人类 psc 在引脚多能状态) 上的菜肴上, 其在含有细胞外基质蛋白的菜肴上具有引种状态多能性4, 2013年雅各布·汉娜的实验室表明, 引物多能细胞可以转化为一种天真的多能性状态, 通过将含有化学抑制剂的天真的人类干细胞培养基 (nhsm) 暴露在蛋白质激酶 k女式 k半、gsk3、jnk、rock、pkc (和 p38 mapk 以及生长因子 lif、tgf、bfgf5。2015年, 由 hanna 和 azim surani 领导的一个研究小组从 psc 6 中首次完成了人类 pgc 样细胞 (hPGCLCs) 的稳健生产.后来, 包括我们的实验室在内的其他几个实验室报告说, 私营保安公司使用稍有不同的协议7、8、9、10生成了hPGCLCs。我们的研究提供的证据表明, 使用不同协议产生的 hPGCLCs (我们以前发表的研究报告 10的表 s1 总结了这些协议) 在转录上彼此相似。现有证据支持人类 pgclc 与早期人类胚胎 pgc 在全球表观遗传过程7和/或趋化迁移之前的相似性。
对小鼠胚胎 pgc、小鼠 pgclc 和人 pgclc (但接触人类 pgc 的机会非常有限) 的研究表明, 小鼠和人类1,6、 7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16 ,17岁。例如, prdm14 在小鼠胚胎的 pgc 规范中起着关键作用, 但它在人类 pgc 规范中的作用似乎有限, 为1,15.相反, eomesodemin 诱导 sox17 对于 pgc 规格6、11、14是必不可少的, 而这些转录因子对于小鼠 pgc 规范15来说似乎是可有可无的。使用 hPGCLCs 进行的这些初步研究成果有力地支持了这种细胞培养模型作为人类胚胎 pgc 的替代品的重要性。
最近发表的研究涉及我们实验室对基因组 dna 拷贝数分析的深度测序评估, 研究表明, 在极净的多能状态下长期维持 psc, 会显著增加染色体不稳定的风险。结构异常。这一现象在小鼠18和人类19个psc 中都有观察到。hana/surani 报告的原始 hpgclc 生产协议是为在4i 天真多能介质中保持至少 2周6的人 psc 开发的。为了保持人 psc 和 pgclc 的正常二倍体核型, 我们开发了一个改进的协议, 其中人类 psc 接触4i 介质的时间只有 72小时,本文介绍了这一方案。人类 ipsc (hipsc) 保持在引种多能状态下。在 eb 形成之前, 细胞在4i 幼稚的重编程介质 (改良的 nhsm 培养基) 中孵育48小时。然后将细胞分离并包装成微束, 在4i 介质中增加24小时形成 eb。在含有高浓度重组人 bmp4 的 hpgclc 诱导培养基中保持 eb, 在无附着培养的摇摆条件下最多 8天, 以获得 hpgclc 的最大产量。在8天的 eb 培养后, 利用 facs 将 hPGCLCs 作为 cd38 + 细胞从离解的 eb 细胞中分离出来, 在 fts 可分等级单细胞悬浮液中的收率高达40%。而其他已发布的方法7,8,9, 包括我们修改之前的原始协议 6, 通常在自发形成的细胞群中生成 hPGCLCs, 而没有特定的在胚胎体 (eb) 的表面观察到了我们的协议所产生的 hpgclc 的定位。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

原始生殖细胞 (pgc) 是所有胚系细胞的常见前体。在小鼠胚胎中, 通过精心接触细胞因子 (包括骨形态发生蛋白 4 (bmp4), 从多能表外细胞中诱导了 ~ 40个 pgc 的建立种群。在人类胚胎中, 在妊娠第3周结束前后的卵黄囊内皮壁上发现了最早的 pgc, 但对人类 pgc 规范的过程及其早期发育了解甚少。为了规避研究人类胚胎 pgc 的技术和伦理障碍, 最近从多能干细胞中产生了替代细胞培养模型。在这里, 我们描述了一个为期13-day 的方法, 用于可靠地生产人的 pgc 样细胞 (hPGCLCs)。人类诱导多能干细胞 (hipsc) 保持在引种多能状态下, 在4i 幼稚的重新编程介质中孵育 48小时, 与单个细胞分离, 并被包装成微束。在天真的多能状态下长期维持高 psc 会导致严重的染色体畸变, 应避免。微叶中的 hpsc 在4i 培养基中保持额外的 24小时, 形成胚胎体 (eb), 然后在 hpgclc 诱导培养基中的低粘附塑料体中培养, 在摇凝状态下培养低粘附的塑料制品, 其中含有高浓度的重组人 bmp4。在摇摆不定的非粘附条件下, 再培养28天的 e b, 以获得 hPGCLCs 的最大产量。通过免疫组织化学, hPGCLCs 很容易被检测为在其表面的几乎所有 eb 中强烈表达 oct4 的细胞。当 eb 被酶解离并经过流式细胞仪的富集化时, hPGCLCs 可以作为 cd38 + 细胞收集, 产率高达40-45%。

这里使用的微井板采用24井格式, 有8口井, 容纳微井板, 每口都支持形成多达 1, 200个 eb。从大约2400万的4i 幼稚多能细胞, 这个微井板通常产生 ~ 8, 000个 eb, 包括 ~ 3, 000个细胞每个 eb。在不断摇晃的 eb 非粘附培养过程中, 由于自发的自溶解, 完整的 eb 数量逐渐减少, ~ 3, 000个 eb 存活到协议第13天。这些幸存的 eb 大多表面有 50-200 hPGCLCs (通过对 eb 连续切片中 oct4 + 细胞的免疫组织化学检测估计; 见图 8), 总共产生约 100, 000个 oct4 + hPGCLCs。将 eb 酶消化成单个细胞是一个相对低效的过程, 将富 fs 富集 cd38+ hPGCLCs 的产量降低到 9, 000-47, 000 细胞。在我们手中, 平均6批独立但连续的实验为 14 038±5, 731 (平均±sem)。因为 cd38 阴性 eb 细胞表达 oct4 mrna (qpcr) 或蛋白质 (免疫组织化学) 只有非常微弱的, 如果不是完全不存在, 所有 eb 细胞强烈表达 oct4 蛋白实际上是等效的整个种群的 cd38 + hPGCLCs。
此协议的关键参数包括细胞密度。当 2.0 x105人 ipsc 接种6井细胞培养板 (每口培养面积9.60 厘米 2) 的细胞外基质蛋白涂层井, 培养基为2毫升 y27632 补充介质 (2.2.9) 时, 细胞在24时将达到约20-30 的融合度接种数小时后 (图 1)。在没有 y7632 的情况下, 在 mtesr1 培养基中进行额外的24小时培养后, 细胞聚集并形成菌落, 占生长面积的约 30% (图 2)。然后在4i 重编程培养基 (2.3.2) 中培养细胞。在4i 培养基中培养24小时后, 细胞就会融合 (图 3)。在4i 培养基中增加24小时培养, 使细胞密集包装 (图 4)。介质变化的确切时间 (每 24小时 +/4小时) 和细胞密度对于成功形成 eb 和 hPGCLCs 至关重要。
在4i 培养基中48小时培养后, 细胞被分离并接种到微井板上, 微井板的大小为 400μm (2.4)。尽管该商用微井板由制造商涂覆用于低附着力表面, 但建议使用洗涤剂 (2.4.3) 进行新鲜的再涂层, 以降低不必要的电池粘附风险。800μm 微束降低了 hPGCLCs 的收率, 表明 eb 尺寸对于适当定向分化的重要性。在4i 介质中接种的细胞将在24-30小时在微细胞中形成 eb, 使用标准的倒置相对比显微镜可以观察到这一点 (图 5)。在孵育24小时后, e b 的圆形轮廓变得清晰可见。不建议在其圆形轮廓清晰之前的较早时间 (例如接种后 16小时) 收获 e b, 因为这种 e b 很容易受到机械损害, 容易被拆除。请注意, 大量天真的 hpsc 不包含在 eb 中, 这是正常的。这些未合并的细胞将在低粘附表面 (2.5.2) 上启动 eb 的摇化培养之前被冲走。另请注意, 在我们的协议中, eb 是在4i 天真多能介质中形成的, 而不是在 hpgclc 介质中形成的。在接触 hpgclc 介质之前, 在4i 介质中预形成固体 eb 对于在 eb 表面的 hpgclc 分布具有重要意义。
在摇摆不定的非粘附培养条件下保持在 hpgclc 介质中的 eb 将保持其球形形状, 而不会聚集或融合 (图 6 和图 7)。太弱的摇摆条件会导致 eb 聚集和融合, 但太苛刻的条件会拆除 eb。人类 pgclc 在 hpgclc 培养基中早在5天培养后就会在 eb 表面作为 oct4 表达细胞出现, 其数量增加到8天培养 (图 8)。进一步培育能源----可能会导致 eb 被拆除和 hPGCLCs 的损失。人 pgclc 在 hpgclc 培养基中培养5-8 后, 可作为 cd38+ 细胞从酶解离的 eb 细胞中富集 (图 9)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> 图 1: 接种24小时后 y27632 补充培养基中的人 ipsc 细胞培养.细胞密度约为20-30 的融合。在 rock 抑制剂 y27632 的存在下, 细胞往往以长长的尖峰伸长率很好地扩散。刻度杆 = 100μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> 图 2: 接种48小时后的人 ipsc 细胞培养.细胞聚集形成菌落, 占生长面积的约30%。刻度杆 = 100μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> 图 3: 人类 ipsc 细胞培养在4i 重编程介质中孵育 24小时.细胞达到融合。刻度杆 = 100μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> 图 4: 人类 ipsc 细胞培养在4i 重编程介质中孵育 48小时.密闭细胞密集地被包装。刻度杆 = 100μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> 图 5: 在4i 重编程介质中24小时孵育后, 人类 ipsc eb 在微细胞中形成.在接种后24-30小时内, eb 的圆形轮廓就会显现出来。当轮廓在相衬显微镜下确认时, e b 就可以转移到摇摆不定的培养条件下。刻度杆 = 500μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> 图 6: 人类 ipsc eb 在 hpgclc 介质中孵育 24小时.eb 在很大程度上保持了其球形形状。刻度杆 = 500μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> 图 7: 人类 ipsc eb 在 hpgclc 介质中孵育 192小时.与24小时培养时的外观相比, eb 被放大, 但它们在很大程度上仍然保持球形形状, 没有聚集或融合。刻度杆 = 500μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> 图 8: 表示 oct4 的人 pgclc 在 hpgclc 介质中孵育192小时的 hepsc eb 表面进行定位.将 eb 嵌入细胞外基质蛋白中, 并对 oct4 (dab 基板) 的 ffpe 滑块免疫组化染色进行处理。刻度栏 = 1 毫米. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> 图 9: 利用流式细胞仪作为 cd38+细胞从酶解离解的 eb 细胞中富集人 pgclc.在 hpgclc 培养基中孵育5-8 后, 通过酶消化分离 eb 制备单细胞悬浮液。hPGCLCs 可以通过流式细胞仪 (红点) 作为 cd38+细胞进行富集。不表示 cd38 (蓝点) 的 eb 细胞也应作为负对照收集。cd38 阳性细胞和 cd38 阴性细胞的流式细胞仪门应以较大的边缘 (绿点) 分离, 以避免每种类型的细胞受到污染。上面板和下板分别显示没有或有抗 cd38 抗体染色的 facs 特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

原始生殖细胞 (pgc) 是精子和卵子的常见前体。人类胚胎 pgc 是通过细胞因子的相互作用从多能细胞中指定的。在这里, 我们描述了一个为期13-day 的方案, 诱导人类细胞转录类似于 pgc 在胚胎体表面从初级多能诱导多能干细胞。

从原生多能诱导干细胞中生成胚胎体表面的人原始生殖细胞样细胞

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

这种方法可以帮助回答人类生殖毒理学领域的关键问题，例如人类原始生殖细胞基因组中的损伤是如何产生或修复的。这项技术的主要优点是，人类原始生殖细胞可以在两周内从具有疾病倾向遗传背景的利用多能性 iPS 细胞中产生。该技术的影响扩展到预防人类生殖细胞的基因组损伤，因为我们的细胞培养模型可以帮助我们减少治疗药物的生殖碱毒性。首先，如文本协议所述，从人类原始生殖细胞样细胞或人类PGCLC的生成开始，编写细胞外基质蛋白涂层板和细胞悬浮液。在含有Y-27632 Rho激酶抑制剂的mTeSR1介质中准备一个素质多能人类 iPSCs 的单细胞悬浮液。小心地将细胞密度调整到每毫升10万个细胞。在细胞外基质蛋白涂层的六孔板的每个井中接种两毫升填充人类 iPSC 的细胞悬浮液，确保细胞通过垂直和水平摇动板均匀分布。在37摄氏度的三气CO2培养箱中孵育板。在六井板的每个井中准确接种20万个细胞是非常重要的。准确计数细胞至关重要。在完成暂时性转换到天真多能性后，细胞应看起来过度汇合，这是正常的。介质变化的准确时间对于实现高人类PGCLC和实验可重复性非常重要。在这些条件下，4i hiPSC 培养的密度很高，预计在接种后 48 至 72 小时内细胞会合。接种后24小时，在没有Y27632的情况下，用每井2毫升的mTeSR1介质更换介质。开始将供热多能状态人类iPSCs转化为4i天真多能干细胞，在37摄氏度的水浴中加热50毫升4i完整介质15分钟。在接种后48小时和72小时，从培养箱中取出板，并改变培养基，每孔2毫升4i完整介质的介质。在室温下将洗涤剂涂层的微井板在1000克下离心5分钟。使用倒置显微镜检查油井，确保没有气泡。如文本协议所述冲洗水井，然后重复离心。在冲洗的孔中加入4i完整的介质。在室温下以1000克离心板5分钟，然后再次检查油井。要将4i人类iPSC接种到微井板中，请根据协议中所述准备人类iPSC细胞悬浮液。通过 40 微米孔径细胞滤株过滤此细胞悬浮液，以去除细胞聚集体。用一毫升预热4i完整介质洗涤过滤器三次，从过滤器中收集所有细胞，并用培养计数器计数细胞。然后，稀释这种单细胞悬浮4i天真人类iPSCs到27至3240万细胞在9毫升预加热4i完整的介质含有Y27632。从三气培养箱中取出先前准备的微井板，每井含有 1 毫升 4i 完整介质。将1毫升4i nave人类iPSC悬浮液接种到每一井中，达到每井300万至360万个细胞的浓度。轻轻移液器均匀分布细胞。在室温下以 100 g 离心板 3 分钟。将板放在三气 CO2 培养箱中，确保不要干扰在微井中颗粒的细胞，并孵育 24 至 30 小时，因为隔夜孵育不足以形成紧绷的胚胎体或 EBs。在37摄氏度的水浴中，5毫升人类PGCLC基质和20毫升人类PGCLC的洗净介质完成至少5分钟，小心地将40微米孔径的细胞过滤器倒置在50毫升聚丙烯锥形管上。要从微井中分离 MB，请轻轻移液板的每个井。要去除未纳入 EBs 的细胞，请通过细胞滤株过滤所有孔的内容。用1毫升预热人类PGCLC基质轻轻清洗留在细胞滤株膜上的ERB，并重复洗涤五次。将一个新鲜的 50 毫升锥形管放在细胞过滤器上，使细胞过滤器现在位于新管的右侧。快速将细胞滤株与新管反转，该管将 EB 放在细胞滤株膜下方。将18毫升预热人类PGCLC完整介质加入细胞滤株膜，收集锥形管中的ERB。然后，板3毫升每孔悬浮的EBs到低附六孔板的井。将板放在三气培养箱中的跷跷板移动摇杆上，并小心地将摇速设置为每分钟约 20 圈。在实验的第7天到第13天，每天新鲜准备20毫升的人类PGCLC完成介质。从摇杆上拆下板，使 EB 沉入井底。在不干燥 EBs 的情况下去除旧介质，使每井中保留约 0.2 毫升的旧介质。每天去除旧介质后，每井添加3毫升新鲜人类PGCLC完整介质。要将人类PGCLC识别为OTC4阳性细胞，将ERB收获至1.5毫升低结合微离心管。让 EB 在室温下沉入底部，然后丢弃介质。用冰 1X PBS 冲洗 MB。取出PBS后，在1毫升的冰冷1%重量中孵育EBs，用PBS中量的亚兹德钠孵育5分钟。让 EB 在室温下沉入底部。丢弃上清液后，用冰冷的 PBS 冲洗 MB。在冰上解冻200微升细胞外基质蛋白。将蛋白质加入含有EBs的管子。将管在室温下保持约 10 分钟，直到凝胶凝固，并嵌入 EB。要修复 EBs，在 PBS 中加入 1 毫升 4%甲醛，并在室温下用轻轻摇动孵育 15 分钟。之后，丢弃甲醛，用冰冷的PBS冲洗一次EBs。加入1毫升70%乙醇。在 4 摄氏度下储存 70%乙醇长达一周，或使用标准的 FFPE 协议进行处理。每一个井的细胞密度和细胞均匀分布至关重要。2毫升Y27632的人类IPSC在6井板每井补充介质，24小时后达到20至30%的汇合。在 mTeSR1 培养基中再培养 24 小时后，在没有 Y27632 的情况下，细胞聚集并形成菌落，约占生长面积的 30%。在4i重新编程培养基中24小时培养后，细胞达到汇合。在4i培养基中再培养24小时后，细胞变得更密集。在4i重新编程介质中的微孔中孵育24小时后，细胞在接种后24至30小时内形成其圆形轮廓可见的EBs。EBs保持在人类PGCLC介质中，在无硬性条件下，在24小时后保持球形，无聚合。192小时后，MB更大，保持相同的形态。5天后，细胞出现为T十年，在EBs表面表达细胞，8天后增加细胞数量。人类PGCLC单细胞悬浮细胞被FACS丰富为CD38阳性细胞。不表达 CD38 的细胞是阴性对照。为避免污染，FACS 门 CD38 阳性和 CD38 阴性细胞被大范围分离。在尝试此过程时，遵循精确细胞计数和介质变化的时间非常重要。省略介质变化，甚至一天，或减少该介质的体积在任何步骤，可能会导致大量的细胞死亡。胚胎体摇摆培养的速度必须仔细优化。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

从诱导多能干得出视网膜色素上皮（RPE）（IPS），由胚体大小不同的细胞

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

科研

发育生物学

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

集成的无人类诱导多能干细胞的生成方法头发衍生角质形成细胞

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

树突棘从锥体神经元的三维定量从人类诱导多能干细胞衍生

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

从人外周T细胞无饲养条件下，使用仙台病毒诱导多能干细胞的生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

从人黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞诱导多能干细胞的产生

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

从血细胞使用仙台病毒和离心诱导多能干细胞代

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

从人体外周血单个核细胞融合，无诱导多能干细胞的生成方法游离型载体

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

界定和由人多能干细胞的肝细胞样细胞的可扩展代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

人诱导多能干细胞的前脑型脑 Organoids 标准化和可再生性的生成

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

人多潜能干细胞第一心场样心脏祖细胞和心室样细胞的生成

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...