Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi anerkender Shiomi Yawata og Chie Owa til teknisk bistand under indledende undersøgelser. Denne undersøgelse blev støttet af NIEHS/NIH tilskud R01 ES023316 og R21ES024861 til TS, og stewardesse Medical Research Institute (FAMRI) tilskud til JHH.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Robust produktion af hPGCLCs ved hjælp af protokollen beskrevet her blev bekræftet med tre uafhængige kloner af menneskelige iPSCs med normal diploide karyotype10. Disse iPSC kloner var afledt af den samme neonatal dermal menneskehud fibroblast celle kultur10. De vil blive leveret af forfatterne til denne artikel til efterforskere efter anmodning og under passende materialer overførsel aftale og shipping arrangement af frosne levende menneskeceller. Det er i øjeblikket uvist om hvorvidt normale karyotype er nødvendige for robust hPGCLC produktion ved hjælp af vores protokol eller dem, der indberettes af andre laboratorier.
Nylige undersøgelser har vist, at produktionen af hPGCLCs fra hiPSCs11 eller europæiske sektorråd14 ved hjælp af en protokol, der er beskrevet af Saitous gruppe af Kyoto University8 er afhængig af udtryk for EOMESODERMIN, kræves en T-box transkriptionsfaktor for Induktion af SOX17. SOX17 synes at fungere som master slægt afgørende transskription faktor i kønscelleoverførsel differentiering af humane pluripotente stamceller6. EOMESODERMIN er kodet af genet EOMES og CRISPR/Cas9 knockout af EOMES forårsaget næsten komplet fravær af SOX17 induktion i hPGCLC producerer betingelse11og udtryk for andre gener fulgt det samme mønster af den SOX17-null knockout celler. Overekspression af EOMESODERMIN fra en inducerbar vektor i EOMES-null knockout celler under hPGCLC induktion kultur effektivt reddet den robuste hPGCLC produktion samt induktion af kønscelleoverførsel gener, herunder SOX17. Derimod induceret overekspression SOX17 også reddet de robuste PGCLC produktion, men uden at fremkalde EOMES. Således, EOMESODERMIN er en kritisk opstrøms inducer af SOX17, og dette synes enkelt vigtigste rolle EOMESODERMIN i hPGCLC induktion fra humane pluripotente stamceller. Vores protokol inducerer SOX17 i hiPSCs10, men dens afhængighed af EOMESODERMINE induktion venter skal fastlægges.
Denne protokol konverterer primet pluripotency menneskelige iPSCs fastholdt i mTeSR1 medium til ERK-uafhængig naive pluripotency for 96 timer i 4i omprogrammering medium6, som er en modificeret naive menneskelige stamceller medium (NHSM)5. Vores forsøg på at generere hPGCLCs begyndende med de samme menneskelige iPSC kloner, men fastholdt i andre kommercielt tilgængelige menneskelige iPSC vækst medier før kultur i 4i omprogrammering medium resulterede i varierende grader af lavere hPGCLC udbytter. Selv om langsigtede tilpasning i andre medier forbedrer hPGCLC produktion eller ikke forbliver bestemmes i fremtidige undersøgelser, denne bemærkning tyder på, at nøjagtige tilstand af den PRIMES pluripotency af menneskelige iPSCs før 4i omprogrammering betydeligt nedslag EB dannelse i 4i medium og EB differentiering i hPGCLC medium.
Produktion af hPGCLCs fra hiPSCs efter vores protokol er robust og meget reproducerbar, dels på grund af brugen af de microwell plader, der giver effektiv produktionen af et stort antal EBs (~ 8.000 EBs pr. batch) med en ensartet størrelse (3.000 hiPSCs pr. EB). Antallet af EBs let produceret i en enkelt batch af eksperiment ved hjælp af vores protokol kan være langt større end metoder med regelmæssig U-nederste celle kultur brøndene. Produktion af et stort antal lige store EBs ensartet spækket med hPGCLCs kan give unikke muligheder for høj overførselshastighed kemiske screeninger til at identificere små molekylvægt aktivatorer eller påvirker PGC specifikation-hæmmere eller deres biologiske egenskaber såsom epigenetiske omprogrammering. Sådanne EBs kan også være nyttigt for toksikologiske vurderinger af stort antal kønscelleoverførsel celle giftige stoffer, herunder ikke kun miljøforurenende stoffer, men også klinisk ordineret medicin såsom kemoterapeutika.
De kritiske faktorer af robust og reproducerbare produktion af hPGCLCs ved hjælp af præsenteres protokollen omfatter (i) anvendelse af sunde hiPSCs fastholdt i mTeSR1 på ekstracellulære matrix protein, (ii) til podes nøjagtige antal celler som angivet og strengt Følg tider af medium forandring og subkultur, (iii) at vælge en god masse humane rekombinante BMP4, og (iv) at minimere fysiske skader af EBs under den vuggende kultur. Det er vores erfaring, at den bedste masse BMP4 reagens arbejdede ved 100 ng/mL koncentration, mens andre masse BMP4 reagenser kræves 2 X eller større doser. På anden side udbyttet af hPGCLCs produktion ved hjælp af den bedste masse BMP4 snarere faldt ved højere doser af BMP4 (fx 200 ng/mL). Vi anbefaler at teste flere forskellige masser af rekombinant human BMP4 reagenser fra flere leverandører af deres ydeevne ved at støtte hPGCLC generation og sikre en stor mængde af de bedste parti.
En unik feature i vores hPGCLC protokol er at hPGCLCs er lokaliseret på den yderste overflade lag af EBs10 (figur 8), mens andre protokoller kan generere hPGCLCs i midten af cellen aggregater6,8. Embryoid organer har tendens til at danne flere adskilte lag som overflade, yderstof, indre shell og kerne, og regionerne central kerne er ofte nekrotisk på grund af begrænsede udbud af næringsstoffer, ilt, samt pro-overlevende vækstfaktorer forudsat form kultur medium af diffusion20. Lokalisering af hPGCLCs på overfladen af EBs uden mulige begrænsninger på grund af begrænset udbredelse mod center EBs kan være gavnligt for direkte, tid - og dosis-kontrollerede eksponering af hPGCLCs stoffer eller giftige stoffer for farmakologiske eller toksikologiske undersøgelser.
Der henviser til, at mus PGCLCs Vis robust genome-wide DNA demetylering involverer prægning styre regioner i det mindste delvis synes7,19,20, graden af globale gDNA demetylering i hPGCLCs svagere end mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler tyder på, at hPGCLCs kan ligne en tidligere fase af embryonale PGCs end mus PGCLCs10. Det er blevet rapporteret, at langvarig kultur af EBs under betingelse af hPGCLC produktion forårsaget en øget grad af gDNA demetylering7; men om en længere periode med kultur af hPGCLCs i EBs eller som isolerede celler kan opnå mere fremskredne stadier af kønscelleoverførsel differentiering skal bestemmes ved fremtidige undersøgelser.

Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for alle kønscelleoverførsel celler i begge køn. De fleste af vores viden om udvikling af PGCs i pattedyr embryoner er opnået gennem at studere laboratorium mus1,2. Embryonale dag 6.0-6.5 i mus embryoner, er 6 eller lignende mindre antal PGC prækursorer placeret i epiblast, og en stiftende befolkning på ~ 40 PGCs er induceret fra dem på en måde, der er afhængige af ben morfogenetiske proteiner, Bmp2 og Bmp4 udskilles fra tilstødende celler. De tidligste menneskelige PGCs hidtil identificeret i embryoner blev på endodermal væggen af blommesækken på omkring slutningen af den tredje uge af drægtigheden3. Fordi dette er det samme sted som overflytter PGCs er observeret i mus embryoner, er det sandsynligt, at de observerede menneskelige PGCs var i vejen for migration, men ikke den stiftende befolkning. Men undersøgelser sporing tilbage tidligere stadier af PGCs eller PGC prækursorer i menneskelige embryoner har manglet.
Adgang til menneskelige embryonale PGCs er udfordrende på grund af både tekniske og etiske forhindringer. For at overvinde disse forhindringer, har PGC-lignende celle kultur modeller været for nylig genereret fra humane pluripotente stamceller (PSC). Pluripotency er den cellulære evne til at differentiere i genom og tre embryonale kønscellers lag4. Der henviser til, at menneskers PSC'er vedligeholdes i mTeSR1 medium (en klar-til-brug, kommercielt tilgængelige medium formuleret til vedligeholdelse af menneskelige PSC'er i tilstanden PRIMES pluripotency) på retter belagt med det ekstracellulære matrix protein har PRIMES-state pluripotency 4, i 2013 Jacob Hanna lab viste at PRIMES pluripotency celler kan konverteres til en naiv pluripotency tilstand ved at udsætte til det naive menneskelige stamceller medium (NHSM) der indeholder kemiske hæmmere til protein kinaser ERK1/2, GSK3, LUCY, ROCK, PKC, og p38 MAPK samt vækstfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Fra de naive-pluripotency menneskelige PSC'er, i 2015 gennemført en forskningsgruppe ledet af Hanna og Azim Surani første robust produktion af humane PGC-Like celler (hPGCLCs) fra PSC'er6. Senere, rapporteret flere andre laboratorier, herunder vores, generation af hPGCLCs fra kvikskrankerne ved hjælp af lidt forskellige protokoller7,8,9,10. Vores undersøgelse fremlagt bevis for at hPGCLCs genereret ved hjælp af forskellige protokoller (som er opsummeret i tabel S1 af vores tidligere offentliggjort undersøgelse10) er transcriptomally ligner hinanden10. Foreliggende beviser understøtter ligheden af menneskelige PGCLCs til nyuddannede menneskelige embryonale PGCs før den globale epigenetiske erasure7 og/eller kemotaktisk migration10.
Undersøgelser af mus embryonale PGCs, mus PGCLCs og menneskelige PGCLCs (men med kun meget begrænset adgang til menneskelige PGCs) har afsløret at molekylære mekanismer af PGC specifikation afviger betydeligt mellem mus og menneskelige1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. For eksempel, Prdm14 spiller vigtige roller i PGC specifikation i mus embryoner, men dens rolle i menneskelig PGC specifikation synes begrænset1,15. Derimod er induktion af SOX17 af EOMESODERMIN afgørende for PGC specifikation6,11,14, boer disse transkriptionsfaktorer synes undværes for musen PGC specifikation15. Disse første resultater af undersøgelser med hPGCLCs kraftigt støtter betydningen af denne celle kultur model som en surrogat af menneskelige embryonale PGCer.
Nyligt offentliggjorte undersøgelser, der involverer vores lab dyb sekventering evaluering af genomisk DNA kopi nummer analyse, har vist, at langvarig vedligeholdelse af PSC'er i tilstanden naive pluripotency betydeligt øger risikoen for kromosomale ustabilitet og strukturelle misdannelser. Dette fænomen blev observeret med både mus18 og menneskelige19 PSC'er. Den oprindelige hPGCLC produktion protokol rapporteret af Hanna/Pacôme blev udviklet til menneskelige PSC'er vedligeholdes i 4i naive pluripotency medium for mindst 2 uger6. For at bevare den normale diploide karyotype menneskelige PSC'er og PGCLCs, udviklede vi en modificeret protokol som menneskelige kvikskranker er udsat for 4i medium for kun 72 timer10, som er fremlagt i denne artikel. Menneskelige iPSCs (hiPSCs) vedligeholdes under PRIMES pluripotency staten. Umiddelbart før EB dannelse inkuberes cellerne i 4i naive omprogrammering medium (en modificeret NHSM medium) i 48 timer. Celler er derefter adskilles og pakket ind i microwells til at danne EBs et ekstra døgn i 4i medium. EBs er fastholdt i hPGCLC induktion medie som indeholder en høj koncentration af rekombinant human BMP4 under en vuggende betingelse for ikke-attachment kultur i op til 8 dage at få det maksimale udbytte af hPGCLCs. Efter 8 dages EB kultur, kan hPGCLCs være isoleret fra dissocierede EB celler af FACS som CD38 + celler med op til ~ 40% udbytte i FACS-sorterbare enkelt cellesuspension. Mens andre offentliggjort generere metoder7,8,9, herunder den originale protokol før vores ændringer6, typisk hPGCLCs i spontant dannede celle aggregater uden specifik lokalisering, hPGCLC produceret af vores protokol er observeret på overfladen af embryoid organer (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for alle kønscelleoverførsel celler. I mus embryoner, er en stiftende befolkning på ~ 40 PGCs induceret fra pluripotente epiblast celler af orkestreret engagementer med cytokiner, herunder ben morfogenetiske proteiner 4 (Bmp4). I menneskelige embryoner, de tidligste PGCs er blevet identificeret på endodermal væggen af blommesækken omkring slutningen af 3rd uge af drægtigheden, men lidt er kendt om processen med menneskelige PGC specifikation og deres tidlige udvikling. For at omgå de tekniske og etiske barrierer for at studere menneskelige embryonale PGCs, har surrogat celle kultur modeller været for nylig genereret fra pluripotente stamceller. Her beskriver vi en 13-dag protokol for robust produktion af humane PGC-Like celler (hPGCLCs). Menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) vedligeholdes i tilstanden PRIMES pluripotency er udruget i 4i naive omprogrammering medium for 48 timer, dissocieres til enkelt celler og pakket ind i microwells. Langvarig vedligeholdelse af hiPSCs i den naive pluripotency stat forårsager betydelig kromosomforandringer og bør undgås. hiPSCs i microwells vedligeholdes for en yderligere 24 timer i form embryoid organer (EBs), som derefter 4i mellemlang kulturperler i lav-overholdelse af plasticware under en vuggende tilstand i hPGCLC induktion medie som indeholder en høj koncentration af rekombinant human BMP4. EBs er yderligere kulturperler i op til 8 dage i den vuggende, ikke-tilhænger betingelse for at opnå maksimalt udbytte af hPGCLCs. HPGCLCs registreres som immunhistokemi, let som celler kraftigt udtryk for OCT4 i næsten alle EBs udelukkende på deres overflade. Da EBs er enzymatisk adskilles og underkastes FACS berigelse, hPGCLCs kan afhentes som CD38 + celler med op til 40-45% udbytte.

Microwell pladen benyttes her er i formatet 24-godt og har 8 boringer holding microwell plader, hvoraf hver støtter dannelsen af op til 1.200 EBs. Fra ca. 24 millioner af 4i naive pluripotency celler, denne microwell plade typisk genererer ~ 8.000 EBs bestående af ~ 3.000 celler pr. EB. Under ikke-tilhænger kultur af EBs med konstant vuggende, antallet af intakt EBs gradvist aftager på grund af spontane selv demontering, og ~ 3.000 EBs overleve indtil dag 13 i protokollen. De fleste af disse overlevende EBs har 50-200 hPGCLCs på deres overflade (anslået af immunhistokemisk påvisning af OCT4 + celler i serie sektioner af EBs, se figur 8), hvilket giver ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs i alt. Enzymatisk nedbrydning af EBs i enkelte celler er en relativt ineffektive proces, reducere udbyttet af FACS-beriget CD38 + hPGCLCs til 9.000-47.000 celler. I vores hænder var gennemsnitligt seks uafhængige, men på hinanden følgende partier af eksperimenter 14,038 ± 5,731 (mener ± SEM). Fordi CD38-negative EB celler celler express OCT4 mRNA (qPCR) eller protein (Immunhistokemi) kun meget svagt, hvis ikke helt fraværende, alle EB celler kraftigt udtryk for OCT4 protein er næsten svarer til hele befolkningen i CD38 + hPGCLCs.
Den kritiske parameter i denne protokol indeholder celle tæthed. Når 2.0 x 105 menneskelige iPSCs podes i en ekstracellulære matrix protein-coated godt af 6-godt celle kultur plade (9,60 cm2 vækstområde pr. brønd) med 2 mL Y27632-suppleret medium (2.2.9), celler vil nå til omkring 20-30% confluency på 24 timer efter podning (figur 1). Efter en yderligere 24-timers kultur i mTeSR1 medium i mangel af Y7632, celler samlede og form kolonier, besætter ~ 30% af den vækst (figur 2). Celler er derefter kulturperler i 4i omprogrammering medium (2.3.2). Efter 24 timer af kultur i 4i medium, celler blive sammenflydende (figur 3). En yderligere 24-timers kultur på mellemlang og 4i gør cellerne tæt pakket (figur 4). Den præcise timing af medium forandring (hver 24 timer +/-4 timer) og celle tætheder er afgørende for vellykket dannelsen af EBs og hPGCLCs.
Efter 48-timers kultur i 4i medium, celler adskilles og podes til den microwell plade, som har wells 400 µm i størrelse (2.4). Selv om denne kommercielt tilgængelig microwell plade er belagt anbefales lav friktion af fabrikanten, frisk igen belægning med vaskemiddel (2.4.3) til at reducere risikoen for uønskede celle vedhæftning. 800 µm microwells resulteret i reduceret udbytte af hPGCLCs, hvilket tyder på betydningen af EB størrelse for korrekt instrueret differentiering. Celler podes i 4i medium vil danne EBs i microwells på 24-30 timer, som kan overholdes ved hjælp af en standard, omvendt fase kontrast mikroskop (figur 5). Cirkulær konturen af EBs bliver klart synlige på og efter 24 timers inkubation. Høst EBs på et tidligere tidspunkt (fx 16 timer efter podning) før deres cirkulære contour er klart synlig anbefales ikke, fordi sådanne EBs er meget sårbare over for mekaniske skader og let afmontere. Bemærk, at betydelige mængder af naive hiPSCs ikke er indarbejdet i EBs, som er normal. Disse personlige celler vil blive vasket væk før indledningen af vuggende kultur af EBs på lav-tilhænger overflade (2.5.2). Bemærk også, at EBs i vores protokol, der dannes i 4i naive pluripotency medium - ikke i hPGCLC medium. Før dannelsen af solid EBs i 4i medium før eksponering for hPGCLC medium er vigtig for fordeling af hPGCLCs på overfladen af EBs.
EBs vedligeholdes i hPGCLC medium under en vuggende, ikke-tilhænger kultur tilstand vil bevare deres kugleform uden sammenlægning eller fusion (figur 6 og figur 7). Alt for svage vuggende tilstand vil forårsage EB sammenlægning og fusion, men for hård tilstand vil afvikle EBs. Menneskelige PGCLCs fremstå som udtryk for OCT4 celler på overfladen af EBs efter så tidligt som den 5-dages kultur i hPGCLC medium, og deres antal øges indtil 8 dages kultur (figur 8). Yderligere inkubation af EBs kan medføre afvikling af EBs og tab af hPGCLCs. Menneskelige PGCLCs kan forbedres fra enzymatisk dissocierede EB celler efter 5-8 dage af kultur i hPGCLC medium af FACS som CD38 + celler (figur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figur 1: menneskelige iPSC cellekultur i Y27632-suppleret medium 24 timer efter podning. Celle densitet er omkring 20-30% sammenflydende. I nærværelse af ROCK hæmmer Y27632, celler har tendens til at sprede godt med lange, piglignende brudforlængelse. Skalalinjen = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figur 2: menneskelige iPSC cellekultur 48 timer efter podning. Celler samlede til form kolonier, besætter ~ 30% af vækstområde. Skalalinjen = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figur 3: menneskelige iPSC cellekultur inkuberes i 4i omprogrammering medie i 24 timer. Celler nå til confluency. Skalalinjen = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figur 4: menneskelige iPSC cellekultur inkuberes i 4i omprogrammering mediet i 48 timer. Konfluerende celler er tæt pakket. Skalalinjen = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figur 5: menneskelige iPSC EBs dannet i microwells efter 24 timers inkubation i 4i omprogrammering medium. Cirkulær konturen af EBs bliver synlige på 24-30 timer efter podning. Når konturerne er bekræftet under en fase kontrast mikroskop, EBs er klar til overførsel til en vuggende kultur tilstand. Skalalinjen = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figur 6: menneskelige iPSC EBs inkuberes i 24 timer på mellemlang og hPGCLC. EBs i høj grad bevare deres kugleform. Skalalinjen = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figur 7: menneskelige iPSC EBs inkuberes i 192 timer på mellemlang og hPGCLC. EBs er udvidet i forhold til deres udseende på 24-timers kultur, men de stadig i vid udstrækning opretholde sfæriske figurer uden sammenlægning eller fusion. Skalalinjen = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figur 8: menneskelige PGCLCs udtryk for OCT4 er lokaliseret på overfladen af hiPSC EBs inkuberes i 192 timer på mellemlang og hPGCLC. EBs blev integreret i ekstracellulær matrix protein og forarbejdet til FFPE dias immunhistokemisk farvning af OCT4 (DAB substrat). Skalalinjen = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figur 9: Menneskets PGCLCs er beriget fra enzymatisk dissocierede EB celler af FACS som CD38+ celler. Efter inkubation i hPGCLC medium for 5-8 dage, kan EBs adskilles ved enzymatisk fordøjelsen at forberede enkelt cellesuspension. hPGCLCs kan blive beriget som CD38+ celler ved FACS (røde prikker). EB celler, der ikke udtrykke CD38 (blå prikker) der bør også indsamles som negativ kontrol. FACS gates CD38-positive og CD38-negative celler skal adskilles med en bred margin (grønne prikker) at undgå kontaminering af hver type af celler. De øvre og nedre paneler viser FACS profiler uden eller med anti-CD38 antistof farvning, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for både sæd og æg. Menneskelige embryonale PGCs er angivet fra pluripotente epiblast celler gennem interaktioner af cytokiner. Her beskriver vi en 13-dag protokol af inducerende menneskeceller transcriptomally ligner PGCs på overfladen af embryoid organer fra PRIMES-pluripotency induceret pluripotente stamceller.

Generation af menneskelige primordiale kønsceller-lignende celler på overfladen af Embryoid organer fra primet pluripotency induceret pluripotente stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i det humane kønsceller toksikologi område, såsom hvordan skader i genomet af humane ur kimceller er skabt eller repareret. Den største fordel ved denne teknik er, at menneskelige ur kimceller kan genereres i to uger fra primet pluripotency iPS celler huser sygdom disposition genetisk baggrund. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod forebyggelse af genomisk svækkelse i humane kønsceller, fordi vores cellekultur model kan hjælpe os med at reducere kønsceller toksicitet af et terapeutisk lægemiddel.Til at begynde med generering af humane urkimcellelignende celler eller humane PGCLC'er klargør ekstracellulære matrixproteinbelagte plader og cellesuspension af humane iPSC'er som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en enkeltcellesuspension af primet pluripotency humane iPC'er i mTeSR1-mediet, der indeholder Y-27632 Rho kinase-hæmmeren. Juster omhyggeligt celletætheden til 100.000 celler pr. milliliter.Inokuler to milliliter cellesuspension af primede humane iPSC'er i hver brønd af det ekstracellulære matrixprotein, der er belagt med seks brøndsplader, og sørg for, at cellerne fordeles jævnt ved at ryste pladerne lodret og vandret. Inkuber pladerne i en CO2-inkubator med tre gas ved 37 grader Celsius. Det er meget vigtigt at vaccinere præcis 200.000 celler i hver brønd af en seks-brønd plade.Nøjagtig optælling af celler er kritisk. Efter afslutningen af den forbigående konvertering til naiv pluripotency, celler bør se over-sammenløb, hvilket er normalt. Nøjagtig timing af medium ændring er vigtigt at opnå høje menneskelige PGCLCs og eksperimentel reproducerbarhed.4i hiPSC-kulturens tæthed er høj under disse forhold, og det forventes, at cellen bliver sammenløbet ved 48 til 72 timer efter vaccination. 24 timer efter inokulering, ændre mediet med to milliliter pr brønd af mTeSR1 medium uden Y27632. Start konvertering af primet pluripotency tilstand menneskelige iCSCs til 4i naive pluripotente stamceller, ved at opvarme 50 milliliter 4i komplet medium i en 37 grader Celsius vandbad i 15 minutter.Ved 48 og 72 timer efter inokulering fjernes pladerne fra inkubatoren, og mediet ændres med 2 milliliter pr. brønd på 4i komplet medium. Centrifuge vaskemiddelbelagte mikroopgangsplade ved 1.000 g i fem minutter ved stuetemperatur. Undersøg brøndene med omvendt mikroskop for at sikre fraværet af luftbobler.Skyl brøndene som beskrevet i tekstprotokollen, og gentag centrifugering. Tilsæt 4i komplet medium til de skyllede brønde. Centrifuge pladen ved 1,000 g i fem minutter ved stuetemperatur, og efterse brøndene igen.For at indoere 4i humane iPC'er i mikrooptoklen skal human iPSC-cellesuspension forberedes som beskrevet i protokollen. Filtrer denne celle suspension gennem en 40 mikrometer pore størrelse celle si for at fjerne celle aggregater. Vask sieren med en milliliter forvarmtet 4i komplet medium tre gange for at indsamle alle cellerne fra sien, og tælle cellerne med en kulturtæller.Derefter fortyndes denne encelledefjedring af 4i naive humane iPSCs til 27 til 32,4 millioner celler i 9 milliliter forvarmt 4i komplet medium, der indeholder Y27632. Fjern tidligere tilberedt mikrooptegnelse indeholdende 1 milliliter 4i komplet medium pr. brønd fra en trigaskubvøse. Inokuler 1 milliliter 4i naiv menneskelig iPSC suspension i hver brønd, for at opnå en koncentration på 3,0 til 3,6 millioner celler pr brønd.Pipetter forsigtigt til jævnt distribuere cellerne. Centrifuge pladen ved 100 g i 3 minutter ved stuetemperatur. Anbring pladen i en CO2-inkubator med tre gas, og sørg for ikke at forstyrre celler, der er pelleteret i mikrobrønde, og inkuberes i 24 til 30 timer, da inkubationen natten er utilstrækkelig til dannelse af stramme embryonale kroppe eller EBs.Prewarm 5 milliliter human PGCLC basal medium og 20 milliliter human PGCLC komplet medium i mindst fem minutter i en 37 grader Celsius vandbad Forsigtigt placere en 40 mikrometer pore størrelse celle si på hovedet over en 50 milliliter polypropylen konisk rør. For at frigøre EBs fra mikrobrønde, forsigtigt pipette hver brønd af pladen. For at fjerne celler, der ikke er indarbejdet i EBs, filtrere indholdet af alle brønde gennem cellestingen.Vask forsigtigt eBs bevaret på membranen af cellen si med 1 milliliter forvarmt humant PGCLC basal medium, og gentag vask fem gange. Anbet et friskt 50 milliliter konisk rør på cellestingen, så cellestingen nu er placeret højre side op i det nye rør. Hurtigt vende celle si med det nye rør, som vil placere EBs under membranen af cellen si.Der tilsættes 18 milliliter forvarmt humant PGCLC komplet medium til membranen i cellestemnet for at indsamle EBs i det koniske rør. Derefter plade 3 milliliter pr brønd af suspensionen af EBs i brønde af en lav vedhæftet fil seks-brønd plade. Placer pladen på en vippe-move rocker i en tri-gas inkubator, og forsigtigt indstille vuggende hastighed på ca 20 omdrejninger i minuttet.På eksperimentets dag syv til 13 tilbereder de frisk 20 milliliter humant PGCLC komplet medium hver dag. Fjern pladen fra rocker, som vil gøre EBs synke til bunden af brøndene. Fjern det gamle medium uden at tørre EBs, så omkring 0,2 milliliter gamle medium forbliver i hver brønd.Tilføj 3 milliliter pr brønd af frisk menneskelige PGCLC komplet medium, efter fjernelse af den gamle medium hverdagen. For at identificere humane PGCLC'er som OCT4-positive celler skal eBs høstes til et 1,5 milliliter lavt binder mikrocentrifugerør. Lad EBs synke til bunden ved stuetemperatur, og kassér mediet.Skyl EBs med iskold 1X PBS. Efter fjernelse af PBS inkuberes EBs i 1 milliliter iskold 1%vægt i volumen natriumazid i PBS på is i fem minutter. Lad EBs synke til bunden ved stuetemperatur.Efter udsmid af supernatanten skylles EBs med iskold PBS. Tø 200 mikroliter af ekstracellulær matrixprotein på is. Tilsæt proteinet til det rør, der indeholder EBs.Lad røret ved stuetemperatur i ca. 10 minutter, indtil gelen er størknet, og eBs er indlejret. For at fastsætte EBs, tilsæt 1 milliliter 4% formaldehyd i PBS til røret, og inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter med blid rokkende. Derefter kasseres formaldehyd og eBs én gang med iskold PBS.Tilsæt 1 milliliter 70% ethanol. Opbevares i 70% ethanol ved 4 grader Celsius i op til en uge, eller fortsætte med at behandle dem med en standard FFPE protokol. Celletæthed og endda fordeling af celler på hver brønd er kritiske.Humane IPSCs i 2 milliliter Y27632 suppleret medium pr brønd af en seks-brønd plade, nå 20 til 30% sammenløb efter 24 timer. Efter en yderligere 24 timers kultur i mTeSR1-mediet, i mangel af Y27632, celler aggregerede og dannede kolonier, besætter ca 30% af vækstområdet. Efter 24 timers kultur i 4i omprogrammering medium, celler nået sammenløbet.Efter yderligere 24 timers kultur i 4i-mediet blev cellerne mere tætpakkede. Efter 24 timers inkubation i mikrobrønde i 4i omprogrammeringsmediet dannede cellerne EBs med deres cirkulære kontur synlig ved 24 til 30 timer efter inokulering. EBs holdt i det menneskelige PGCLC medium, under vuggende ikke-vedhæftige forhold, fastholdt deres sfæriske form uden sammenlægning efter 24 timer.Efter 192 timer var EBs større og fastholdt den samme morfologi. Efter 5 dage, cellerne opstod som OCT4 udtrykke celler på overfladen af EBs, øge deres antal efter 8 dage. Celler fra enkeltcellesuspension af humane PGCLC'er blev beriget som CD38-positive celler af FACS.Celler, der ikke udtrykker CD38, var negativ kontrol. For at undgå forurening blev FACS-gates CD38-positive og CD38-negative celler adskilt af en bred margen. Mens du forsøger denne procedure, det er vigtigt at følge nøjagtige celletælling og tidspunkter for medium forandring.Udeladelse medium ændring selv en enkelt dag, eller reducere mængden af dette medie på ethvert trin, kan forårsage massiv celledød. Hastigheden af embryoidkroppes klippekultur skal optimeres omhyggeligt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Følger retinale pigmentepitel (RPE) fra induceret Pluripotente Stem (IPS) Celler ved forskellige størrelser af embryoide legemer

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation af Integration-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller Brug Hair-afledte Keratinocytter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering af induceret pluripotente stamceller fra humane perifere T-celler Brug af Sendai Virus i Feeder-fri Betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation af induceret pluripotente stamceller fra human melanoma Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induceret Pluripotente Stem Cell Generation fra Blood Cells Brug Sendai Virus og Centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation af Integration-fri induceret pluripotente stamceller fra humane perifere mononucleære blodceller Brug episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation af første hjertet felt-lignende hjerte ophav og ventrikel-lignende Cardiomyocytes fra humane pluripotente stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...