Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Wij erkennen Shiomi Yawata en Chie Owa voor technische bijstand tijdens de aanvankelijke studies. Deze studie werd ondersteund door NIEHS/NIH grants R01 ES023316 en R21ES024861 naar TS, en toekenning van een stewardess medische Research Institute (FAMRI) aan JHH.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Robuuste productie van hPGCLCs met behulp van het protocol beschreven hier werd bevestigd met drie onafhankelijke klonen van menselijke iPSCs met de normale diploïde karyotype10. Deze iPSC-klonen waren afgeleid van de dezelfde menselijke neonatale dermale huid fibroblast cel cultuur10. Zij zal worden verstrekt door de auteurs van dit artikel aan onderzoekers op verzoek en onder de juiste materialen overdracht akkoord en verzending van de regeling van bevroren levende menselijke cellen. Het is momenteel onbekend weten of normale karyotype vereist is voor robuuste hPGCLC productie via onze protocol of die gemeld door andere laboratoria.
Recente studies hebben aangetoond dat de productie van hPGCLCs van hiPSCs11 of SER's14 met behulp van een protocol beschreven door Saitou de groep van Kyoto University8 afhankelijk van de expressie van EOMESODERMIN is, vereist een T-box transcriptiefactor voor inductie van SOX17. SOX17 lijkt te functioneren als de master bloedlijn transcriptiefactor bij germline differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen6bepalen. EOMESODERMIN is gecodeerd door de EOMES gen, CRISPR/Cas9 knockout van EOMES veroorzaakt bijna totale afwezigheid van SOX17 inductie in de productie van voorwaarde11hPGCLC en expressie van andere genen gevolgd hetzelfde patroon van de SOX17-null knock-out cellen. Overexpressie van EOMESODERMIN uit een afleidbare vector in de EOMES-null knock-out cellen tijdens hPGCLC inductie cultuur gered efficiënt de robuuste hPGCLC productie, alsmede de inductie van germline genen, met inbegrip van SOX17. Daarentegen geïnduceerde overexpressie SOX17 ook de robuuste PGCLC productie gered maar zonder EOMES. EOMESODERMIN is een kritische upstream inductor van SOX17 dus, en dit schijnt de enkele belangrijkste rol van EOMESODERMIN in hPGCLC-inductie van menselijke pluripotente stamcellen. Ons protocol induceert SOX17 in hiPSCs-10, maar haar afhankelijkheid van EOMESODERMINE inductie wacht op nader te bepalen.
Dit protocol converteert menselijke iPSCs primer-pluripotent gehandhaafd op de middellange mTeSR1 tot ERK-onafhankelijke naïef pluripotent voor 96 uur in de 4i herprogrammering middellange6, dat is een gemodificeerde naïef menselijke stamcellen medium (NHSM)5. Onze pogingen om het genereren van hPGCLCs beginnen met de dezelfde menselijke iPSC klonen, maar onderhouden in andere commercieel beschikbare menselijke iPSC groei media voordat cultuur in de 4i herprogrammering medium in verschillende gradaties van lagere rendementen van de hPGCLC resulteerde. Hoewel langerlopende aanpassing in andere media hPGCLC productie verbetert of niet blijft vastgesteld in toekomstige studies, deze constatering suggereert dat de exacte status van de primer pluripotent van menselijke iPSCs voordat de 4i herprogrammering aanzienlijk invloed EB vorming in het medium 4i en EB differentiatie in hPGCLC medium.
Productie van hPGCLCs van hiPSCs na ons protocol is robuust en zeer reproduceerbaar is, deels als gevolg van het gebruik van de microwell platen waarmee de efficiënte productie van een groot aantal EBs (~ 8000 EBs per batch) met een uniforme grootte (3000 hiPSCs per EB). Het aantal EBs gemakkelijk geproduceerd in één enkele batch van experiment met behulp van onze protocol mogelijk veel groter is dan de methoden met behulp van de gewone U-onderste cel cultuur putten. Productie van een groot aantal even formaat EBs uniform bezaaid met hPGCLCs kan bieden unieke mogelijkheden voor high-throughput chemical screenings om kleine-moleculair-gewicht activators of remmers PGC specificatie beïnvloeden te identificeren of hun biologische kenmerken zoals epigenetische herprogrammering. Dergelijke EBs kan ook nuttig zijn voor toxicologische beoordeling van grote aantallen germline cel toxische stoffen, met inbegrip van niet alleen milieuverontreinigende stoffen maar ook klinisch voorgeschreven medicatie zoals chemotherapeutische agenten.
De kritische factoren van de robuuste en reproduceerbare productie van hPGCLCs met het gepresenteerde protocol omvatten (i) het gebruik van gezonde hiPSCs in mTeSR1 op eiwit van de extracellulaire matrix, (ii) om te enten exacte aantal cellen zoals beschreven en strikt gehandhaafd Volg de tijdsinstellingen van middellange verandering en subcultuur, (iii) om te selecteren goed alot van menselijke recombinante BMP4, en (iv) tot een minimum beperken van fysieke schade van EBs tijdens de rockende cultuur. Het is onze ervaring dat de beste partij van BMP4 reagens bij 100 ng/mL concentratie, gewerkt terwijl andere veel BMP4 reagentia 2 X of meer doses vereist. Aan de andere kant, de opbrengst van de hPGCLCs productie met behulp van de beste partij van BMP4 eerder bij hogere doseringen van de BMP4 daalde (bijvoorbeeld 200 ng/mL). Het is raadzaam om te testen verschillende percelen van recombinante menselijke BMP4 reagentia verkregen van meerdere leveranciers voor hun prestaties in de ondersteuning van hPGCLC generatie en teneinde een grote hoeveelheid van de beste partij.
Een uniek kenmerk van ons hPGCLC-protocol is dat hPGCLCs zijn gelokaliseerd op de buitenste oppervlakte laag van EBs10 (Figuur 8), terwijl andere protocollen hPGCLCs in het midden van de cel aggregaten6,8 genereren kunnen. Embryoid organen de neiging om meerdere verschillende lagen zoals oppervlak, buitenste schil, binnentent en kern vormen, en de centrale kern regio's zijn vaak necrotische vanwege het beperkte aanbod van voedingsstoffen, zuurstof, evenals pro-overlevende groeifactoren bedoelde formulier de cultuur medium door diffusie20. Lokalisatie van hPGCLCs op het oppervlak van EBs zonder mogelijke beperkingen als gevolg van de beperkte diffusie naar het centrum van EBs kan gunstig zijn voor directe, tijd - en dosis-gecontroleerde blootstelling van hPGCLCs aan drugs of giftige stoffen voor farmacologische of toxicologisch onderzoek.
Overwegende dat de muis PGCLCs Toon robuuste genoom-brede DNA demethylatie waarbij de inprenting regio's ten minste deels controle lijkt7,19,20, de mate van wereldwijde gDNA demethylatie in hPGCLCs zwakker dan muis PGCLCS of PGCs6,7. Transcriptomal profielen suggereren dat hPGCLCs kan lijken op een eerder stadium van de embryonale PGCs dan muis PGCLCs10. Er werd gemeld dat langdurige cultuur van EBs onder de voorwaarde van hPGCLC productie een verhoogde mate van gDNA demethylatie7 veroorzaakt; of een langere periode van cultuur van de hPGCLCs in EBs of als geïsoleerde cellen meer gevorderde stadia van germline differentiatie kan bereiken moeten echter worden bepaald door toekomstige studies.

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijke precursoren van alle germline cellen in beide geslachten. De meeste van onze kennis over de ontwikkeling van PGCs in zoogdieren embryo's is verkregen door het bestuderen van laboratorium muizen1,2. Ten embryonale dage 6.0-6.5 van muis embryo's, bevinden 6 of soortgelijke kleine aantallen PGC precursoren zich in de epiblast, en een oprichtende bevolking van ~ 40 die pgcs worden veroorzaakt van hen op een wijze afhankelijk van bot morfogenetische eiwitten Bmp2 en uitgescheiden door aangrenzende Bmp4 cellen. De vroegste menselijke PGCs tot nu toe geïdentificeerd in embryo's werden op de endodermal muur van de dooierzak op rond het einde van de derde week van de dracht3. Omdat dit dezelfde plaats zoals migreren PGCs worden waargenomen in muis embryo's, is het waarschijnlijk dat de waargenomen menselijke PGCs in het pad van migratie, maar niet de oorspronkelijke bevolking waren. Echter bestudeert traceren terug eerdere fasen van PGCs of PGC precursoren in menselijke embryo's hebben gemist.
Toegang tot menselijke embryonale PGCs is uitdagend als gevolg van zowel ethische als technische obstakels. Om te overwinnen van deze hindernissen, zijn PGC-achtige cel cultuur modellen onlangs gegenereerd van menselijke pluripotente stamcellen (PSC's). Pluripotent is de cellulaire mogelijkheid om te differentiëren in de kiemcellen en drie embryonale kiem lagen4. Overwegende dat de menselijke PSC's bijgehouden in het mTeSR1 medium (een kant-en-klare commercieel verkrijgbare medium geformuleerd voor onderhoud van menselijke PSC's in de primer pluripotent) op gerechten bekleed met de extracellulaire matrix eiwitten hebben primer statuswaarden pluripotent 4, in 2013 Jacob Hanna's lab bleek dat de primer pluripotent cellen kunnen worden omgezet in een naïef pluripotent staat door bloot aan het naïef menselijke stamcellen medium (NHSM) met chemische inhibitoren aan eiwit kinases ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, p38 MAPK alsmede groeifactoren LIF, TGF, bFGF5. Van de naïeve-pluripotent menselijke PSC, in 2015 bereikt een onderzoeksgroep onder leiding van Hanna en Azim Surani de eerste robuuste productie van menselijke PGC-Like cellen (hPGCLCs) van PSC's6. Later gemeld verschillende andere laboratoria, met inbegrip van onze generatie van hPGCLCs van de PSC's met behulp van enigszins verschillende protocollen7,,8,,9,10. Onze studie aangetoond dat hPGCLCs gegenereerd met behulp van verschillende protocollen (die zijn samengevat in tabel S1 van onze eerder gepubliceerde studie10) transcriptomally vergelijkbaar met elkaar10 zijn. Beschikbare bewijs ondersteunt de gelijkenis van menselijke PGCLCs te vroeg stadium menselijke embryonale PGCs voorafgaand aan de wereldwijde epigenetische uitwissing7 en/of Chemotactische migratie10.
Studies van muis embryonale PGCs, muis PGCLCs en menselijke PGCLCs (maar met enige zeer beperkte toegang tot menselijke PGCs) is gebleken dat de moleculaire mechanismen van PGC specificatie aanzienlijk tussen muis en menselijke1,6verschillen, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Bijvoorbeeld, Prdm14 speelt belangrijke rol in de specificatie van de PGC te plaatsen in muis embryo's, maar zijn rol in menselijke PGC specificatie lijkt beperkt1,15. In tegenstelling, is inductie van SOX17 door EOMESODERMIN essentieel voor PGC specificatie6,11,14, overwegende dat deze transcriptiefactoren overbodig voor muis PGC specificatie15 lijken. Deze initiële resultaten van studies met hPGCLCs sterk ondersteunen het belang van deze cel cultuur model als een surrogaat voor menselijke embryonale PGCs.
Onlangs gepubliceerde studies, waarbij onze lab diepe sequencing evaluatie van genomic DNA kopie nummer analyse, hebben aangetoond dat langdurig onderhoud van PSC's in de naïeve pluripotent Braziliaanse aanzienlijk het risico van chromosomale instabiliteit verhoogt en structurele afwijkingen. Dit verschijnsel werd waargenomen met zowel muis18 en menselijke19 PSC's. Het oorspronkelijke hPGCLC productie protocol gerapporteerd door Hanna/Surani werd ontwikkeld voor menselijke PSC's gehandhaafd in het 4i naïef pluripotent medium voor ten minste 2 weken,6. Voor het behoud van het normale diploïde karyotype van menselijke PSC's en PGCLCs, ontwikkelden we een gewijzigde protocol waarin menselijke PSC's worden blootgesteld aan het medium 4i voor slechts 72 uur10, die in dit artikel wordt gepresenteerd. Menselijke iPSCs (hiPSCs) worden gehandhaafd onder de primer pluripotent staat. Onmiddellijk voorafgaand aan de vorming van de EB, cellen worden ge¨ uncubeerd in het 4i naïef herprogrammering medium (een gemodificeerde NHSM medium) 48 uur. Cellen worden dan losgekoppeld en verpakt in microwells aan vorm EBs voor een aanvullende 24 uur in het 4i medium. EBs worden bijgehouden in hPGCLC inductie opslagmedium met een hoge concentratie van recombinante menselijke BMP4 onder een rockende voorwaarde voor neen-gehechtheid cultuur voor tot 8 dagen voor de maximale opbrengst van hPGCLCs. Na 8-daagse EB cultuur, kunnen hPGCLCs worden geïsoleerd van gedissocieerde EB cellen door FACS zoals CD38 + cellen met korting tot ~ 40% in FACS-sorteerbare eencellige suspensie rendement. Overwegende dat andere gepubliceerd methoden7,8,9, met inbegrip van het oorspronkelijke protocol vóór onze wijzigingen6, genereren meestal hPGCLCs in spontaan opgemaakte cel aggregaten zonder specifieke lokalisatie, hPGCLC geproduceerd door ons protocol worden waargenomen bij het oppervlak van embryoid instanties (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijke precursoren van alle kiemcellen-cellen. In muis embryo's, een stichtende bevolking van ~ 40 PGCs veroorzaakt uit pluripotente epiblast cellen georkestreerde blootstelling aan cytokines, met inbegrip van bot morfogenetische eiwit 4 (Bmp4). In menselijke embryo's, de vroegste PGCs geconstateerd op de endodermal muur van de dooierzak rond het einde van de 3rd -week van de zwangerschap, maar er is weinig bekend over het proces van menselijke PGC specificatie en hun vroege ontwikkeling. Om te omzeilen van de technische en ethische grenzen van menselijke embryonale PGCs studeren, hebben surrogaat cel cultuur modellen onlangs verkregen uit pluripotente stamcellen. Hier beschrijven we een 13-daagse protocol voor robuuste productie van menselijke cellen van de PGC-Like (hPGCLCs). Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in de primer pluripotent staat gehandhaafd worden geïncubeerd in de 4i naïef herprogrammering medium voor 48 uur losgekoppeld aan afzonderlijke cellen en verpakt in microwells. Langdurig behoud van hiPSCs in de naïeve pluripotent Braziliaanse veroorzaakt aanzienlijke chromosoomafwijkingen en moet worden vermeden. hiPSCs in de microwells worden gehandhaafd voor een aanvullende 24 uur in de 4i middellange tot formulier embryoid organen (EBs), die vervolgens gekweekt in lage-adherentie plasticware onder een rockende voorwaarde in de hPGCLC inductie opslagmedium met een hoge concentratie van recombinante menselijke BMP4. EBs worden verder gekweekt voor maximaal 8 dagen in de rockende, niet-aanhanger voorwaarde te verkrijgen van de maximumgehaltes van hPGCLCs. HPGCLCs worden door immunohistochemistry, gemakkelijk gedetecteerd als cellen sterk uiting te geven aan OCT4 in bijna alle EBs uitsluitend op hun oppervlak. Wanneer EBs enzymatisch losgekoppeld en onderworpen aan FACS verrijking, hPGCLCs kunnen worden verzameld als CD38 + cellen met korting tot 40-45% opleveren.

De plaat van de microwell die hier gebruikt is in de notatie 24-well en heeft 8 putten houden de microwell bladen, elk waarvan vorming van maximaal 1.200 ondersteunt EBs. Van ongeveer 24 miljoen 4i naïef pluripotent cellen, genereert deze microwell plaat meestal ~ 8000 EBs bestaande uit ~ 3.000 cellen per EB. Tijdens niet-aanhanger cultuur van EBs met constante rockende, het aantal intact EBs geleidelijk afneemt als gevolg van spontane zelf ontmanteling en ~ 3.000 EBs overleven tot dag 13 van het protocol. De meeste van deze EBs te overleven hebben 50-200 hPGCLCs op hun oppervlakte (geschat door immunohistochemische detectie van OCT4 + cellen in seriële secties van EBs; Zie Figuur 8), opbrengst van 100.000 ~ OCT4 + hPGCLCs in totaal. Enzymatische vertering van EBs in afzonderlijke cellen is een relatief inefficiënt proces, vermindering van de opbrengst van FACS verrijkte CD38 + hPGCLCs tot 9.000-47,000 cellen. In onze handen was een gemiddelde van zes onafhankelijke, maar opeenvolgende batches van experimenten 14,038 ± 5,731 (bedoel ± SEM). Omdat CD38-negatieve EB cellen cellen express OCT4 mRNA (qPCR) of eiwit (immunohistochemie) slechts zeer zwak, zo niet helemaal afwezig, alle EB cellen sterk uiting van OCT4 eiwit zijn vrijwel gelijk aan de gehele bevolking van de CD38 + hPGCLCs.
De kritische parameter van dit protocol bestaat uit celdichtheid. Wanneer 2.0 x 105 menselijke iPSCs zijn geënt in een extracellulaire matrix eiwitten-bedekt goed van 6-well cel cultuur plaat (9.60 cm2 groeigebied per putje) met 2 mL Y27632-aangevuld medium (2.2.9), cellen zal bereiken tot ongeveer 20-30% op 24 confluency uren na inoculatie (Figuur 1). Na een aanvullende 24-uurs cultuur in het medium van de mTeSR1 in de afwezigheid van Y7632, cellen statistische en formulier kolonies, bezetten ~ 30% van de oppervlakte van de groei (Figuur 2). Cellen worden vervolgens gekweekt in het 4i herprogrammering medium (2.3.2). Na 24 uur van de cultuur in de 4i middellange, cellen worden heuvels (Figuur 3). Een aanvullende 24-uurs cultuur in het medium 4i maakt cellen dichtbevolkte verpakt (Figuur 4). Het exacte tijdstip van middellange verandering (elke 24 uur +/-4 uur) en cel dichtheid zijn van cruciaal belang voor succesvolle vorming van EBs en hPGCLCs.
Na 48 uur cultuur in het medium 4i, zijn cellen losgekoppeld en geënt op de microwell plaat, die wells 400 µm in grootte (2.4 heeft). Hoewel deze verkrijgbare microwell plaat is gecoat voor wordt lage wrijvingscoëfficiënt door de fabrikant, verse opnieuw coating met wasmiddel (2.4.3) aangeraden om het risico van ongewenste cel adhesie. 800 µm microwells resulteerde in een lagere opbrengst van hPGCLCs, hetgeen wijst op het belang van EB grootte voor goed gerichte differentiatie. Cellen geënt op de middellange 4i zal EBs vormen in microwells op 24-30 uur, die kan worden waargenomen met behulp van een standaard, omgekeerde fasecontrastmicroscoop (Figuur 5). De ronde contouren van EBs worden duidelijk zichtbaar bij en na 24 uur incubatie. EBs oogsten in een eerder stadium (bijvoorbeeld 16 uren na inoculatie) voordat hun circulaire contour duidelijk zichtbaar is wordt niet aanbevolen omdat dergelijke EBs zijn zeer kwetsbaar voor mechanistische schade en gemakkelijk ontmantelen. Merk op dat er grote hoeveelheden naïeve hiPSCs niet zijn opgenomen in EBs, dat is normaal. Deze designated cellen zal vóór de inleiding van het schommelen van de cultuur van EBs op lage-aanhanger oppervlak (2.5.2) weggewassen worden. Merk ook op dat, in ons protocol, EBs worden gevormd in het 4i naïef pluripotent medium - niet in het hPGCLC medium. Pre vorming van solide EBs in het medium 4i vóór de blootstelling aan het hPGCLC medium is belangrijk voor de verdeling van de hPGCLCs op het oppervlak van EBs.
EBs gehandhaafd in het medium van de hPGCLC onder een schommelen, niet-aanhanger cultuur voorwaarde blijft hun bolvorm zonder aggregatie of fusion (Figuur 6 en Figuur 7). Te zwakke schommelen voorwaarde zal veroorzaken EB aggregatie en fusion, maar ook harde voorwaarde zal EBs ontmantelen. Menselijke PGCLCs ontstaan als uiting van OCT4 cellen op het oppervlak van EBs na zo spoedig de 5-daagse cultuur in het hPGCLC medium, en hun aantal toeneemt tot de 8-daagse cultuur (Figuur 8). Verdere incubatie van EBs kan leiden tot ontmanteling van EBs en verlies van hPGCLCs. Menselijke PGCLCs kunnen worden verrijkt uit enzymatisch gedissocieerde EB cellen na 5-8 dagen van de cultuur in het hPGCLC medium door FACS als CD38 + cellen (Figuur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figuur 1: de cultuur van de cel van menselijke iPSC in Y27632-aangevuld medium 24 uren na inoculatie. Celdichtheid is ongeveer 20-30% confluent. In aanwezigheid van de ROCK-remmer Y27632, cellen de neiging te verspreiden goed met lange, spike-achtige rek. Schaal bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figuur 2: menselijke iPSC celkweek 48 uren na inoculatie. Cellen samenvoegen toe aan het formulier kolonies, ~ 30 procent van de groeigebied bezet houdt. Schaal bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figuur 3: menselijke iPSC celcultuur in het 4i herprogrammering medium gedurende 24 uur geïncubeerd. Cellen bereiken confluentie. Schaal bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figuur 4: menselijke iPSC celcultuur in het 4i herprogrammering medium gedurende 48 uur geïncubeerd. Confluente cellen worden dichtbevolkte verpakt. Schaal bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figuur 5: menselijke iPSC EBs gevormd in microwells na een incubatieperiode van de 24 uur per dag in de 4i herprogrammering middellange. De ronde contouren van EBs op 24-30 uren na inoculatie zichtbaar worden. Wanneer de contour wordt bevestigd onder een fasecontrastmicroscoop, EBs zijn klaar voor overdracht aan een rockende cultuur voorwaarde. Schaal bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figuur 6: menselijke iPSC EBs gedurende 24 uur in het hPGCLC medium geïncubeerd. EBs grotendeels behouden hun bolvorm. Schaal bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figuur 7: menselijke iPSC EBs ge¨ uncubeerd 192 uren in het medium hPGCLC. EBs worden vergroot ten opzichte van hun verschijning op de 24-uurs cultuur, maar ze houden nog steeds grotendeels bolvormige vormen met geen samenvoeging of fusion. Schaal bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figuur 8: menselijke PGCLCs uiten van OCT4 zijn gelokaliseerd op het oppervlak van EBs ge¨ uncubeerd 192 uren in het hPGCLC medium hiPSC. EBs waren ingesloten in extracellulaire matrix eiwitten en verwerkt voor FFPE dia immunohistochemische kleuring van OCT4 (DAB substraat). Schaal bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figuur 9: Menselijke PGCLCs zijn verrijkt uit enzymatisch gedissocieerde EB cellen door FACS als CD38+ cellen. Na incubatie in het hPGCLC medium gedurende 5-8 dagen, kan EBs worden losgekoppeld door enzymatische spijsvertering te bereiden enkele celsuspensie. hPGCLCs kan worden verrijkt als CD38+ cellen door FACS (rode stippen). EB-cellen die niet CD38 uitdrukken doen (blauwe stippen) moeten ook worden verzameld als negatieve controle. FACS poorten van CD38-positieve en negatieve-CD38 cellen moeten worden gescheiden met een ruime marge (groene stippen) om te voorkomen dat besmetting van elke soort cellen. De bovenste en onderste panelen Toon FACS profielen zonder of met anti-CD38 antilichaam kleuring, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijk voorlopers van zowel de zaadcellen als de eicellen. Menselijke embryonale PGCs zijn opgegeven uit pluripotente cellen van de epiblast door middel van interacties van cytokinen. Hier beschrijven we een 13-daagse protocol van het inducerende menselijke cellen transcriptomally gelijkend op PGCs aan het oppervlak van embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van de menselijke kiembaantoxicologie, zoals hoe schade in het genoom van menselijke oerkiemcellen wordt gecreëerd of gerepareerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat menselijke oerkiemcellen kunnen worden gegenereerd in twee weken uit de geprimede pluripotentie iPS cellen herbergen ziekte aanleg genetische achtergrond. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot preventie van genomische stoornissen in menselijke kiembaancellen, omdat ons celcultuurmodel ons kan helpen om de toxiciteit van een therapeutisch medicijn te verminderen.Om te beginnen met het genereren van menselijke oerkiekiecelachtige cellen, of menselijke PGCLC's, bereid extracellulaire matrix eiwitgecoate platen en celsuspensie van menselijke IPSCs, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een eencellige suspensie van geprimede pluripotentie menselijke iPSCs voor in het mTeSR1-medium met de Y-27632 Rho kinase-remmer. Pas de celdichtheid voorzichtig aan op 100.000 cellen per milliliter.Inenting twee milliliter celsuspensie van geprimede menselijke iPSCs in elke put van de extracellulaire matrix eiwit gecoate zes-goed platen, ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld door het schudden van de platen verticaal en horizontaal. Incubeer de platen in een tri-gas CO2 incubator op 37 graden Celsius. Het is zeer belangrijk om precies 200.000 cellen in te enten in elke put van een zes-put plaat.Nauwkeurig tellen van cellen is van cruciaal belang. Na voltooiing van de tijdelijke omzetting in naïeve pluripotentie, moeten cellen over-confluent kijken, wat normaal is. Exacte timing van medium verandering is belangrijk om hoge menselijke PGCLCS en experimentele reproduceerbaarheid te bereiken.Dichtheid van de 4i hiPSC cultuur is hoog onder deze omstandigheden, en het is naar verwachting voor cel te worden confluent op de 48 tot 72 uur na inenting. 24 uur na inenting, verander het medium met twee milliliter per put van mTeSR1 medium zonder Y27632. Start conversie van geprimed pluripotentie staat menselijke iPSCs naar 4i naïeve pluripotente stamcellen, door opwarming 50 milliliter van 4i compleet medium in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 minuten.Verwijder bij 48 en 72 uur na inenting de platen uit de couveuse en verander het medium met 2 milliliter per put van 4i compleet medium. Centrifugeer het met een wasmiddel bedekte microwellplaat op 1.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Inspecteer de putten met omgekeerde microscoop om de afwezigheid van luchtbellen te garanderen.Spoel de putten zoals beschreven in het tekstprotocol en herhaal de centrifugatie. Voeg 4i compleet medium toe aan de gespoelde putten. Centrifugeer de plaat op 1.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en inspecteer de putten opnieuw.Om 4i menselijke iPSCs in de microwellplaat te inenten, bereid menselijke iPSC celsuspensie voor zoals beschreven in het protocol. Filter deze celsuspensie door een celzeef van 40 micrometergrootte om celaggregaten te verwijderen. Was de zeef met een milliliter voorverwarmde 4i compleet medium drie keer om alle cellen te verzamelen van de zeef, en tel de cellen met een cultuur teller.Verdun vervolgens deze eencellige suspensie van 4i naïeve menselijke iPSC's tot 27 tot 32,4 miljoen cellen in 9 milliliter voorverwarmd 4i compleet medium met Y27632. Verwijder eerder voorbereide microwell plaat met 1 milliliter van 4i compleet medium per put uit een tri-gas incubator. Inenting 1 milliliter van 4i naïeve menselijke iPSC suspensie in elke put, om een concentratie van 3,0 tot 3,6 miljoen cellen per put te bereiken.Voorzichtig pipette om de cellen gelijkmatig te verdelen. Centrifugeren de plaat op 100 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat in een tri-gas CO2 incubator, zorg ervoor dat cellen pelleted in microwells verstoren, en uitbroeden voor 24 tot 30 uur, omdat een nachtelijke incubatie onvoldoende is voor de vorming van strakke embryonale lichamen of EB's.Prewarm 5 milliliter van menselijke PGCLC basale medium en 20 milliliter van de menselijke PGCLC compleet medium voor ten minste vijf minuten in een 37 graden Celsius waterbad Voorzichtig plaats een 40 micrometer poriën sized cel zeef ondersteboven over een 50 milliliter polypropyleen kegelbuis. Om EBs los te maken van microwells, voorzichtig pipette elke put van de plaat. Als u cellen wilt verwijderen die niet in EB's zijn opgenomen, filtert u de inhoud van alle putten door de celzeef.Was voorzichtig de EB's die op het membraan van de celzeef worden vastgehouden met 1 milliliter voorverwarmd menselijk PGCLC-basaal medium en herhaal de was vijf keer. Plaats een verse 50 milliliter conische buis op de celzeef, zodat de celzeef nu rechts in de nieuwe buis wordt geplaatst. Snel de celzeef omkeren met de nieuwe buis, die de EB's onder het membraan van de celzeef zal plaatsen.Voeg 18 milliliter voorverwarmde menselijke PGCLC complete medium toe aan het membraan van de celzeef om EB's in de conische buis te verzamelen. Dan, plaat 3 milliliter per put van de schorsing van EB's in putten van een lage bevestiging zes-goed plaat. Plaats de plaat op een wip-move rocker in een tri-gas incubator, en stel de schommelsnelheid voorzichtig op ongeveer 20 bochten per minuut.Op dag zeven tot 13 van het experiment, vers bereiden 20 milliliter van de menselijke PGCLC complete medium per dag. Verwijder de plaat van de tuimelschakelaar, waardoor de EB's naar de bodem van de putten zinken. Verwijder het oude medium zonder eb's te drogen, zodat ongeveer 0,2 milliliter oud medium in elke put blijft.Voeg 3 milliliter per put van verse menselijke PGCLC compleet medium, na het verwijderen van het oude medium elke dag. Om menselijke PGCLC's te identificeren als OCT4-positieve cellen, oogst je de EB's tot een 1,5 milliliter laagbindarme microcentrifugebuis. Laat de EB's zinken naar de bodem bij kamertemperatuur, en gooi het medium.Spoel de EBs af met ijskoude 1X PBS. Na het verwijderen van de PBS, incubeer de EB's in 1 milliliter ijskoud 1%gewicht in volume natrium azide in PBS op ijs gedurende vijf minuten. Laat de EB's zinken naar de bodem bij kamertemperatuur.Na het weggooien van de supernatant, spoel de EBs met ijskoude PBS. Ontdooi 200 microliters van extracellulair matrix-eiwit op ijs. Voeg het eiwit toe aan de buis met EB's.Laat de buis ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur, totdat de gel is gestold en de EB's zijn ingebed. Om de EBs te repareren, voeg 1 milliliter van 4% formaldehyde in PBS aan de buis, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met zachte schommelen. Gooi daarna het formaldehyde weg en spoel de EB's één keer af met ijskoude PBS.Voeg 1 milliliter ethanol toe. Bewaar in 70% ethanol bij 4 graden Celsius voor maximaal een week, of ga verder met het verwerken ervan met een standaard FFPE-protocol. Celdichtheid en zelfs verdeling van cellen op elke put zijn van cruciaal belang.Menselijke IPC's in 2 milliliter Y27632 aangevuld medium per put van een zes-put plaat, bereiken 20 tot 30%confluency na 24 uur. Na een extra 24-uurscultuur in het mTeSR1-medium, bij afwezigheid van Y27632, werden cellen samengevoegd en gevormd kolonies, die ongeveer 30% van het groeigebied bezetten. Na 24 uur cultuur in het 4i herprogrammeringsmedium bereikten cellen samenvloeiing.Na een extra 24 uur cultuur in het 4i-medium, werden cellen dichter verpakt. Na een 24-uurs incubatie in microwells in het 4i herprogrammeringsmedium, vormden cellen EB's met hun cirkelvormige contour zichtbaar op 24 tot 30 uur na inenting. EB's bewaard in de menselijke PGCLC medium, onder schommelende niet-loodrechte omstandigheden, onderhouden hun bolvormige vorm zonder aggregatie na 24 uur.Na 192 uur waren de EB's groter en hadden dezelfde morfologie. Na 5 dagen kwamen de cellen tevoorschijn als OCT4 die cellen uitdrukte op het oppervlak van EB's, waardoor hun aantal na 8 dagen toeneemt. Cellen uit eencellige suspensie van menselijke PGCLCs werden verrijkt als CD38-positieve cellen door FACS.Cellen die CD38 niet uitdrukken, waren negatieve controle. Om besmetting te voorkomen, werden FACS-poorten CD38-positieve en CD38-negatieve cellen gescheiden door een ruime marge. Tijdens een poging deze procedure, zijn belangrijk om exacte cel tellen en timings van medium verandering te volgen.Het weglaten van middelgrote verandering zelfs één enkele dag, of het verminderen van het volume van dat middel bij elke stap, kan massieve celdood veroorzaken. Snelheid van de schommelende cultuur van embryonale lichamen moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...