Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Wir erkennen Shiomi Yawata und Chie Owa für technische Hilfe während der anfänglichen Studien. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des NIEHS/NIH R01 ES023316 und R21ES024861, TS und durch Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) Zuschuss an JHH unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Robuste Herstellung von hPGCLCs mit dem beschriebenen Protokoll hier wurde mit drei unabhängigen Klonen von menschlichen iPSCs mit dem normalen diploiden Karyotyp10bestätigt. Diese iPSC-Klone wurden von der gleichen Menschenhaut neonatale dermalen Fibroblasten Zelle Kultur10abgeleitet. Sie werden von Autoren dieses Artikels an die Ermittler auf Anfrage und unter geeigneten Materialien Übernahmevertrag und Versand Anordnung der gefrorenen lebenden menschlichen Zellen bereitgestellt werden. Es ist derzeit unklar, ob die normalen Karyotyp erforderlich für robuste hPGCLC Produktion mit unserem Protokoll oder solche von anderen Labors gemeldet ist.
Neuere Studien haben gezeigt, dass Produktion von hPGCLCs aus HiPSCs11 oder WSR14 mit einem Protokoll von Saitou Gruppe der Universität Kyoto8 beschrieben abhängig von Ausdruck des EOMESODERMIN, erforderlich für ein Transkriptionsfaktor, der T-box Induktion von SOX17. SOX17 scheint zu funktionieren, als der Meister Linie Transkription Faktor in Differenzierung der Keimbahn des menschlichen pluripotenten Stammzellen6. EOMESODERMIN wird durch das EOMES -Gen kodiert und CRISPR/Cas9 KO von EOMES verursacht fast völlige Fehlen von SOX17 Induktion in den hPGCLC Zustand11produziert Expression anderer Gene folgte dem gleichen Muster von der SOX17-Null-Knockout-Zellen. Überexpression des EOMESODERMIN aus einem induzierbaren Vektor in EOMES-null Ko Zellen während hPGCLC Induktion Kultur effizient gerettet, der robuste hPGCLC Produktion sowie die Induktion der Keimbahn Gene, einschließlich SOX17. Induzierte Überexpression SOX17 gerettet dagegen auch die robuste PGCLC-Produktion, aber ohne EOMES induzieren. So, EOMESODERMIN ist eine kritische vorgelagerten Induktor von SOX17, und dies scheint die einzelne wichtigste Rolle von EOMESODERMIN in hPGCLC Induktion aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Unser Protokoll induziert SOX17 in HiPSCs10, aber seine Abhängigkeit auf EOMESODERMINE Induktion erwartet noch nicht festgelegt.
Dieses Protokoll konvertiert grundiert Pluripotenz menschlichen iPSCs ERK-unabhängige naiv Pluripotenz Mittel-und mTeSR1 für 96 Stunden in der 4i Umprogrammierung mittlere6, das ist eine veränderte naiv humanen Stammzellen Medium (NHSM)5beibehalten. Unsere Versuche, hPGCLCs, beginnend mit der gleichen menschlichen iPSC-Klone aber in anderen handelsüblichen menschlichen iPSC Wachstumsmedien gepflegt, bevor Kultur in der 4i Umprogrammierung Medium in unterschiedlichem Maße von niedrigeren hPGCLC Erträge führte zu generieren. Obwohl ob längerfristige Anpassung in anderen Medien hPGCLC Produktion verbessert oder nicht bleibt in zukünftigen Studien ermittelt werden, diese Beobachtung legt nahe, dass den genauen Zustand des grundiert Pluripotenz von menschlichen iPSCs vor der 4i Umprogrammierung deutlich wirkt sich EB Bildung 4i Mittel- und EB Differenzierung in hPGCLC Medium.
Herstellung von hPGCLCs aus HiPSCs nach unserem Protokoll ist robust und hoch reproduzierbare, teilweise bedingt durch die Verwendung der Microwell-Platten, die effiziente Produktion von eine große Anzahl von EBs zu ermöglichen (~ 8.000 EBs pro Charge) mit einer einheitlichen Größe (3.000 HiPSCs pro EB). Die Anzahl der EBs leicht produziert in einem einzelnen Batch Experiment mit unserem Protokoll möglicherweise weit größer als Methoden mit den regelmäßigen U-Boden Zelle Kultur Brunnen. Produktion von eine große Anzahl von gleich großen EBs gleichmäßig mit hPGCLCs übersät kann bieten einzigartige Möglichkeiten der Hochdurchsatz-chemischen Vorführungen, kleine Molekulargewicht Aktivatoren oder Inhibitoren beeinflussen PGC-Spezifikation zu identifizieren oder ihre biologische Eigenschaften wie epigenetischen Reprogrammierung. Solchen EBs kann auch für die toxikologische Beurteilung einer großen Zahl von Keimbahn Zelle Giftstoffe, einschließlich nicht nur Umwelt-Schadstoffe, sondern auch klinisch verschriebene Medikamente wie z. B. Chemotherapeutika nützlich.
Die entscheidenden Faktoren der stabile und reproduzierbare Produktion von hPGCLCs mit dem vorgestellten Protokoll enthalten (i) die Verwendung von gesunden HiPSCs in mTeSR1 auf extrazelluläre Matrix Protein, (Ii) die genaue Anzahl der Zellen wie angegeben und streng impfen gepflegt Befolgen Sie die Anzeigedauer der mittlere Veränderung und Subkultur, (Iii) viel menschliche recombinant BMP4 und (iv) körperliche Schäden von EBs während der rockigen Kultur zu minimieren auswählen. Es ist unsere Erfahrung, die das beste vieler BMP4 Reagenz bei 100 ng/mL Konzentration gearbeitet, während andere viel BMP4 Reagenzien 2 X oder höhere Dosen erforderlich. Auf der anderen Seite, Ausbeute an hPGCLCs Produktion mit die beste Menge BMP4 eher, bei höheren Dosen von BMP4 zurückgegangen (z. B. 200 ng/mL). Es wird empfohlen, mehrere verschiedene Lose von rekombinanten menschlichen BMP4 Reagenzien erhalten von verschiedenen Anbietern für ihre Leistung bei der Unterstützung der hPGCLC Generation zu testen und um eine große Menge der besten Partie zu sichern.
Eine Besonderheit unseres hPGCLC-Protokolls ist, dass hPGCLCs auf die äußerste Oberflächenschicht der EBs10 (Abbildung 8), lokalisiert sind, während andere Protokolle hPGCLCs in der Mitte der Zelle Aggregate6,8erzeugen können. Embryoid Körper sind in der Regel mehrere unterschiedliche Schichten wie Oberfläche, Außenschale, Innenschale und Kern zu bilden, und die zentralen Kern-Regionen sind oft nekrotische aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Nährstoffen, Sauerstoff, sowie Pro-Überlebenden Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt Form der Kultur Mediums durch Diffusion20. Lokalisierung von hPGCLCs auf der Oberfläche der EBs ohne mögliche Einschränkungen aufgrund der begrenzten Verbreitung in Richtung der Mitte der EBs möglicherweise vorteilhaft für direkte, zeitgesteuert und Dosis Exposition von hPGCLCs auf Medikamente oder giftige Substanzen für pharmakologische oder toxikologische Studien.
Während Steuern Maus PGCLCs zeigen robuste genomweite DNA Demethylierung unter Einbeziehung der Prägung Regionen zumindest teilweise scheint7,19,20, der Grad der globalen gDNA Demethylierung in hPGCLCs schwächer als Maus PGCLCS oder PGCs6,7. Transcriptomal Profile legen nahe, dass hPGCLCs in einem früheren Stadium der embryonalen PGCs als Maus PGCLCs10ähneln kann. Es wurde berichtet, dass längere Kultur der EBs unter der Bedingung der hPGCLC Produktion ein erhöhtes Maß an gDNA Demethylierung7verursacht; ob eine längere Kultur der hPGCLCs in EBs oder als isolierte Zellen mehr fortgeschrittene Stadien der Keimbahn Differenzierung erreichen müssen jedoch durch zukünftige Studien bestimmt werden.

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer aller Zellen der Keimbahn bei beiden Geschlechtern. Größte Teil unseres Wissens über Entwicklung von PGCs in Säugetier-Embryonen erzielt wurde, durch das Studium Labor Mäuse1,2. Im embryonalen Tag 6,0-6,5 von Mäuseembryonen befinden sich 6 oder ähnliche kleine Anzahl von PGC Vorstufen in der Epiblast und eine Gründerpopulation von ~ 40, die PGCs von ihnen in gewissem Sinne abhängig von Knochen morphogenetische Proteine Bmp2 und Bmp4 abgesondert vom angrenzenden induziert werden Zellen. Die frühesten menschlichen PGCs bisher in Embryonen identifiziert wurden an der endodermische Wand der Dottersack am Ende der dritten Woche der Schwangerschaft3. Weil dies am gleichen Ort wie Migration von PGCs in Mausembryonen eingehalten werden, ist es wahrscheinlich, dass die beobachteten menschliche PGCs auf dem Weg der Migration aber nicht die Gründerpopulation waren. Studien Rückverfolgung von früheren Stadien von PGCs oder PGC Vorstufen in menschlicher Embryonen haben gefehlt.
Zugang zu menschlichen embryonalen PGCs ist durch technische und ethische Hindernisse anspruchsvoll. Um diese Hürden zu überwinden, wurden vor kurzem PGC-ähnlichen Kultur Zellmodelle aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (EAP) generiert. Pluripotenz ist die zelluläre Funktion in die Keimbahn und drei embryonalen Mikrobeschichten4zu unterscheiden. Während menschliche PSCs Mittel-und mTeSR1 (ein Ready-to-Use, im Handel erhältlichen Mittel, die für die Aufrechterhaltung der menschlichen EAP im grundiert Pluripotenz Zustand formuliert) auf Gerichte mit der extrazellulären Matrix Protein beschichtet gepflegt haben grundiert Zustand Pluripotenz 4, 2013 Jacob Hanna Labor zeigte, dass die grundierte Pluripotenz Zellen in einem naiven Pluripotenz Zustand durch belichten die naive menschliche Stammzellen (NHSM)-haltigem Medium chemische Inhibitoren, Proteinkinasen ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, umgewandelt werden können p38 MAPK sowie Wachstumsfaktoren LIF, TGF, bFGF5. Aus naiv-Pluripotenz menschlichen EAP im Jahr 2015 erreicht eine Forschungsgruppe unter der Leitung von Hanna und Azim Surani die erste robuste Produktion menschlicher PGC-Like Zellen (hPGCLCs) von EAP-6. Mehrere andere Labors, einschließlich der unsrigen, berichtete später, Generierung von hPGCLCs aus einheitlichen Ansprechpartner mit leicht unterschiedlichen Protokollen7,8,9,10. Unserer Studie haben nachgewiesen, dass hPGCLCs über verschiedene Protokolle (die in Tabelle S1 unserer bisher veröffentlichten Studie10zusammengefasst sind) erzeugt Transcriptomally einander10ähnlich sind. Verfügbaren Beweise unterstützt die Ähnlichkeit des menschlichen PGCLCs, frühe menschliche embryonale PGCs vor der globalen epigenetische Löschung7 und/oder chemotaktische Migration10.
Studien der Maus embryonalen PGCs, Maus PGCLCs und menschlichen PGCLCs (aber nur sehr begrenzten Zugang zu menschlichen PGCs) haben gezeigt, dass die molekulare Mechanismen der PGC Spezifikation unterscheiden sich erheblich zwischen Maus und Mensch1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Z. B. Prdm14 spielt entscheidende Rolle bei PGC-Spezifikation in Mausembryonen, aber seine Rolle bei der menschlichen PGC Spezifikation scheint begrenzt1,15. Im Gegensatz dazu unbedingt Induktion von SOX17 durch EOMESODERMIN PGC Spezifikation6,11,14, während diese Transkriptionsfaktoren für Maus PGC Spezifikation15entbehrlich scheinen. Diese ersten Ergebnisse von Studien mit hPGCLCs stark unterstützen die Bedeutung dieses Handy-Kultur-Modells als Surrogat der menschlichen embryonalen PGCs.
Kürzlich veröffentlichte Studien, mit unserem Labor Tiefe Sequenzierung Bewertung der genomischen DNA-Kopie Zahlenanalyse, haben gezeigt, dass längere Wartung der einheitlichen Ansprechpartner in der naiven Pluripotenz Zustand deutlich das Risiko von chromosomale Instabilität erhöht und strukturelle Anomalien. Dieses Phänomen wurde mit Maus18 und menschlichen19 PSCs beobachtet. Das ursprüngliche hPGCLC-Produktion-Protokoll von Hanna/Surani berichtet wurde für menschliche PSCs gepflegt im 4i naiv Pluripotenz Medium für mindestens 2 Wochen6entwickelt. Um die normalen diploiden Karyotyp der menschlichen PSCs und PGCLCs zu bewahren, entwickelten wir ein modifiziertes Protokoll in der menschlichen PSCs 4i Medium für nur 72 Stunden10, ausgesetzt werden, die in diesem Artikel vorgestellt werden. Menschlichen iPSCs (HiPSCs) sind unter den grundiert Pluripotenz Zustand beibehalten. Unmittelbar vor der EB Bildung sind Zellen mittelfristig 4i naiv Neuprogrammierung (veränderter NHSM Medium) für 48 Stunden inkubiert. Zellen werden dann getrennt und in Mikrovertiefungen Form EBs für weitere 24 Stunden im 4i Medium verpackt. EBs bestehen in hPGCLC Induktion Medium mit einer hohen Konzentration von rekombinanten menschlichen BMP4 unter einer rockigen Bedingung für keine-Anlage Kultur für bis zu 8 Tage, die maximale Ausbeute an hPGCLCs zu erhalten. Nach 8 Tagen EB Kultur können hPGCLCs von dissoziierten EB Zellen durch FACS isoliert werden, wie in FACS-sortierbare einzelne Zellsuspension CD38 + Zellen mit bis zu ~ 40 % Ausbeute. Während andere veröffentlicht Methoden7,8,9, einschließlich das ursprüngliche Protokoll vor unsere Änderungen6, in der Regel generieren hPGCLCs in spontan gebildeten Zelle Aggregate ohne ausdrückliche Lokalisierung, hPGCLC produziert von unserem Protokoll an der Oberfläche des Embryoid Körper (EBs) eingehalten werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer aller Zellen der Keimbahn. In Mausembryonen eine Gründerpopulation von ~ 40 PGCs aus pluripotenten Zellen Epiblast durch orchestrierte Forderungen an Zytokinen, einschließlich Knochen morphogenetische Protein 4 (Bmp4) hervorgerufen. In menschlicher Embryonen die frühesten PGCs endodermische Wandmontage von Dottersack gegen Ende der Woche der Schwangerschaft 3rd identifiziert worden, aber wenig bekannt über den Prozess der menschlichen PGC-Spezifikation und ihrer frühen Entwicklung. Um die technischen und ethischen Schranken des Studiums menschlichen embryonalen PGCs zu umgehen, wurden vor kurzem Surrogat Zellmodelle Kultur aus pluripotenten Stammzellen generiert. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll für robuste Herstellung von menschlichen Zellen in PGC-Like (hPGCLCs). Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) in den grundiert Pluripotenz Zustand gepflegt sind die 4i-naiven Neuprogrammierung Medium für 48 Stunden inkubiert, getrennt für einzelne Zellen und in Mikrovertiefungen verpackt. Verlängerte Wartung des HiPSCs im naiven Pluripotenz Zustand verursacht erhebliche Chromosomenaberrationen und sollte vermieden werden. HiPSCs in Mikrovertiefungen bestehen für weitere 24 Stunden 4i Mittel-bis Form Embryoid Körper (EBs), die dann in niedrig-Einhaltung Plasticware unter einer rockigen Bedingung mittelfristig hPGCLC Induktion, enthält eine hohe Konzentration von kultiviert rekombinante menschliche BMP4. EBs sind weiter kultiviert, für bis zu 8 Tage im Schaukelstuhl, nicht anhaftende Zustand, maximale Erträge des hPGCLCs zu erhalten. Von Immunohistochemistry sind hPGCLCs ohne weiteres als Zellen stark ausdrücken OCT4 in fast alle EBs ausschließlich auf ihrer Oberfläche erkannt. Bei der EBs sind enzymatisch dissoziiert und FACS Bereicherung ausgesetzt, können hPGCLCs gesammelt werden, als CD38 + Zellen mit bis zu 40-45 % Ausbeute.

Die hier verwendeten Microwell-Platte ist im 24-Well-Format und hat 8 Brunnen hält die Microwell-Blätter, von denen jeder Bildung von bis zu 1.200 unterstützt EBs. Diese Microwell-Platte erzeugt in der Regel aus etwa 24 Millionen 4i naiv Pluripotenz Zellen, ~ 8.000 EBs bestehend aus ~ 3.000 Zellen pro EB. Während nicht-anhaftende Kultur der EBs mit ständigen Schaukeln, sinkt die Anzahl der intakten EBs allmählich durch spontan selbst Demontage und ~ 3.000 EBs bis Tag 13 des Protokolls zu überleben. Die meisten von ihnen überleben EBs haben 50-200 hPGCLCs auf ihrer Oberfläche (geschätzt von immunhistochemischen Nachweis OCT4 + Zellen in Schnittserien der EBs; siehe Abbildung 8), ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs insgesamt nachgeben. Enzymatische Verdauung von EBs in Einzelzellen ist ein relativ ineffizient Prozess, den Ertrag der FACS-angereicherten CD38 + hPGCLCs auf 9.000 47.000 Zellen zu reduzieren. In unseren Händen waren durchschnittlich sechs unabhängige, aber in Folge Chargen von Experimenten 14.038 ± 5.731 (Mittelwert ± SEM). Da CD38-Negative EB Zellen Zellen ausdrücken OCT4 mRNA (qPCR) oder Eiweiß (Immunhistochemie) nur sehr schwach, wenn nicht völlig abwesend, alle EB-Zellen stark mit dem Ausdruck OCT4 Protein sind praktisch gleichwertig für die gesamte Bevölkerung von CD38 + hPGCLCs.
Der kritische Parameter dieses Protokolls enthält Zelldichte. Wenn in einer extrazellulären Matrix Protein-beschichtete auch der 6-Well Kultur Zellplatte (9,60 cm2 Wachstumsbereich pro Well) mit 2 mL Y27632 ergänzt Medium (2.2.9) 2.0 x 105 menschliche iPSCs geimpft sind, Zellen zu erreichen, ca. 20-30 % confluency um 24 Uhr Stunden nach der Impfung (Abbildung 1). Nach eine zusätzliche 24-Stunden-Kultur im mTeSR1 Medium in das Fehlen von Y7632, Zellen aggregieren und Kolonien bilden besetzen ~ 30 % der Wachstumsbereich (Abbildung 2). Zellen sind dann mittelfristig 4i Neuprogrammierung (2.3.2) kultiviert. Nach 24 Stunden der Kultur in 4i mittlere, Zellen werden Zusammenfluss (Abbildung 3). Eine zusätzliche 24-Stunden-Kultur in der 4i Medium macht Zellen dicht gepackt (Abbildung 4). Der genaue Zeitpunkt der mittlere Veränderung (alle 24 Stunden + / 4 Stunden) und Zelldichten sind entscheidend für die erfolgreiche Gründung der EBs und hPGCLCs.
Zellen sind nach 48 Stunden Kultur Mittel-und 4i dissoziiert und geimpft, die Microwell-Platte, die Brunnen 400 µm groß (2.4) hat. Obwohl diese handelsüblichen Microwell-Platte beschichtet ist empfiehlt niedrigem Kraftschlußbeiwert Oberfläche durch den Hersteller, frische Neubeschichtung mit Reinigungsmittel (2.4.3) das Risiko von unerwünschten Zelladhäsion. 800 µm Mikrovertiefungen führte ertragsreduzierten hPGCLCs, was auf die Bedeutung der EB Größe richtig gerichtete Differenzierung. Zellen im 4i Medium geimpft bilden EBs in Mikrovertiefungen bei 24-30 Stunden, die mit einem standard, umgekehrte Phase Kontrast Mikroskop (Abbildung 5) beobachtet werden kann. Die Runde Kontur des EBs werden deutlich sichtbar und nach 24 Stunden nach der Inkubation. Ernte der EBs zu einem früheren Zeitpunkt (z. B. 16 Stunden nach der Impfung) vor ihrer Runde Kontur deutlich sichtbar ist wird nicht empfohlen, da solche EBs sind sehr anfällig für mechanische Beschädigungen und leicht zu demontieren. Beachten Sie, dass erhebliche Mengen an naive HiPSCs nicht aufgenommen in EBs, das ist normal. Diese unincorporated Zellen werden vor Beginn der Kultur der EBs auf Low-anhaftende Oberfläche (2.5.2) rocken weggespült werden. Beachten Sie auch, dass in unserem Protokoll EBs bilden sich mittelfristig 4i naiv Pluripotenz - nicht in das hPGCLC Medium. Vor Bildung von festen EBs 4i mittelfristig vor der Exposition gegenüber dem hPGCLC Medium ist wichtig für die Verteilung der hPGCLCs auf der Oberfläche der EBs.
EBs gepflegt im hPGCLC Medium unter einem Schaukeln, nicht anhaftende Kultur Zustand ihrer Kugelform ohne Aggregation oder Fusion (Abbildung 6 und Abbildung 7) beibehalten wird. Zu schwachen Zustand rocken werden dazu führen, dass EB Aggregation und Fusion, aber auch harten Zustand wird EBs demontieren. Menschliche PGCLCs erweisen sich als OCT4 exprimierenden Zellen an der Oberfläche der EBs nach so früh wie die 5-Tage-Kultur in das hPGCLC Medium, und ihre Zahl steigt bis die 8-Tage-Kultur (Abbildung 8). Weitere Inkubation von EBs kann Abbau der EBs und der Verlust der hPGCLCs führen. Menschlichen PGCLCs können aus enzymatisch dissoziierten EB Zellen nach 5-8 Tagen Kultur Mittel-und hPGCLC durch FACS als CD38 + Zellen (Abbildung 9) angereichert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Abbildung 1: menschlichen iPSC Zellkultur in Y27632 ergänzt Medium 24 Stunden nach der Inokulation. Zelldichte ist ca. 20-30 % konfluierende. In Anwesenheit von ROCK-Hemmer Y27632 tendenziell Zellen gut mit langen, Spike-wie Dehnung zu verbreiten. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Abbildung 2: menschlichen iPSC Zellkultur 48 Stunden nach der Inokulation. Zellen aggregieren zu Kolonien bilden, besetzen ~ 30 % der Anbaufläche. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Abbildung 3: menschlichen iPSC Zellkultur im 4i Neuprogrammierung Medium für 24 Stunden inkubiert. Zellen zur Konfluenz zu erreichen. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Abbildung 4: menschlichen iPSC Zellkultur im 4i Neuprogrammierung Medium für 48 Stunden inkubiert. Konfluierende Zellen sind dicht gepackt. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Abbildung 5: menschlichen iPSC EBs gegründet Mikrovertiefungen nach 24-stündiger Inkubation in der 4i Umprogrammierung Medium. Die Runde Kontur des EBs 24-30 Stunden nach der Impfung sichtbar werden. Wenn die Kontur unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop bestätigt wird, EBs sind bereit für den Transfer zu einem rockigen Kultur Zustand. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Abbildung 6: menschlichen iPSC EBs für 24 Stunden in das hPGCLC Medium inkubiert. EBs weitgehend pflegen ihre Kugelform. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Abbildung 7: menschlichen iPSC EBs für 192 Stunden in das hPGCLC Medium inkubiert. EBs sind im Vergleich zu ihren Auftritt beim 24-Stunden-Kultur vergrößert, aber sie halten immer noch weitgehend kugelige Formen ohne Aggregation oder Fusion. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Abbildung 8: menschliche PGCLCs mit dem Ausdruck OCT4 sind lokalisiert auf der Oberfläche des HiPSC EBs für 192 Stunden in das hPGCLC Medium inkubiert. EBs waren eingebettet in die extrazelluläre Matrix Protein und für Proteinkinase Folie immunhistochemische Färbung des OCT4 verarbeitet (DAB-Substrat). Maßstabsleiste = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Abbildung 9: Menschliche PGCLCs aus enzymatisch dissoziierten EB Zellen durch FACS als CD38 bereichert+ Zellen. Nach der Inkubation in das hPGCLC Medium für 5-8 Tage kann EBs durch enzymatische Verdauung, einzelne Zellsuspension vorzubereiten getrennt werden. hPGCLCs kann als CD38 angereichert+ Zellen durch FACS (rote Punkte). EB-Zellen, die nicht CD38 ausdrücken (blaue Punkte) auch als Negativkontrolle erhoben werden. FACS Tore CD38-Positive und CD38-Negative Zellen sollten mit großem Abstand (grüne Punkte) zur Vermeidung von Kontaminationen jeder Art von Zellen getrennt werden. Die oberen und unteren Platten anzeigen FACS Profile ohne oder mit Anti-CD38 Antikörper Färbung, bzw.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer von Spermien und Eizellen. Menschliche embryonale PGCs sind aus pluripotenten Epiblast Zellen durch Interaktionen von Zytokinen angegeben. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll des Verursachens von menschlichen Zellen Transcriptomally ähnlich PGCs an der Oberfläche des Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen.

Generation von menschlichen Ur Keimzelle-wie Zellen an der Oberfläche der Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der humanen Keimbahntoxikologie zu beantworten, wie z. B. wie Schäden im Genom menschlicher Urkeimzellen entstehen oder repariert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass menschliche Urkeimzellen in zwei Wochen aus den grundierten pluripotenti-iPS-Zellen mit Krankheitsveranlagung genetischen Hintergrund erzeugt werden können. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Prävention genomischer Beeinträchtigungen in menschlichen Keimbahnzellen, da unser Zellkulturmodell uns helfen kann, die Keimbahntoxizität eines therapeutischen Medikaments zu reduzieren.Um mit der Erzeugung von menschlichen urwüchsigen Keimzell-ähnlichen Zellen oder menschlichen PGCLCs zu beginnen, bereiten Sie extrazelluläre Matrixprotein-beschichtete Platten und Zellsuspension menschlicher iPSCs vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine einzellige Suspension der grundierten Pluripotenz humaner iPSCs im mTeSR1-Medium vor, das den Y-27632 Rho-Kinase-Inhibitor enthält. Passen Sie die Zelldichte vorsichtig auf 100.000 Zellen pro Milliliter an.Impfen Sie zwei Milliliter Zellsuspension von grundierten menschlichen iPSCs in jedem Brunnen der extrazellulären Matrix-Protein-beschichteten Sechs-Well-Platten, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt werden, indem die Platten vertikal und horizontal geschüttelt werden. Inkubieren Sie die Platten in einem Tri-Gas-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Es ist sehr wichtig, genau 200.000 Zellen in jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte zu impfen.Eine genaue Zählung der Zellen ist entscheidend. Nach Abschluss der transienten Umwandlung in naive Pluripotenz sollten Zellen über-konfluent aussehen, was normal ist. Der genaue Zeitpunkt des mittleren Wandels ist wichtig, um hohe menschliche PGCLCs und experimentelle Reproduzierbarkeit zu erreichen.Die Dichte der 4i hiPSC-Kultur ist unter diesen Bedingungen hoch, und es wird erwartet, dass die Zelle bei 48 bis 72 Stunden nach der Impfung konfluent wird. 24 Stunden nach der Impfung das Medium mit zwei Millilitern pro Bohrgut mTeSR1-Medium ohne Y27632 ändern. Beginnen Sie die Umwandlung des grundierten Pluripotenzzustands humaniPSCs in 4i naive pluripotente Stammzellen, indem Sie 50 Milliliter 4i komplettes Medium in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten erwärmen.Nach 48 und 72 Stunden nach der Impfung die Platten aus dem Inkubator entfernen und das Medium mit 2 Millilitern pro Brunnen von 4i komplettem Medium verändern. Zentrifugieren Sie die waschmittelbeschichtete Mikrowellplatte bei 1.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Prüfen Sie die Brunnen mit einem invertierten Mikroskop, um das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten.Spülen Sie die Brunnen, wie im Textprotokoll beschrieben, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Fügen Sie 4i komplettes Medium zu den spülten Brunnen hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, und inspizieren Sie die Brunnen erneut.Um 4i humane iPSCs in die Mikrowellplatte zu impfen, bereiten Sie die menschliche iPSC-Zellsuspension vor, wie im Protokoll beschrieben. Filtern Sie diese Zellsuspension durch ein 40 Mikrometer Poren-Zellsieb, um Zellaggregate zu entfernen. Waschen Sie das Sieb mit einem Milliliter vorgewärmten 4i komplette Medium dreimal, um alle Zellen aus dem Sieb zu sammeln, und zählen Sie die Zellen mit einem Kulturzähler.Verdünnen Sie dann diese einzelzellige Suspension von 4i naiven humanen iPSCs auf 27 bis 32,4 Millionen Zellen in 9 Millilitervorwärmten 4i komplettem Medium, das Y27632 enthält. Entfernen Sie zuvor vorbereitete Mikrowell-Platte mit 1 Milliliter 4i komplettem Medium pro Brunnen aus einem Tri-Gas-Inkubator. Impfen Sie 1 Milliliter 4i naive humane iPSC Suspension in jeden Brunnen, um eine Konzentration von 3,0 bis 3,6 Millionen Zellen pro Brunnen zu erreichen.Sanfte Pipette, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 g für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte in einen Tri-Gas-CO2-Inkubator, um sicherzustellen, dass Zellen, die in Mikrobrunnen pellet, nicht stören, und inkubieren Sie für 24 bis 30 Stunden, weil eine nächtliche Inkubation nicht ausreicht, um enge embryonale Körper oder EBs zu bilden.Vorwarme 5 Milliliter menschliches PGCLC Basalmedium und 20 Milliliter menschliches PGCLC-Gesamtmedium für mindestens fünf Minuten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad Vorsichtig legen Sie ein 40 Mikrometer Poren großes Zellsieb auf den Kopf über ein 50 Milliliter Polypropylen Konusrohr. Um EBs von Mikrobrunnen zu lösen, pipette jeden Brunnen der Platte sanft. Um Zellen zu entfernen, die nicht in EBs integriert sind, filtern Sie den Inhalt aller Brunnen durch das Zellsieb.Waschen Sie die auf der Membran des Zellsiebs zurückgehaltenen EBs vorsichtig mit 1 Milliliter vorgewärmten menschlichen PGCLC-Basalmediums und wiederholen Sie die Wäsche fünfmal. Legen Sie ein frisches 50 Milliliter konisches Rohr auf das Zellsieb, so dass das Zellsieb nun rechts oben im neuen Rohr positioniert ist. Umkehren Sie das Zellsieb schnell mit dem neuen Röhrchen, das die EBs unterhalb der Membran des Zellsiebs positioniert.Fügen Sie 18 Milliliter vorgewärmtes menschliches PGCLC-Gesamtmedium zur Membran des Zellsiebs hinzu, um EBs in der konischen Röhre zu sammeln. Dann Platte 3 Milliliter pro Brunnen der Suspension von EBs in Brunnen einer niedrigen Befestigung Sechs-Well-Platte. Legen Sie die Platte auf eine Wippe-Move-Rocker in einem Tri-Gas-Inkubator, und stellen Sie vorsichtig die Schaukelgeschwindigkeit auf etwa 20 Umdrehungen pro Minute.Am tag7. bis 13. des Experiments, frisch vorbereiten 20 Milliliter menschlichen PGCLC komplette Medium jeden Tag. Entfernen Sie die Platte von der Wippe, wodurch die EBs auf den Boden der Brunnen sinken. Entfernen Sie das alte Medium, ohne EBs zu trocknen, so dass in jedem Brunnen etwa 0,2 Milliliter altes Medium verbleiben.Fügen Sie 3 Milliliter pro Brunnen von frischem menschlichen PGCLC komplette Medium, nach dem Entfernen der alten Medium jeden Tag. Um menschliche PGCLCs als OCT4-positive Zellen zu identifizieren, ernten Sie die EBs in einem 1,5 Milliliter niedrig bindenden Mikrozentrifugenrohr. Lassen Sie die EBs bei Raumtemperatur auf den Boden sinken und entsorgen Sie das Medium.Spülen Sie die EBs mit eiskalten 1X PBS. Nach dem Entfernen der PBS, inkubieren Sie die EBs in 1 Milliliter eiskalte 1%Gewicht durch Volumen Natriumazid in PBS auf Eis für fünf Minuten. Lassen Sie die EBs bei Raumtemperatur auf den Boden sinken.Nach dem Wegwerfen des Überstandes die EBs mit eiskaltem PBS abspülen. 200 Mikroliter extrazelluläres Matrixprotein auf Eis auftauen. Fügen Sie das Protein in die Tube mit EBs.Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für ca. 10 Minuten, bis das Gel erstarrt ist und die EBs eingebettet sind. Um die EBs zu fixieren, fügen Sie 1 Milliliter 4%Formaldehyd in PBS in das Rohr, und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten mit sanftem Schaukeln. Danach das Formaldehyd entsorgen und die EBs einmal mit eiskaltem PBS abspülen.1 Milliliter 70% Ethanol hinzufügen. 70% Ethanol bei 4 Grad Celsius bis zu einer Woche aufbewahren oder mit einem Standard-FFPE-Protokoll verarbeiten. Die Zelldichte und die gleichmäßige Verteilung der Zellen auf jedem Brunnen sind entscheidend.Humane IPSCs in 2 Millilitery Y27632 ergänzen das Medium pro Bohrgut einer Sechs-Brunnen-Platte, erreichen 20 bis 30% Konfluenz nach 24 Stunden. Nach einer zusätzlichen 24-Stunden-Kultur im mTeSR1-Medium, in Abwesenheit von Y27632, Zellen aggregiert und gebildet Kolonien, die etwa 30% der Wachstumsfläche. Nach 24 Stunden Kultur im 4i-Reprogrammierungsmedium erreichten die Zellen die Konfluenz.Nach weiteren 24 Stunden Kultur im 4i-Medium wurden die Zellen dichter gepackt. Nach einer 24-stündigen Inkubation in Mikrobrunnen im 4i-Reprogrammierungsmedium bildeten Zellen EBs mit ihrer kreisförmigen Kontur, die 24 bis 30 Stunden nach der Impfung sichtbar war. EBs, die im menschlichen PGCLC-Medium unter schaukelnden, nicht haftenden Bedingungen aufbewahrt werden, behielten ihre kugelförmige Form ohne Aggregation nach 24 Stunden bei.Nach 192 Stunden waren die EBs größer und behielten die gleiche Morphologie bei. Nach 5 Tagen entstanden die Zellen als OCT4-exättige Zellen auf der Oberfläche von EBs, wodurch ihre Anzahl nach 8 Tagen erhöht wurde. Zellen aus der einzelzelligen Suspension menschlicher PGCLCs wurden durch FACS als CD38-positive Zellen angereichert.Zellen, die CD38 nicht ausdrücken, waren negative Kontrolle. Um eine Kontamination zu vermeiden, wurden DIE FACS-Gates CD38-positive und CD38-negative Zellen mit großem Abstand getrennt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, genaue Zellzählung und Timings der mittleren Veränderung zu folgen.Das Weglassen mittlerer Veränderungen auch nur einen einzigen Tag, oder die Verringerung des Volumens dieses Mediums in jedem Schritt, kann massiven Zelltod verursachen. Die Geschwindigkeit der Schaukelkultur von embryoiden Körpern muss sorgfältig optimiert werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...