Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

אנו להכיר Shiomi Yawata ו- Chie Owa לקבלת סיוע טכני במהלך מחקרים ראשוניים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIEHS/NIH R01 ES023316 ו- R21ES024861 ל TS, ועל ידי מענק דיילת רפואי מחקר מכון (FAMRI) JHH.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ייצור איתנה של hPGCLCs באמצעות פרוטוקול המתואר כאן אושר עם שלושה עצמאית שכפולים של האדם iPSCs עם קריוטיפ דיפלואידי נורמלית10. אלה שיבוטים iPSC היו נגזר באותו עור עורי neonatal פיברובלסט תא תרבות10. הם יסופקו על ידי מחברי מאמר זה לחוקרים על פי בקשה, תחת הסכם העברת חומרים המתאימים ומשלוח סידור תאים אנושיים חיים קפואים. לא ידוע כרגע אם קריוטיפ נורמלי היא הדרושים לייצור hPGCLC חזקים באמצעות פרוטוקול שלנו או לאלה שדווחו על ידי מעבדות אחרות.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הייצור של hPGCLCs hiPSCs11 או ESCs14 באמצעות פרוטוקול מתוארת על ידי הקבוצה של היא של אוניברסיטת קיוטו8 הוא תלוי הביטוי של EOMESODERMIN, גורם שעתוק T-box הדרושות אינדוקציה של SOX17. SOX17 נראה לתפקד כמו שושלת היוחסין בסיס לקביעת גורם שעתוק ב germline התמיינות של תאי גזע pluripotent האנושי6. EOMESODERMIN מקודד על ידי הגן EOMES , CRISPR/Cas9 נוקאאוט של EOMES גרמה העדר כמעט מוחלט של אינדוקציה SOX17 hPGCLC בהפקת תנאי11ואת הביטוי של גנים אחרים אחריו את אותה תבנית של תאים SOX17-null נוקאאוט. ביטוי של EOMESODERMIN של וקטור inducible ב EOMES-תאים נוקאאוט null במהלך hPGCLC אינדוקציה תרבות ביעילות הציל את הייצור hPGCLC חזקים, כמו גם אינדוקציה של גנים germline, כולל SOX17. לעומת זאת, ביטוי מושרה SOX17 גם הציל את הייצור PGCLC חזקים אך ללא גרימת EOMES. לפיכך, EOMESODERMIN משרן במעלה קריטית של SOX17, זה נראה התפקיד החשוב ביותר יחיד של EOMESODERMIN ב hPGCLC אינדוקציה מתאי גזע pluripotent אנושי. פרוטוקול שלנו גורם SOX17 hiPSCs10, אבל את התלות אינדוקציה EOMESODERMINE מחכה נקבע.
פרוטוקול זה ממיר pluripotency בשלה iPSCs אנושי בהשתתפות המדיום mTeSR1 כדי pluripotency תמים שאינו תלוי-טיפשה במשך 96 שעות ב- 4i התכנות בינונית6, אשר הוא תמים ששונה תאי הגזע האנושי בינוני (NHSM)5. הניסיונות שלנו לייצר hPGCLCs החל שיבוטים אנושיים iPSC אותו, אבל שמר על תקשורת צמיחה אחרים זמינים מסחרית iPSC האנושי לפני התרבות ב- 4i התכנות בינוני, גרמו בדרגות שונות של התשואות hPGCLC התחתון. אמנם אם הסתגלות וקהילותיהם מדיה אחרים משפרת את ייצור hPGCLC או לא נותר להיקבע במחקרים עתידיים, התבוננות זו עולה כי המצב המדויק של pluripotency כאשר הבחינה של האדם iPSCs לפני 4i התכנות באופן משמעותי משפיע EB-צורה המדיום 4i ובידול EB hPGCLC בינוני.
הייצור של hPGCLCs מ- hiPSCs ע פ הפרוטוקול שלנו הוא מאוד לשחזור, חלקית עקב השימוש של הלוחות microwell המאפשרים ייצור יעיל של מספר גדול של EBs ועמיד (~ 8,000 EBs לכל אצווה) בגודל אחיד (3,000 hiPSCs לכל EB). המספר של EBs ברצון מיוצר אצווה בודדת של הניסוי באמצעות פרוטוקול שלנו עשוי להיות גדול בהרבה שיטות שימוש הבארות רגיל של התרבות התא U-התחתון. ייצור של מספר גדול של לא פחות EBs בגודל אחיד משובץ hPGCLCs עשוי לספק הזדמנויות ייחודיות של הקרנות כימי תפוקה גבוהה כדי לזהות מפעילים קטן משקל מולקולרי או מעכבי המשפיעים על מפרט PGC או שלהם מאפיינים ביולוגיים כגון התכנות epigenetic. EBs כזה גם עשויה להיות שימושית עבור הערכות רעילות מספר גדול של תאים germline חשיפה לרעלים, כולל לא רק מזהמים סביבתיים אלא גם מבחינה רפואית מרשם תרופות כגון סוכני כימותרפיות.
הגורמים הקריטיים של ייצור לשחזור ועמיד hPGCLCs באמצעות פרוטוקול הציג כוללים (i) שימוש בריא hiPSCs בהשתתפות mTeSR1 על חלבונים מטריצה חוץ-תאית, (ii) לחסן את המספר המדויק של תאים כפי שצוין, בקפדנות בצע את התזמונים של שינוי בינונית ו תת-תרבות, (iii) כדי לבחור הרבה טוב BMP4 רקומביננטי האנושי, ו (iv) כדי למזער נזקים פיזיים של EBs במהלך התרבות נדנדה. . זה הניסיון שלנו שעבד הכי הרבה ריאגנט BMP4 ב 100 ננוגרם למ"ל ריכוז ואילו אחרים הרבה ריאגנטים BMP4 נדרש 2 X או במינון גדול יותר. לעומת זאת, התשואה של hPGCLCs הייצור באמצעות חלקו הטוב ביותר של BMP4 אלא ירידה במינונים גבוהים של BMP4 (למשל, 200 ng/mL). אנו ממליצים לבחון מגרשים שונים של recombinant ריאגנטים BMP4 האנושי המתקבל מספר ספקים עבור הביצועים שלהם בתמיכה hPGCLC הדור ועל מנת להבטיח כמות גדולה של הכי הרבה.
תכונה ייחודית של פרוטוקול hPGCLC שלנו היא כי hPGCLCs הם נקודתיים על שכבת פני השטח החיצוני של EBs10 (איור 8), בעוד פרוטוקולים אחרים ניתן להפיק hPGCLCs באמצע תא אגרגטים6,8. גופים embryoid נוטים ליצור שכבות נפרדות מרובות כגון פני השטח, המעטפת החיצונית, המעטפת הפנימית הליבה, ואת האזורים הליבה המרכזית הם לעתים קרובות עם נמק עקב היצע מוגבל של חומרים מזינים, חמצן, כמו גם טופס pro על הישרדות גורמי גדילה סיפק התרבות בינוני על ידי דיפוזיה20. לוקליזציה של hPGCLCs על פני השטח של EBs ללא מגבלות אפשריות בשל דיפוזיה מוגבלת לכיוון מרכז של EBs עשוי להיות מועיל עבור, זמן-מינון-מבוקר חשיפה ישירה של hPGCLCs סמים או חומרים רעילים עבור תרופתי או מחקרים רעילות.
ואילו העכבר PGCLCs הצג חזקים הגנום כולו DNA demethylation מעורבים החתמה לשלוט אזורים לפחות בחלקו7,19,20, מידת gDNA גלובל demethylation ב hPGCLCs נראה חלש יותר מאשר עכבר PGCLCS או PGCs6,7. פרופילים Transcriptomal מראים כי hPGCLCs אולי מזכירים את שלב מוקדם יותר PGCs עובריים מאשר עכבר PGCLCs10. בעבר דווח כי תרבות ממושך של EBs בתנאים של ייצור hPGCLC גרמה תואר מוגברת של gDNA demethylation7; עם זאת, אם תקופה ארוכה של התרבות של hPGCLCs ב EBs או תאים בודדים ניתן להשיג בשלבים מתקדמים יותר של בידול germline צריך להיקבע על ידי מחקרים עתידיים.

בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי משותף של כל התאים germline משני המינים. רוב הידע שלנו לפיתוח של PGCs עוברי יונקים התקבל דרך לימוד מעבדה-עכברים-1,-2. -עובריים יום 6.0-6.5 של העכבר עוברי, 6 או דומה מספר קטן של סימנים מקדימים PGC ממוקמים על epiblast, אוכלוסיה המייסדות של ~ 40 ש-pgcs הם המושרה מהם באופן תלוי עצם חלבונים morphogenetic Bmp2 ו- Bmp4 המופרשים סמוכים תאים. PGCs האנושית המוקדמת ביותר שתוארה עד כה העוברים היו על הקיר endodermal של שק חלמון-בסוף השבוע השלישי של ההיריון3. כי זה באותו המקום כמו PGCs נודדים הם נצפו העכבר עוברי, סביר להניח כי PGCs האנושית שנצפו היו בדרך של העברה אבל לא האוכלוסייה המייסדים. עם זאת, מחקרים מעקב לחזור לשלבים מוקדמים יותר של PGCs או PGC סימנים מקדימים ב עוברי אדם היו חסרים.
גישה PGCs עובריים אנושיים הוא מאתגר עקב מכשולים טכניים וגם מוסרית. כדי להתגבר על מכשולים אלה, מודלים תרבות PGC דמוי תא נוצרו לאחרונה מתאי גזע pluripotent אנושי (מגירסה). Pluripotency הוא היכולת הסלולר להבדיל לתוך germline שלוש שכבות הנבט עובריים4. ואילו מגירסה אנושי בהשתתפות המדיום mTeSR1 (מוכן לשימוש, זמינים מסחרית מדיום ניסח עבור תחזוקת מגירסה האנושי במדינה pluripotency להתקפת) על מנות מצופה עם החלבון מטריצה חוץ-תאית יש מצבים בשלה pluripotency 4, ב- 2013 המעבדה של יעקב חנה הראו כי ניתן להמיר את התאים pluripotency להתקפת מדינה pluripotency תמימה מאת לחשוף את המדיום תאי גזע אנושי תמים (NHSM) המכיל מעכבי כימי כדי חלבונים kinases ERK1/2, GSK3, JNK, רוק, PKC, p38 MAPK וכן גורמי גדילה LIF, TGF, bFGF5. החל מגירסה האנושי תמימה-pluripotency, בשנת 2015 הושלמה קבוצת מחקר בראשות חנה Surani עזים חזקים בהפקה הראשונה של התאים PGC-Like האדם (hPGCLCs) מגירסה6. מאוחר יותר, מספר מעבדות אחרות, כולל שלנו, דיווח דור של hPGCLCs החל מגירסה באמצעות פרוטוקולים שונה במקצת7,8,9,10. המחקר שלנו מספק ראיות כי hPGCLCs שנוצר באמצעות פרוטוקולים שונים (אשר מסוכמות בטבלה S1 של מחקר שפורסם בעבר שלנו10) הם דומים אחד לשני10transcriptomally. הראיות הזמינות תומך את הדמיון של האדם PGCLCs כדי PGCs עובריים אנושיים בשלב מוקדם לפני המחיקה epigenetic הכללית7 ו/או העברה chemotactic10.
מחקרים של העכבר PGCs עובריים בעכבר PGCLCs, PGCLCs האנושית (אבל עם רק גישה מוגבלת מאוד PGCs האנושי) חשפו המנגנונים המולקולריים של מפרט PGC נבדלים באופן משמעותי בין העכבר האנושי1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. לדוגמה, Prdm14 משחק תפקידים חיוניים במפרט PGC ב העכבר עוברי, אבל תפקידה במפרט PGC האנושי נראה מוגבל1,15. לעומת זאת, אינדוקציה של SOX17 על ידי EOMESODERMIN הוא חיוני עבור PGC מפרט6,11,14, ואילו אלה גורמי שעתוק נראה לוותר על העכבר PGC מפרט15. הישגים אלו הראשונית של מחקרים באמצעות hPGCLCs חריפה לתמוך את החשיבות של המודל התרבות התא בתור פונדקאית של PGCs עובריים אנושיים.
מחקרים שפורסמו לאחרונה, שכללו הערכה של המעבדה שלנו רצף עמוק של ה-DNA עותק מספר אנליזה גנומית, הראו כי תחזוקה ממושך של מגירסה המדינה pluripotency תמים מגביר באופן משמעותי את הסיכון של אי יציבות כרומוזומלית, חריגות מבנית. התופעה נצפתה עם העכבר18 וגם אנושי19 מגירסה. הפרוטוקול המקורי hPGCLC ייצור שדווחו על-ידי חנה/Surani פותחה עבור האדם מגירסה בהשתתפות המדיום pluripotency תמים 4i לפחות 2 שבועות6. כדי לשמר קריוטיפ דיפלואידי נורמלית של האדם מגירסה ושל PGCLCs, פיתחנו פרוטוקול שונה שבו האדם מגירסה נחשפים המדיום 4i רק 72 שעות10, אשר מוצג במאמר זה. אדם iPSCs (hiPSCs) מתוחזקים תחת המדינה כאשר הבחינה pluripotency. מיד לפני היווצרות EB, תאים מודגרת במדיום 4i תמים התיכנות (מדיום NHSM ששונה) למשך 48 שעות. תאים ואז הפומבית, דחוסים microwells לטופס EBs 24 שעות נוספות במדיום 4i. EBs מתוחזקים במדיום אינדוקציה hPGCLC המכיל ריכוז גבוה של BMP4 האנושי רקומביננטי בתנאי נדנדה לתרבות לא-מצורף עד 8 ימים כדי לקבל את התשואה המרבי של hPGCLCs. לאחר 8 ימים EB תרבות, hPGCLCs יכול להיות מבודד מתאי EB חלופה מועדפת על ידי FACS כפי CD38 + תאים עם ~ 40% תשואה FACS שאינה ניתנת למיון ההשעיה תא בודד. ואילו השני לאור שיטות7,8,9, כולל הפרוטוקול המקורי לפני השינויים6, בדרך כלל מחוללים hPGCLCs ב אגרגטים התא בנוי באופן ספונטני ללא ספציפי לוקליזציה, hPGCLC המיוצר על ידי פרוטוקול שלנו הם נצפו על פני השטח של גופים embryoid (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי משותף של כל התאים germline. ב העכבר עוברי, אוכלוסיה המייסד של PGCs ~ 40 הן תוצאה של תאים pluripotent epiblast חשיפות מתוזמר ציטוקינים, כולל עצם חלבון morphogenetic 4 (Bmp4). עוברי אדם, PGCs המוקדם זוהו על הקיר endodermal של שק החלמון סביב סוף השבוע 3rd של ההיריון, אך מעט ידוע על התהליך של מפרט PGC האנושי ופיתוח המוקדמות שלהם. כדי לעקוף את המחסומים טכנית ואתיות של הלומדים PGCs עובריים אנושיים, הפונדקאית תא תרבות מודלים נוצרו לאחרונה מתאי גזע pluripotent. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום לייצור חזקים של תאים אנושיים PGC-Like (hPGCLCs). האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs) בהשתתפות המדינה pluripotency להתקפת מודגרות ב נאיבי 4i התכנות בינונית למשך 48 שעות, חלופה מועדפת על תאים בודדים, הארוזים לתוך microwells. תחזוקה ממושך של hiPSCs במדינת pluripotency תמים גורם משמעותי סטיות כרומוזומליות, יש להימנע. hiPSCs, microwells נשמרים במשך 24 שעות ביממה, המדיום 4i לגופים טופס embryoid (EBs), אשר לאחר מכן נוספים תרבותי ב נמוך-הדבקות plasticware בתנאי נדנדה במדיום אינדוקציה hPGCLC המכיל ריכוז גבוה של BMP4 האנושי רקומביננטי. EBs עוד יותר מתורבתים עד 8 ימים מצב נדנדה שאינם מחסידי כדי להשיג תפוקה מקסימלית של hPGCLCs. מאת אימונוהיסטוכימיה, hPGCLCs ברצון מזוהים כתאים חזק לבטא OCT4 ב כמעט כל EBs באופן בלעדי על פני השטח שלהם. כאשר EBs enzymatically הפומבית, נתון FACS העשרה, hPGCLCs ניתן לאסוף כתאים CD38 + עם עד 40-45% תשואה.

הצלחת microwell המשמש כאן בתבנית 24-ובכן, יש בארות 8 מחזיק את הדפים microwell, שכל אחד מהם תומך היווצרות עד 1,200 EBs. מ כ-24 מיליון תאי pluripotency תמים 4i, הצלחת microwell הזו בדרך כלל יוצר ~ 8,000 EBs בהיקף של ~ 3,000 תאי EB. במהלך שאינו חסיד התרבות של EBs עם נדנדה קבועה, מספר שלם EBs פוחתת בהדרגה ספונטנית עצמית פירוק וכתוצאה ~ 3000 EBs לשרוד עד 13 יום של הפרוטוקול. רוב אלה ששרדו EBs יש 50-200 hPGCLCs על פני השטח (מוערך על ידי זיהוי immunohistochemical תאי OCT4 + בסעיפים טורי של EBs; ראה איור 8), מניב ~ 100,000 OCT4 + hPGCLCs סך הכל. עיכול אנזימטי של EBs לתוך תאים בודדים הוא תהליך יעיל יחסית, להפחית את התשואה של מועשרת FACS CD38 + hPGCLCs לתאים 9,000-47,000. בידיים שלנו, היה ממוצע של 6 קבוצות עצמאית אך רצופים של ניסויים 14,038 ± 5,731 (אומר ± SEM). כי תאים תאים CD38-שלילי EB לבטא OCT4 mRNA (qPCR) או חלבון (אימונוהיסטוכימיה) רק מאד חלש, אם לא לגמרי נעדר, כל התאים EB חזק לבטא OCT4 חלבון שוות כמעט כלל האוכלוסייה CD38 + hPGCLCs.
פרמטר קריטי של פרוטוקול זה כולל תא צפיפות. כאשר 2.0 x 105 iPSCs האנושי מחוסנים ב מטריצה חוץ-תאית מצופים חלבון טוב של 6-ובכן תא תרבות צלחת (9.60 ס מ2 צמיחה אזור לכל טוב) 2 מ ל בתוספת Y27632 בינונית (2.2.9), תאים יגיע אל-20-30% confluency-24 שעות לאחר חיסון (איור 1). לאחר 24 שעות ביממה נוספים תרבות במדיום mTeSR1 בהיעדרו של Y7632, תאים צבירה, טופס מושבות, כובשת ~ 30% באזור הגידול (איור 2). תאים ואז מתורבתים במדיום התיכנות 4i (2.3.2). לאחר 24 שעות של התרבות ב- 4i confluent התאים להיות בינוני, (איור 3). תרבות 24 שעות נוספות במדיום 4i הופך תאים ארוז בצפיפות (איור 4). העיתוי המדויק של שינוי בינוני (כל 24 שעות + /-4 שעות) וצפיפות התאים הם קריטיים עבור מוצלחת היווצרות EBs ו- hPGCLCs.
לאחר 48 שעות תרבות במדיום 4i, התאים הם חלופה מועדפת, מחוסן לצלחת microwell, שבו יש בארות מיקרומטר 400 בגודל (2.4). למרות הצלחת הזו microwell זמינים מסחרית מצופה על משטח נמוך-הדבקה על ידי היצרן, טריים ציפוי מחדש עם חומר ניקוי (2.4.3) מומלץ להפחית את הסיכון של הידבקות תאים לא רצויים. microwells מיקרומטר 800 גרם מופחתת התשואה של hPGCLCs, מציע את חשיבות גודל EB התמיינות מכוונת כראוי. תאים מחוסן במדיום 4i יהוו EBs ב- microwells ב- 24-30 שעות, אשר יכול להיות שנצפו באמצעות סטנדרטיים, הפוך שלב ניגודיות מיקרוסקופ (איור 5). קווי המתאר מעגלית של EBs לנראה בבירור, לאחר 24 שעות של דגירה. קציר EBs-למועד מוקדם יותר (למשל, 16 שעות לאחר חיסון) לפני שלהם מתאר מעגלית ברור אינה מומלצת מאחר EBs כאלה פגיעים מאוד מכניסטית נזקים ולפרק בקלות. שימו לב כי כמויות משמעותיות של תמים hiPSCs אינם משתלבים EBs, וזה נורמלי. תאים אלה לא מעובדות תשטף לפני תחילתן של נדנדה תרבות של EBs במשטח דוגל נמוך (2.5.2). שימו לב גם כי בפרוטוקול שלנו, EBs נוצרות במדיום pluripotency תמים 4i - לא במדיום hPGCLC. טרום היווצרות EBs מוצק במדיום 4i לפני חשיפה המדיום hPGCLC חשוב להפצה של hPGCLCs על פני השטח של EBs.
EBs בהשתתפות המדיום hPGCLC תחת נדנדה, מצב שאינו חסיד התרבות ישמרו על צורתם כדורית ללא צבירת או פיוז'ן (איור 6 , איור 7). גם יגרום חלש נדנדה מצב צבירה EB ופיוז'ן, אך תנאי נוקשה מדי לפרק את EBs. PGCLCs האנושי להגיח כתאי לבטא OCT4 על פני השטח של EBs לאחר מוקדם ככל התרבות 5 ימים המדיום hPGCLC, שלהם מספר הגדל עד התרבות 8 ימים (איור 8). דגירה נוספת של EBs עלול לגרום פירוק של EBs ואובדן של hPGCLCs. PGCLCs האנושי יכול להיות מועשר מתאי EB enzymatically הפומבית לאחר 5-8 ימים של תרבות במדיום hPGCLC על-ידי FACS כתאים CD38 + (איור 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> איור 1: iPSC האנושי תרבית תאים בתוספת Y27632 בינוני 24 שעות לאחר חיסון. תא צפיפות היא כ 20-30% confluent. בנוכחות מעכב רוק Y27632, תאים נוטים להתפשט עם התארכות זמן, כמו ספייק. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> איור 2: תרבית תאים אנושיים iPSC 48 שעות לאחר חיסון. תאים צבירה למושבות טופס, כובשת ~ 30% של אזור צמיחה. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> איור 3: תרבית תאים אנושיים iPSC מודגרות במדיום התיכנות 4i למשך 24 שעות. תאים להגיע confluency. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> איור 4: תרבית תאים אנושיים iPSC מודגרות במדיום התיכנות 4i למשך 48 שעות. תאים confluent עמוסים בצפיפות. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> איור 5: האדם iPSC EBs שהוקמה ב microwells לאחר דגירה 24 שעות ביממה ב- 4i התכנות בינונית. קווי המתאר מעגלית של EBs הופכים לגלויים ב 24-30 שעות לאחר חיסון. כאשר קו המתאר הוא אישר במיקרוסקופ ניגוד שלב, EBs מוכנים להעברה מצב התרבות נדנדה. סרגל קנה מידה = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> איור 6: האדם iPSC EBs הדגירה במשך 24 שעות ביממה, המדיום hPGCLC. EBs לשמור במידה רבה על צורה כדורית שלהם. סרגל קנה מידה = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> איור 7: האדם iPSC EBs מודגרות שעות 192 של המדיום hPGCLC. EBs מוגדלות בהשוואה את המראה שלהם על התרבות 24 שעות ביממה, אבל הם עדיין לשמור על צורות כדורית ללא צבירת או פיוז'ן. סרגל קנה מידה = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> איור 8: PGCLCs האדם לבטא OCT4 מותאמים על פני השטח של hiPSC EBs מודגרות שעות 192 של המדיום hPGCLC. EBs היו מוטבעים בחלבון מטריצה חוץ-תאית, מעובד עבור FFPE שקופית נוגדן של OCT4 (DAB המצע). סרגל קנה מידה = 1 מ מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> איור 9: PGCLCs האנושי מועשרים מתאי EB enzymatically הפומבית FACS כמו CD38+ תאים. לאחר דגירה של המדיום hPGCLC 5-8 ימים, EBs יכול להיות חלופה מועדפת על ידי עיכול אנזימטי להכין התליה תא בודד. יכול להיות מועשר hPGCLCs כמו CD38+ תאים על-ידי FACS (נקודות אדומות). EB תאים המבטאים לא CD38 גם אמור להיות שנאספו (נקודות כחולות) כפקד שלילי. FACS השערים של תאים CD38-חיוביים ושליליים -CD38 להפרידם עם מרווח רחב (נקודות ירוק) כדי למנוע זיהום של כל סוג של תאים. הלוחות העליונים והתחתונים הצג פרופילים FACS בלי או עם נוגדן anti-CD38 מכתים, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) הם מבשרי נפוצות של זרע וגם ביצים. PGCs עובריים אנושיים מצוינים מתאי epiblast pluripotent באמצעות אינטראקציות של ציטוקינים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול 13 יום של גרימת transcriptomally תאים אנושיים הדומה PGCs על פני השטח של גופים embryoid מתאי גזע pluripotent טענתי-pluripotency המושרה.

דור של תאים אנושיים כמו תא הנבט הקדמונים על פני השטח של גופים Embryoid מן pluripotency בשלה המושרה בתאי גזע Pluripotent

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרעלים של הנבט האנושי, כגון כיצד נזקים בגנום של תאי נבט ראשוניים אנושיים נוצרים או מתוקנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי נבט ראשוניים אנושיים יכולים להיווצר בתוך שבועיים מהתאים הפלוריפוטנטיים העיקריים של iPS המטפחים נטייה למחלות רקע גנטי. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת מניעת פגיעה גנומית בתאי נבט אנושי, כי מודל תרבות התא שלנו יכול לעזור לנו להפחית את רעילות הנבט של תרופה טיפולית.כדי להתחיל עם הדור של תאים דמויי תא נבט קדמוני אנושי, או PGCLCs אנושיים, להכין מטריצה חוץ תאית מצופה חלבון צלחות השעיית תאים של iPSCs אנושי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן השעיה חד-תאית של iPSCs אנושיים pluripotency מוכן במדיום mTeSR1 המכיל את מעכב Y-27632 רו קינאז. כוונן בזהירות את צפיפות התאים ל- 100,000 תאים למיליליטר.לחסן שני מיליליטר של השעיית תאים של iPSCs אנושיים primed בכל באר של חלבון מטריצה חוץ תאי מצופה שש בארות צלחות, לוודא כי התאים מופצים באופן שווה על ידי טלטול הצלחות אנכית ואופקית. להטמיר את הצלחות באינקובטור CO2 שלושה גז ב 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד לחסן בדיוק 200,000 תאים בכל באר של צלחת שש בארות.ספירה מדויקת של תאים היא קריטית. לאחר השלמת ההמרה הטרנזית לפלוריפוטנטיות נאיבית, התאים צריכים להסתכל על קונפלנט יתר, וזה נורמלי. תזמון מדויק של שינוי בינוני חשוב להשגת PGCLCs אנושיים גבוהים ושחזור ניסיוני.הצפיפות של תרבות hiPSC 4i גבוהה בתנאים אלה, והוא צפוי לתא להיות confluent ב 48 עד 72 שעות לאחר חיסון. 24 שעות לאחר החיסון, לשנות את המדיום עם שני מיליליטר לגם של mTeSR1 בינוני ללא Y27632. התחל המרה של מצב pluripotency primed iPSCs אנושי לתאי גזע פלוריפוטנטיים נאיביים 4i, על ידי התחממות 50 מיליליטר של 4i להשלים בינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.ב 48 ו 72 שעות לאחר החיסון, להסיר את הצלחות מהאינקובטור, ולשנות את המדיום עם 2 מיליליטר ל well של 4i מדיום שלם. צנטריפוגה צלחת microwell מצופה דטרגנט ב 1, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בדוק את בארות עם מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח היעדר בועות אוויר.שטפו את הבאר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וחזרו על הצנטריפוגה. מוסיפים 4i מדיום שלם ל בארות שטוף. צנטריפוגה הצלחת ב 1, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולבדוק את בארות שוב.כדי לחסן 4i iPSCs אנושי לתוך צלחת microwell, להכין השעיית תא iPSC אנושי כמתואר בפרוטוקול. לסנן את ההשעיה תא זה באמצעות מסננת תאים בגודל נקבובית 40 מיקרומטר כדי להסיר צבירות תאים. לשטוף את מסננת עם מיליליטר אחד של 4i מחומם מראש להשלים מדיום שלוש פעמים כדי לאסוף את כל התאים מן מסננת, ולספירת התאים עם מונה תרבות.לאחר מכן, לדלל את ההשעיה הזאת תא יחיד של 4i נאיבי iPSCs אנושי ל 27 כדי 32.4 מיליון תאים ב 9 מיליליטר מראש מחומם 4i מדיום מלא המכיל Y27632. הסר צלחת microwell שהוכן בעבר המכיל 1 מיליליטר של 4i להשלים בינוני לגם מאינקובטור תלת גז. לחסן 1 מיליליטר של השעיית iPSC אנושית 4i נאיבי לתוך כל באר, כדי להשיג ריכוז של 3.0 כדי 3.6 מיליון תאים לגם.בעדינות פיפטה כדי להפיץ את התאים באופן שווה. צנטריפוגה הצלחת ב 100 גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת באינקובטור CO2 שלושה גז, הקפד לא להפריע תאים גלולה microwells, ו דגירה במשך 24 עד 30 שעות, כי דגירה לילה אינו מספיק להיווצרות של גופים עובריים הדוקים או EBs.לפני המלחמה 5 מיליליטר של מדיום בסיס PGCLC אנושי ו 20 מיליליטר של האדם PGCLC להשלים מדיום לפחות חמש דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בזהירות למקם מסננת תאים בגודל נקבובית 40 מיקרומטר במהופך מעל צינור חרוט פוליפרופילן 50 מיליליטר. כדי לנתק את EBs ממיקרווולים, בעדינות pipette כל באר של הצלחת. כדי להסיר תאים שלא שולבו ב- EBs, סנן את התוכן של כל הבארים דרך מסננת התאים.לשטוף בעדינות את EBs נשמר על הממברנה של מסננת התא עם 1 מיליליטר של מדיום בסיס PGCLC אנושי מחומם מראש, ולחזור על לשטוף חמש פעמים. מניחים צינור חרוט טרי 50 מיליליטר על מסננת התא, כך מסננת התא ממוקם כעת בצד ימין למעלה בצינור החדש. במהירות להפוך את מסננת התא עם הצינור החדש, אשר ימקם את EBs מתחת לממברנה של מסננת התא.הוסף 18 מיליליטר של PGCLC אנושי מחומם מראש מדיום מלא הממברנה של מסננת התא כדי לאסוף EBs בצינור חרוט. לאחר מכן, צלחת 3 מיליליטר לתוך גם של ההשעיה של EBs לתוך בארות של צלחת שישה בארות מצורף נמוך. מניחים את הצלחת על נדנדה לנוע באינקובטור תלת גז, בזהירות להגדיר את מהירות הנדנדה על כ 20 סיבובים לדקה.ביום השביעי עד ה-13 של הניסוי, הכינו טריים 20 מיליליטר של מדיום שלם PGCLC אנושי בכל יום. הסר את הצלחת מן הנדנדה, אשר יגרום EBs לשקוע לתחתית בארות. הסר את המדיום הישן מבלי לייבש EBs כך כ 0.2 מיליליטר של מדיום ישן נשאר בכל באר.הוסף 3 מיליליטר ל באר של PGCLC אנושי טרי מדיום שלם, לאחר הסרת המדיום הישן כל יום. כדי לזהות PGCLCs אנושיים כתאים חיוביים OCT4, לקצור את EBs לצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך 1.5 מיליליטר. תן EBs לשקוע לתחתית בטמפרטורת החדר, ולהשליך את המדיום.יש לשטוף את ה-EBs בקרח 1X PBS. לאחר הסרת PBS, דגירה EBs ב 1 מיליליטר של קרח קר 1% משקל לפי נפח נתרן אזיד ב PBS על קרח במשך חמש דקות. תן ל- EBs לשקוע לתחתית בטמפרטורת החדר.לאחר השלכת העל-טבעי, שוטפים את ה-EBs בקרח קר PBS. להפשיר 200 מיקרוליטרים של חלבון מטריצה חוץ תאית על קרח. מוסיפים את החלבון לצינור המכיל EBs.השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות, עד שג'ל מתמצת, וה- EBs מוטבעים. כדי לתקן את EBs, להוסיף 1 מיליליטר של 4% פורמלדהיד PBS לצינור, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות עם נדנדה עדינה. לאחר מכן, להשליך את פורמלדהיד ולשטוף את EBs פעם אחת עם PBS קר כקרח.הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול. יש לאחסן ב-70% אתנול ב-4 מעלות צלזיוס עד שבוע, או להמשיך לעבד אותן בפרוטוקול FFPE סטנדרטי. צפיפות התאים ואפילו התפלגות התאים בכל באר הם קריטיים.IPSCs אנושיים ב 2 מיליליטר של Y27632 בתוספת בינוני ל הבאר של צלחת שש בארות, להגיע 20 כדי 30% confluency לאחר 24 שעות. לאחר תרבות נוספת של 24 שעות במדיום mTeSR1, בהיעדר 27632 Y, התאים צברו ויצרו מושבות, הכובשות כ -30% מאזור הגידול. לאחר 24 שעות של תרבות במדיום תכנות מחדש 4i, תאים הגיעו לקונפלונציה.לאחר 24 שעות נוספות של תרבות במדיום 4i, התאים הפכו צפופים יותר. לאחר דגירה של 24 שעות במיקרווולים במדיום התכנות מחדש של 4i, תאים יצרו EBs עם קווי המתאר העגולים שלהם גלויים ב 24 עד 30 שעות לאחר החיסון. EBs שמרו במדיום PGCLC האנושי, בתנאים לא עקביים נדנדה, שמרו על צורתם הכדורית ללא צבירה לאחר 24 שעות.לאחר 192 שעות, EBs היו גדולים יותר, שמירה על אותה מורפולוגיה. לאחר 5 ימים, התאים הופיעו כמו OCT4 להביע תאים על פני השטח של EBs, להגדיל את מספרם לאחר 8 ימים. תאים מהשעיית תא יחיד של PGCLCs אנושיים הועשרו כתאים חיוביים CD38 על ידי FACS.תאים שלא מבטאים CD38 היו שליטה שלילית. כדי למנוע זיהום, FACS שערי CD38 חיובי ו CD38 שלילי תאים הופרדו על ידי שוליים רחבים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר ספירת תאים מדויקת ותזמונים של שינוי בינוני.השמטת שינוי בינוני אפילו יום אחד, או הפחתת נפח המדיום בכל שלב, עלולה לגרום למוות מסיבי של תאים. המהירות של תרבות הנדנדה של גופים עובריים צריכה להיות ממוטבת בקפידה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...