Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Riconosciamo Shiomi Yawata e Chie Owa per l'assistenza tecnica durante gli studi iniziali. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIEHS/NIH R01 ES023316 e R21ES024861 a TS e da grant di assistente di volo Medical Research Institute (FAMRI) a JHH.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Produzione robusta di hPGCLCs mediante il protocollo descritto qui è stata confermata con tre cloni indipendenti di iPSCs umane con il cariotipo diploide normale10. Questi cloni iPSC derivavano dalla stessa pelle cutaneo neonatale umana del fibroblasto cella cultura10. Saranno forniti dagli autori di questo articolo per gli investigatori a richiesta e sotto accordo di trasferimento di materiali appropriati e disposizione delle cellule umane dal vivo congelate di trasporto. È attualmente sconosciuto se il cariotipo normale è necessaria per la produzione di robusta hPGCLC utilizzando il nostro protocollo o quelle segnalate da altri laboratori.
Recenti studi hanno dimostrato che la produzione di hPGCLCs da hiPSCs11 o CES14 utilizzando un protocollo descritto dal gruppo di Saitou dell'Università di Kyoto8 è dipendente da espressione di EOMESODERMIN, un fattore di trascrizione T-box necessari per induzione di SOX17. SOX17 sembra funzionare come master lignaggio determinare il fattore di trascrizione nella linea germinale differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane6. EOMESODERMIN è codificata dal gene EOMES , CRISPR/Cas9 Ko di EOMES causato quasi completa assenza di induzione di SOX17 in hPGCLC producendo condizione11ed espressione di altri geni seguito lo stesso schema della Cellule di SOX17 null ad eliminazione diretta. Sovraespressione di EOMESODERMIN da un vettore inducibile in EOMES-cellule null knockout durante la coltura di induzione hPGCLC salvato in modo efficiente il robusto hPGCLC produzione come pure induzione di germline geni, compreso SOX17. Al contrario, sovraespressione indotta SOX17 salvato anche la produzione di PGCLC robusta ma senza indurre EOMES. Così, EOMESODERMIN è un critico induttore a Monte di SOX17, e questo sembra il ruolo più importante singolo di EOMESODERMIN in hPGCLC induzione da cellule staminali pluripotenti umane. Nostro protocollo induce SOX17 in hiPSCs10, ma la sua dipendenza dall'induzione di EOMESODERMINE vi aspetta per essere determinato.
Questo protocollo converte pluripotenza innescato umano iPSCs mantenuto nel medio mTeSR1 ERK-indipendente ingenuo pluripotenza per 96 ore nel 4i riprogrammazione medio6, che è un ingenuo modificate sulle cellule staminali umane medio (NHSM)5. I nostri tentativi di generare hPGCLCs a partire con i cloni di iPSC umano stesso, ma mantenuto in altri mezzi di crescita disponibili in commercio umano iPSC prima cultura nel 4i riprogrammazione medio ha provocato vari gradi di rese inferiori hPGCLC. Sebbene sia che a più lungo termine adattamento in altri media migliora la produzione di hPGCLC o non rimane essere determinato negli studi futuri, questa osservazione suggerisce che lo stato esatto della pluripotenza innescato di iPSCs umane prima il 4i riprogrammazione significativamente Formazione di EB impatti a medio 4i e differenziazione di EB in mezzo hPGCLC.
Produzione di hPGCLCs da hiPSCs seguendo il nostro protocollo è robusto e altamente riproducibili, parzialmente a causa dell'uso delle piastre microtiter che permettono una produzione efficiente di un gran numero di EBs (~ 8.000 EBs per ogni batch) con una dimensione uniforme (3.000 hiPSCs a EB). Il numero di EBs prontamente prodotta in un singolo batch di esperimento utilizzando il nostro protocollo può essere molto maggiore rispetto ai metodi utilizzando i pozzi di cultura cellulare fondo U regolari. Produzione di un gran numero di altrettanto dimensioni EBs uniformemente costellato di hPGCLCs può fornire opportunità uniche di proiezioni chimiche ad alta produttività per identificare piccole peso molecolare attivatori o inibitori che interessano specifica: PGC o loro caratteristiche biologiche quali riprogrammazione epigenetica. Tale EBs può anche essere utile per le valutazioni tossicologiche di un gran numero di sostanze tossiche di cellula germinale, includendo non solo gli inquinanti ambientali ma anche clinicamente prescritti farmaci come agenti chemioterapeutici.
I fattori critici della produzione affidabile e riproducibile di hPGCLCs utilizzando il protocollo presentato includono (i) l'uso di sano hiPSCs mantenuto in mTeSR1 su proteina della matrice extracellulare, (ii) per inoculare il numero esatto delle cellule come specificato e rigorosamente seguire i tempi di cambiamento medio e sottocultura, (iii) per selezionare un buon sacco di umana ricombinante BMP4 e (iv) per minimizzare i danni fisici di EBs durante la cultura a dondolo. È nostra esperienza che il miglior sacco di BMP4 reagente ha lavorato presso una concentrazione di 100 ng/mL, mentre altri lotto di reagenti BMP4 richiesto 2 X o dosi maggiori. D'altra parte, resa di hPGCLCs produzione utilizzando il miglior sacco di BMP4 è diminuito piuttosto alle dosi elevate di BMP4 (ad es., 200 ng/mL). Si consiglia di testare diversi diversi lotti di reagenti BMP4 umani ricombinanti ottenuti da più fornitori per le loro prestazioni nel sostenere la generazione di hPGCLC e per garantire una grande quantità del lotto migliore.
Una caratteristica unica del nostro protocollo di hPGCLC è che hPGCLCs sono localizzati sullo strato superficiale più esterno di EBs10 (Figura 8), mentre altri protocolli in grado di generare hPGCLCs nel mezzo di cella aggregati6,8. Corpi embryoid tendono a formare più strati distinti come superficie, calotta esterna e calotta interna core, e le regioni di nucleo centrale sono spesso necrotiche a causa della limitata disponibilità di nutrienti, ossigeno, così come pro-sopravvivenza forniti di fattori di crescita forma la cultura mezzo di diffusione20. Localizzazione di hPGCLCs sulla superficie di EBs senza possibili restrizioni a causa della limitata diffusione verso il centro di EBs può essere utile per esposizione diretta, tempo - e dose-controllata di hPGCLCs a farmaci o sostanze tossiche per farmacologici o studi tossicologici.
Mentre mouse PGCLCs Visualizza robusto genoma DNA demetilazione che coinvolgono l'imprinting controllano le regioni almeno parzialmente7,19,20, il grado di demetilazione gDNA globale in hPGCLCs sembra più debole rispetto al mouse 6,7PGCLCS o PGC. Transcriptomal profili suggeriscono che hPGCLCs può assomigliare ad una fase precedente di PGC embrionali di topo PGCLCs10. È stato riportato che la coltura prolungata di EBs sotto la condizione di produzione hPGCLC causato un maggiore grado di gDNA demetilazione7; Tuttavia, se un lungo periodo della cultura di hPGCLCs in EBs o come cellule isolate possa raggiungere stadi più avanzati di germline differenziazione deve essere determinata da studi futuri.

Cellule germinali primordiali (PGC) sono precursori comuni di tutte le cellule germinali in entrambi i sessi. La maggior parte delle nostre conoscenze sullo sviluppo di PGC in embrioni di mammiferi è stata ottenuta attraverso lo studio di laboratorio topi1,2. Al giorno embrionale 6.0-6.5 di embrioni di topo, 6 o simile a un piccolo numero di precursori PGC si trova nell'epiblasto e una popolazione di fondatore di ~ 40 che PGC sono indotte da loro in un modo dipenda delle bone morphogenetic proteins Bmp2 e Bmp4 secernuto da adiacente cellule. I primi PGC umano finora identificati negli embrioni erano sulla parete endodermica del sacco vitellino alle intorno alla fine della terza settimana di gestazione3. Perché questo è lo stesso posto come PGC migrazione sono stati osservati in embrioni di topo, è probabile che il PGC umani osservati erano nel percorso della migrazione, ma non la popolazione fondatore. Tuttavia, gli studi di ripercorrere le fasi precedenti di PGC o PGC precursori in embrioni umani sono scomparsi.
Accesso al PGC embrionale umano è difficile a causa di ostacoli sia tecnici che etici. Per superare questi ostacoli, modelli di coltura cellulare di PGC-come sono stati recentemente generati da cellule staminali pluripotenti umane (PSC). Pluripotenza è la capacità cellulare di differenziare nella linea germinale e tre strati germinativi embrionali4. Considerando che il PSC umano mantenuti nel medio mTeSR1 (un mezzo ready-to-use, commercialmente disponibile formulato per la manutenzione degli sportelli unici umani nello stato innescato pluripotenza) su piatti rivestiti con la proteina della matrice extracellulare hanno innescato-stato pluripotenza 4, nel 2013 il laboratorio di Jacob Hanna ha mostrato che le cellule di pluripotenza innescata possono essere convertite in uno stato di pluripotenza ingenuo esponendo al medium di cellule staminali umane ingenuo (NHSM) contenente inibitori chimici di protein chinasi ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, e p38 MAPK, nonché fattori di crescita LIF, TGF, bFGF5. Da sportelli unici umano ingenuo-pluripotenza, nel 2015 un gruppo di ricerca guidato da Hanna e Azim Surani compiuta la prima produzione robusta delle cellule umane PGC-Like (hPGCLCs) da sportelli unici6. Diversi altri laboratori, compreso il nostro, riferì più tardi, generazione di hPGCLCs da sportelli unici utilizzando protocolli leggermente diverso7,8,9,10. Il nostro studio ha fornito prova che hPGCLCs generato utilizzando protocolli diversi (che sono riassunti nella tabella S1 del nostro studio precedentemente pubblicato10) sono transcriptomally simili a vicenda10. Disponibile prova sostiene la somiglianza di PGCLCs umana alla fase iniziale PGC embrionale umano prima della cancellazione epigenetici globale7 e/o migrazione chemiotattica10.
Studi di mouse PGC embrionali del mouse PGCLCs e PGCLCs umano (ma solo con un accesso molto limitato a umano PGC) hanno rivelato che meccanismi molecolari della specifica di PGC differiscono significativamente tra mouse e umano1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Ad esempio, Prdm14 gioca ruoli critici nella specifica di PGC in embrioni di topo, ma proprio ruolo nella specifica di PGC umana sembra limitato1,15. Al contrario, induzione di SOX17 di EOMESODERMIN è essenziale per PGC specifica6,11,14, considerando che questi fattori di trascrizione sembrano superflui per mouse PGC specifica15. Questi risultati iniziali degli studi usando hPGCLCs fortemente sostengono l'importanza di questo modello della coltura cellulare come un surrogato di PGC embrionale umano.
Studi recentemente pubblicati, che coinvolgono valutazione sequenziamento profondo del nostro laboratorio di analisi numero genomic del DNA copia, hanno dimostrato che il mantenimento prolungato degli sportelli unici nello stato di pluripotenza ingenuo aumenta significativamente il rischio di instabilità cromosomica e anomalie strutturali. Questo fenomeno è stato osservato sia con mouse18 umana19 sportelli unici. Il protocollo originale di produzione hPGCLC segnalato da Hanna/Surani è stato sviluppato per sportelli unici umani mantenuti nel mezzo di pluripotenza 4i ingenuo per almeno 2 settimane6. Per preservare il cariotipo diploide normale umano sportelli unici e PGCLCs, abbiamo sviluppato un protocollo modificato in cui sportelli unici umani sono esposte al mezzo di 4i per solo 72 ore10, che viene presentato in questo articolo. IPSCs umane (hiPSCs) sono mantenuti sotto lo stato di pluripotenza innescata. Immediatamente prima della formazione di EB, le cellule vengono incubate a 4i naïve riprogrammante medio (un mezzo NHSM modificato) per 48 ore. Cellule sono poi dissociate e confezionate nei micropozzetti a modulo EBs per altre 24 ore nel medium 4i. EBs sono mantenute in medium di induzione di hPGCLC contenente un'alta concentrazione di BMP4 umana ricombinante in una condizione di dondolo per cultura no-collegamento per fino a 8 giorni per ottenere la massima resa di hPGCLCs. Dopo coltura EB 8 giorni, hPGCLCs può essere isolato dalle cellule dissociate di EB da FACS come cellule CD38 + con ~ 40% di resa in FACS-ordinabile sospensione unicellulare. Considerando che altro pubblicato metodi7,8,9, compreso il protocollo originale prima di nostre modifiche6, generare in genere hPGCLCs in aggregati cellulari spontaneamente formate senza specifica localizzazione, hPGCLC prodotta dal nostro protocollo si osservano sulla superficie dei corpi embryoid (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Cellule germinali primordiali (PGC) sono precursori comuni di tutte le cellule germinali. In embrioni di topo, una popolazione fondatore di ~ 40 PGC sono indotti da cellule pluripotenti epiblasto da esposizioni orchestrate di citochine, compreso proteina morfogenetica dell'osso (Bmp4) 4. Negli embrioni umani, il PGC più in anticipo sono stati identificati sulla parete endodermica del sacco vitellino intorno alla fine della settimana 3rd della gestazione, ma piccolo è conosciuto circa il processo di specifica di PGC umano e loro sviluppo iniziale. Per aggirare gli ostacoli tecnici ed etici di studiare PGC embrionale umano, modelli di coltura cellulare di surrogati sono stati recentemente generati da cellule staminali pluripotenti. Qui, descriviamo un protocollo 13 giorni per la produzione di robusta delle cellule umane di PGC-Like (hPGCLCs). Cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) mantenute nello stato di pluripotenza innescato sono incubate nell'ingenuo 4i riprogrammazione medio per 48 ore, dissociate in cellule singole e pranzo nei micropozzetti. Mantenimento prolungato di hiPSCs nello stato di pluripotenza ingenuo provoca significative aberrazioni cromosomiche e dovrebbe essere evitato. hiPSCs nei pozzetti sono mantenuti per un ulteriore 24 ore nel medium 4i per formare corpi embryoid (EBs), che vengono poi coltivate in basso-aderenza plasticware sotto una condizione a dondolo nel mezzo di induzione hPGCLC contenente un'alta concentrazione di ricombinante umano BMP4. EBs sono ulteriormente coltivate per fino a 8 giorni nella condizione a dondolo, non aderente per ottenere rendimenti massimi di hPGCLCs. Da immunohistochemistry, hPGCLCs vengono prontamente rilevati come cellule esprimenti fortemente OCT4 in quasi tutte le EBs esclusivamente sulla loro superficie. Quando EBs sono enzimaticamente dissociato e sottoposti ad arricchimento di FACS, hPGCLCs possono essere raccolti come cellule CD38 + con fino a 40-45% rendimento.

La piastra microtiter usata qui è in formato 24 pozzetti e ha 8 pozzetti che tiene i fogli microtiter, ognuno dei quali supporta la formazione di fino a 1.200 EBs. Da circa 24 milioni di cellule di pluripotenza 4i naïve, questa piastra microtiter genera tipicamente ~ 8.000 EBs che consiste di cellule ~ 3.000 per EB. Durante la coltura non aderente di EBs con dondolo costante, il numero di EBs intatto gradualmente diminuisce a causa di auto-demolizione spontanea e ~ 3.000 EBs sopravvivere fino al giorno 13 del protocollo. La maggior parte di questi sopravvissuti EBs hanno 50-200 hPGCLCs sulla loro superficie (stimato tramite rilevazione immunohistochemical di OCT4 + celle nelle sezioni seriali di EBs; vedere la Figura 8), producendo ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs in totale. Digestione enzimatica di EBs in singole celle è un processo relativamente inefficiente, riducendo la resa di FACS-arricchita CD38 + hPGCLCs a 9.000-47.000 celle. Nelle nostre mani, una media di sei lotti indipendenti ma consecutivi di esperimenti è stata 14.038 ± 5.731 (media ± SEM). Perché delle cellule CD38-negativi EB express OCT4 mRNA (qPCR) o proteine (immunoistochimica) solo molto debolmente, se non completamente assente, tutte le celle EB fortemente che esprimono la proteina OCT4 sono praticamente equivalente a tutta la popolazione del CD38 + hPGCLCs.
Il parametro critico di questo protocollo comprende la densità delle cellule. Quando 2.0 x 105 umano iPSCs vengono inoculati in una tabella extracellulare bene di piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti (area di crescita di2 cm 9,60 per pozzetto) con 2 mL di terreno di Y27632-completati (2.2.9) rivestite con proteine, cellule raggiungerà a circa 20-30% confluenza alle 24 ore dopo l'inoculazione (Figura 1). Dopo un'ulteriore 24 ore cultura nel medio mTeSR1 in assenza di Y7632, aggregati di cellule e formano colonie, che occupa circa il 30% della zona di crescita (Figura 2). Le cellule sono poi coltivate nel mezzo di riprogrammazione 4i (2.3.2). Dopo 24 ore di cultura in confluent cellule diventano medi, 4i (Figura 3). Una cultura di 24 ore aggiuntiva nel medium 4i rende le cellule densamente imballato (Figura 4). L'esatta tempistica di cambiamento medio (ogni 24 ore + /-4 ore) e la densità delle cellule sono fondamentali per la formazione di successo di EBs e hPGCLCs.
Dopo 48 ore cultura nel medium 4i, cellule sono dissociate e inoculate alla piastra microtiter, che ha 400 µm pozzi in dimensione (2,4). Anche se questa piastra microtiter commercialmente disponibile è rivestita per superficie a bassa aderenza dal produttore, fresco ricoprirli con detergente (2.4.3) è consigliato per ridurre il rischio di adesione delle cellule indesiderate. 800 µm micropozzetti provocato dalla resa del hPGCLCs, suggerendo l'importanza della dimensione EB per differenziazione correttamente diretto. Cellule inoculate nel medium 4i formerà EBs in micropozzetti a 24-30 ore, che può essere osservate utilizzando un standard, invertito microscopio di contrasto fase (Figura 5). Il contorno circolare di EBs diventano chiaramente visibili e dopo 24 ore di incubazione. EBs la raccolta in un momento precedente (es. 16 ore dopo l'inoculazione) prima di loro contorno circolare è chiaramente visibile non è raccomandato perché tale EBs sono molto vulnerabili a danni meccanicistici e smontare facilmente. Si noti che una quantità significativa di hiPSCs ingenuo non è incorporata in EBs, che è normale. Queste cellule non incorporate saranno lavate via prima dell'inizio del dondolo cultura di EBs sulla superficie di basso-aderente (2.5.2). Si noti inoltre che, nel nostro protocollo, EBs si formano nel mezzo di pluripotenza 4i ingenuo - non nel mezzo di hPGCLC. Pre-formazione di EBs solido nel medium 4i prima dell'esposizione al medium hPGCLC è importante per la distribuzione di hPGCLCs sulla superficie di EBs.
EBs mantenuto nel medio hPGCLC sotto un dondolo, condizione di cultura non aderenti manterranno la loro forma sferica senza aggregazione o fusion (Figura 6 e Figura 7). Troppo debole a dondolo condizione causerà EB aggregazione e fusione, ma troppo dura condizione sarà smontare EBs. PGCLCs umana emerge come OCT4-esprimendo le cellule sulla superficie della EBs dopo più presto la cultura di 5 giorni nel mezzo di hPGCLC e il loro numero aumenta fino a quando la cultura di 8 giorni (Figura 8). Ulteriore incubazione di EBs può causare lo smantellamento di EBs e perdita di hPGCLCs. PGCLCs umana potrà essere arricchito dalle cellule EB enzimaticamente dissociate dopo 5-8 giorni di cultura in medium hPGCLC da FACS come cellule CD38 + (Figura 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figura 1: coltura delle cellule umane iPSC in medium Y27632-completato 24 ore dopo l'inoculazione. Densità delle cellule è di circa 20-30% confluenti. In presenza di inibitore di roccia Y27632, le cellule tendono a diffondersi bene con allungamento lungo, spike-come. Scala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figura 2: coltura delle cellule umane iPSC 48 ore dopo l'inoculazione. Aggregazione di formare le colonie, che occupa circa il 30% dell'area di crescita di cellule. Scala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figura 3: coltura delle cellule umane iPSC incubate nel mezzo di riprogrammazione 4i per 24 ore. Le cellule di raggiungere alla confluenza. Scala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figura 4: coltura delle cellule umane iPSC incubate nel mezzo di riprogrammazione 4i per 48 ore. Cellule confluenti sono densamente imballate. Scala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figura 5: iPSC umano EBs formato in micropozzetti dopo incubazione di 24 ore nel 4i riprogrammazione medio. Il contorno circolare di EBs diventano visibili a 24-30 ore dopo l'inoculazione. Quando il contorno è confermato sotto un microscopio a contrasto di fase, EBs sono pronti per il trasferimento ad una condizione di cultura a dondolo. Barra della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figura 6: iPSC umano EBs incubati per 24 ore nel medio hPGCLC. EBs in gran parte mantengono la loro forma sferica. Barra della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figura 7: iPSC umano EBs incubati per 192 ore nel medio hPGCLC. EBs sono allargata rispetto alla loro apparizione presso 24 ore cultura, ma mantengono ancora in gran parte forme sferiche con nessuna aggregazione o fusion. Barra della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figura 8: PGCLCs umana esprimendo OCT4 sono localizzati sulla superficie del hiPSC EBs incubati per 192 ore nel medio hPGCLC. EBs sono stati incorporati nella proteina della matrice extracellulare e trattati per FFPE diapositiva macchiatura immunohistochemical di OCT4 (substrato DAB). Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figura 9: PGCLCs umano sono arricchite dalle cellule di EB enzimaticamente dissociate da FACS come CD38+ cellule. Dopo l'incubazione nel mezzo hPGCLC per 5-8 giorni, EBs può essere dissociato dalla digestione enzimatica per preparare la sospensione unicellulare. hPGCLCs può essere arricchito come CD38+ cellule di FACS (punti rossi). Cellule EB che non esprimono CD38 (puntini blu) devono essere raccolti anche come controllo negativo. Cancelli di FACS delle cellule CD38-positive e CD38-negativi devono essere separati con un ampio margine (punti verdi) per evitare la contaminazione di ogni tipo di cellule. I pannelli superiori e inferiori mostrano profili di FACS senza o con l'anticorpo anti-CD38 macchiatura, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Cellule germinali primordiali (PGC) sono precursori comuni di uova e sperma. PGC embrionale umano vengono specificati da cellule pluripotenti dell'epiblasto attraverso interazioni delle citochine. Qui, descriviamo un protocollo di 13 giorni di indurre le cellule umane transcriptomally PGC di somiglianza alla superficie dei corpi embryoid da cellule staminali pluripotenti di innescato-pluripotenza indotta.

Cellule staminali pluripotenti indotte generazione umana primordiale delle cellule di germe-come delle cellule sulla superficie dei corpi Embryoid da pluripotenza innescato

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo tossicologico della linea germinale umana, come il modo in cui vengono creati o riparati i danni nel genoma delle cellule germinali primordiali umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule germinali primordiali umane possono essere generate in due settimane dalle cellule iPS a pluripotenza innescate che ospitano un background genetico di predisposizione della malattia. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la prevenzione della compromissione genomica nelle cellule germinali umane, perché il nostro modello di coltura cellulare può aiutarci a ridurre la tossicità germinale di un farmaco terapeutico.Per iniziare con la generazione di cellule germinali primordiali umane, o PGCLC umani, preparare piastre rivestite di proteine a matrice extracellulare e sospensione cellulare degli iPSC umani, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una sospensione a singola cellula degli iPSC umani a pluripotenza innescata nel mezzo mTeSR1 contenente l'inibitore della rho chinasi Y-27632. Regolare con cura la densità cellulare a 100.000 cellule per millilitro.Inoculare due millilitri di sospensione cellulare di iPSC umani innescati in ogni pozzo della proteina della matrice extracellulare rivestita con piastre a sei possedimenti, assicurandosi che le cellule siano distribuite uniformemente scuotendo le piastre verticalmente e orizzontalmente. Incubare le piastre in un incubatore di CO2 tri-gas a 37 gradi Celsius. È molto importante inoculare esattamente 200.000 cellule in ogni pozzo di una piastra di sei posse.Il conteggio accurato delle cellule è fondamentale. Dopo il completamento della conversione transitoria in pluripotenza ingenua, le cellule dovrebbero apparire troppo confluenti, il che è normale. La tempistica esatta del cambiamento medio è importante per ottenere alti PGCLC umani e riproducibilità sperimentale.La densità della coltura 4i hiPSC è alta in queste condizioni, e si prevede che la cellula diventi confluente alle 48-72 ore successive all'inoculazione. 24 ore dopo l'inoculazione, cambiare il mezzo con due millilitri per pozzo di mezzo mTeSR1 senza Y27632. Inizia la conversione degli iPSC umani allo stato di pluripotenza innescati in 4i ingenue cellule staminali pluripotenti, riscaldando 50 millilitri di mezzo completo 4i in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti.A 48 e 72 ore dall'inoculazione, rimuovere le piastre dall'incubatore e cambiare il mezzo con 2 millilitri per pozzo di mezzo completo 4i. Centrifugare la piastra microwell rivestita con detersivo a 1.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Ispezionare i pozzi con microscopio invertito per garantire l'assenza di bolle d'aria.Risciacquare i pozzi come descritto nel protocollo di testo e ripetere la centrifugazione. Aggiungere 4i mezzo completo ai pozzali risciacquati. Centrifugare la piastra a 1.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente e ispezionare nuovamente i pozzi.Per inoculare 4i iPSC umani nella piastra microwell, preparare la sospensione cellulare iPSC umana come descritto nel protocollo. Filtrare questa sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare di dimensioni dei pori di 40 micrometri per rimuovere gli aggregati cellulari. Lavare il colino con un millilitro di mezzo completo 4i pre-riscaldato tre volte per raccogliere tutte le cellule dal colino e contare le cellule con un contatore di coltura.Quindi, diluire questa sospensione a singola cellula di 4i iPSC umani ingenui a 27-32,4 milioni di cellule in 9 millilitri pre-riscaldato 4i mezzo completo contenente Y27632. Rimuovere la piastra di microwell precedentemente preparata contenente 1 millilitro di 4i mezzo completo per pozzo da un incubatore di tri-gas. Inoculare 1 millilitro di 4i ingenua sospensione iPSC umana in ogni pozzo, per raggiungere una concentrazione da 3,0 a 3,6 milioni di cellule per pozzo.Pipettare delicatamente per distribuire uniformemente le cellule. Centrifugare la piastra a 100 g per 3 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra in un incubatore di CO2 a tri-gas, assicurandosi di non disturbare le cellule pellettate in microliette e incubare per 24-30 ore, perché un'incubazione notturna è insufficiente per la formazione di corpi embrionali stretti o EB.Prewarm 5 millilitri di mezzo basale PGCLC umano e 20 millilitri di mezzo completo PGCLC umano per almeno cinque minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius Posizionare con cura un colino cellulare di dimensioni pori di 40 micrometri capovolto su un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri. Per staccare gli EB dai microwell, pipettare delicatamente ogni pozzo della piastra. Per rimuovere le celle non incorporate negli EB, filtrare il contenuto di tutti i pozzi attraverso il filtro cellulare.Lavare delicatamente gli EB trattenuti sulla membrana del filtro cellulare con 1 millilitro di mezzo basale PGCLC umano preri riscaldato e ripetere il lavaggio cinque volte. Posizionare un tubo conico fresco da 50 millilitri sul filtro cellulare, in modo che il filtro cellulare sia ora posizionato sul lato destro verso l'alto nel nuovo tubo. Invertire rapidamente il filtro cellulare con il nuovo tubo, che posizionerà gli EB sotto la membrana del filtro cellulare.Aggiungere 18 millilitri di pgclc umano prerifabbricato mezzo completo alla membrana del filtro cellulare per raccogliere gli EB nel tubo conico. Quindi, piastra 3 millilitri per pozzo della sospensione di EB in pozzi di una piastra a sei pozzi a basso attacco. Posizionare la piastra su un rocker a vista in un incubatore di tri-gas e impostare con cura la velocità di dondolo a circa 20 giri al minuto.Il settimo e il 13° giorno dell'esperimento, preparare appena 20 millilitri di mezzo completo PGCLC umano ogni giorno. Rimuovere la piastra dal rocker, che farà affondare gli EB sul fondo dei pozzi. Rimuovere il vecchio mezzo senza asciugare gli EB in modo che in ogni pozzo rimangano circa 0,2 millilitri di vecchio mezzo.Aggiungere 3 millilitri per pozzo di mezzo completo PGCLC umano fresco, dopo aver rimosso il vecchio mezzo ogni giorno. Per identificare i PFC umani come cellule positive agli OCT4, raccogliere gli EB in un tubo di microcentrifugo a bassa legante da 1,5 millilitri. Lasciare che gli EB affondino verso il basso a temperatura ambiente e scartare il mezzo.Risciacquare gli EB con 1X PBS ghiacciato. Dopo aver rimosso il PBS, incubare gli EB in 1 millilitro di ghiaccio freddo 1% di peso in volume azide di sodio in PBS sul ghiaccio per cinque minuti. Lasciare che gli EB sprofondno verso il basso a temperatura ambiente.Dopo aver scartato il supernatante, sciacquare gli EB con PBS ghiacciato. Scongelare 200 microlitri di proteine della matrice extracellulare sul ghiaccio. Aggiungere la proteina al tubo contenente EB.Lasciare il tubo a temperatura ambiente per circa 10 minuti, fino a quando il gel non viene solidificato e gli EB sono incorporati. Per fissare gli EB, aggiungere 1 millilitro di formaldeide al 4% in PBS al tubo e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti con un dolce dondolo. Successivamente, scartare la formaldeide e sciacquare gli EB una volta con PBS ghiacciato.Aggiungere 1 millilitro di 70% di etanolo. Conservare in etanolo al 70% a 4 gradi Celsius per un massimo di una settimana o procedere alla loro valutazione con un protocollo FFPE standard. La densità cellulare e la distribuzione uniforme delle cellule su ogni pozzo sono fondamentali.Gli IPSC umani in 2 millilitri di Y27632 integrati media per pozzo di una piastra a sei pozzi, raggiungono il 20-30% di confluenza dopo 24 ore. Dopo un'ulteriore coltura di 24 ore nel mezzo mTeSR1, in assenza di Y27632, le cellule si sono aggregate e formate colonie, occupando circa il 30% dell'area di crescita. Dopo 24 ore di coltura nel mezzo di riprogrammazione 4i, le cellule hanno raggiunto la confluenza.Dopo altre 24 ore di coltura nel mezzo 4i, le cellule divennero più densamente imballate. Dopo un'incubazione di 24 ore in microliette nel mezzo di riprogrammazione 4i, le cellule formavano EB con il loro contorno circolare visibile a 24-30 ore dopo l'inoculazione. Gli EB tenuti nel mezzo PGCLC umano, in condizioni non a dondolo non arent, hanno mantenuto la loro forma sferica senza aggregazione dopo 24 ore.Dopo 192 ore, gli EB erano più grandi, mantenendo la stessa morfologia. Dopo 5 giorni, le cellule sono emerse come OCT4 esprimendo cellule sulla superficie degli EB, aumentando il loro numero dopo 8 giorni. Le cellule provenienti dalla sospensione a singola cellula dei PGCLC umani sono state arricchite come cellule CD38 positive dalla FACS.Le celle che non esprimono CD38 erano un controllo negativo. Per evitare la contaminazione, le porte FACS CD38-positive e CD38-negative sono state separate da un ampio margine. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire il conteggio esatto delle celle e i tempi di cambiamento medio.Omettere il cambiamento di mezzo anche un solo giorno, o ridurre il volume di quel mezzo in qualsiasi fase, può causare una massiccia morte cellulare. La velocità della coltura a dondolo dei corpi embrioidi deve essere attentamente ottimizzata.

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Biologia dello sviluppo

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...