Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi erkjenner Shiomi Yawata og Chie Owa for kundestøtte under innledende studier. Denne studien ble støttet ved NIEHS/NIH tilskudd R01 ES023316 og R21ES024861 til TS og flyvertinne Medical Research Institute (FAMRI) gi til JHH.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Robust produksjon av hPGCLCs ved hjelp av protokollen beskrevet her ble bekreftet med tre uavhengige kloner av menneskelig iPSCs med normal diploide karyotype10. Disse iPSC kloner var avledet fra samme neonatal dermal huden fibroblast celle kultur10. De vil bli gitt av forfatterne av denne artikkelen for etterforskerne på forespørsel og under riktige materialer overføringsavtalen og frakt arrangement av frosne levende menneskelige celler. Det er for øyeblikket ukjent om hvorvidt normal karyotype er nødvendig for robust hPGCLC produksjon våre protokollen eller rapporteringsstatistikker andre laboratorier.
Nyere studier har vist at produksjonen av hPGCLCs fra hiPSCs11 eller ESCs14 bruker en protokoll beskrevet av Saitous gruppe Kyoto University8 er avhengig av uttrykk for EOMESODERMIN, kreves en T-box transkripsjon faktor for induksjon av SOX17. SOX17 synes å fungere som master slektslinje utslagsgivende transkripsjon faktor germline atskilling av menneskelig pluripotent stamceller6. EOMESODERMIN er kodet av EOMES genet, CRISPR/Cas9 knockout av EOMES forårsaket nesten fullstendig fravær av SOX17 induksjon i hPGCLC produsere tilstanden11og uttrykk for andre gener fulgte samme mønster av SOX17 null knockout celler. Overuttrykte EOMESODERMIN fra en induserbart vektor i EOMES-null knockout celler under hPGCLC induksjon kultur effektivt reddet den robuste hPGCLC produksjon i tillegg til induksjon av germline gener, inkludert SOX17. Derimot indusert overuttrykte SOX17 også reddet robust PGCLC produksjon, men uten å indusere EOMES. Dermed EOMESODERMIN er en kritisk oppstrøms induser av SOX17, og dette synes enkelt viktigste rollen EOMESODERMIN i hPGCLC induksjon fra menneskelige pluripotent stamceller. Våre protokollen induserer SOX17 i hiPSCs10, men sin avhengighet av EOMESODERMINE induksjon venter skal bestemmes.
Denne protokollen konverterer primet pluripotency menneskelige iPSCs opprettholdt i mTeSR1 medium til ERK uavhengig naiv pluripotency i 96 timer i 4i omprogrammering middels6, som er en modifisert naiv menneskelige stamceller medium (NHSM)5. Våre forsøk på å generere hPGCLCs starter med de samme menneskelige iPSC Klonene men opprettholdt andre tilsvarede menneskelige iPSC vekst medier før kultur i 4i omprogrammering medium resulterte i varierende grad av lavere hPGCLC avkastning. Selv om langsiktige tilpasning i andre medier forbedrer hPGCLC produksjon eller ikke forblir avgjøres i fremtidige studier, denne observasjonen tyder på at den eksakte delstaten primet pluripotency av menneskelig iPSCs før 4i omprogrammering betydelig påvirker EB formasjonen i 4i medium og EB differensiering i hPGCLC medium.
Produksjon av hPGCLCs fra hiPSCs etter våre Protokoll er robust og svært reproduserbare, delvis på grunn av bruk av microwell platene som muliggjør effektiv produksjon av en rekke EBs (~ 8000 EBs per satsvis) med en enhetlig størrelse (3000 hiPSCs per EB). Antall EBs lett produsert i en enkelt bunke ved å bruke våre protokollen kan være langt større enn ved hjelp av vanlige U bunn celle kultur brønnene. Produksjonen av et stort antall like store EBs jevnt besatt med hPGCLCs kan gir unike muligheter høy gjennomstrømming kjemiske screenings å identifisere små molekyl vekt Aktivator eller hemmere påvirker PGC spesifikasjonen eller deres biologisk egenskaper som epigenetic omprogrammering. Slike EBs kan også være nyttig for toksikologiske vurderinger av store mengder germline celle giftstoffer, inkludert ikke bare miljøgifter, men også klinisk foreskrevet medisiner som chemotherapeutic agenter.
De kritiske faktorene av robust og reproduserbar produksjonen av hPGCLCs ved hjelp av presentert protokollen omfatter (i) bruk av sunn hiPSCs opprettholdt i mTeSR1 på ekstracellulær matrix proteiner, (ii) å vaksinere nøyaktig antall celler som spesifisert og strengt Følg tidsberegningen av medium endring og subkultur, (iii) å velge gode mange menneskelige rekombinant BMP4, og (iv) å minimere fysiske skader av EBs under rock kulturen. Det er vår erfaring at den beste masse BMP4 reagens jobbet på 100 ng/mL konsentrasjonen mens andre masse BMP4 reagenser kreves 2 X eller større doser. På den annen siden, avkastningen av hPGCLCs produksjon bruker den beste masse BMP4 ganske redusert ved høyere doser på BMP4 (f.eks 200 ng/mL). Vi anbefaler å teste flere forskjellige partier av rekombinant menneskelige BMP4 reagenser fra flere leverandører for sine prestasjoner i støtte hPGCLC generasjon og å sikre en stor mengde beste partiet.
En unik funksjon i vårt hPGCLC-protokollen er at hPGCLCs er lokalisert på ytterste overflatelaget av EBs10 (Figur 8), mens andre protokoller kan generere hPGCLCs i celle aggregater6,8. Embryoid organer har en tendens til å danne flere forskjellige lag som overflaten, ytre skall, indre skall og kjernen, og regionene sentrale kjernen er ofte nekrotisk på grunn av begrenset tilførsel av næringsstoffer, oksygen, samt pro-overlevende vekstfaktorer gitt skjemaet kultur middels av diffusjon20. Lokalisering av hPGCLCs på overflaten av EBs uten mulige restriksjoner på grunn av begrenset diffusjon mot midten av EBs kan være fordelaktig for direkte, tid - og dose-kontrollerte eksponering av hPGCLCs til narkotika eller giftige stoffer for farmakologisk eller toksikologiske studier.
Mens musen PGCLCs Vis robust genomet hele DNA demethylation involverer preging kontrollerer regioner minst delvis synes7,19,20, graden av global gDNA demethylation i hPGCLCs svakere enn mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler foreslår at hPGCLCs kan ligne på et tidligere tidspunkt under embryonale PGCs enn musen PGCLCs10. Det har blitt rapportert at langvarig kultur EBs under forutsetning av hPGCLC produksjon forårsaket en økt grad av gDNA demethylation7; imidlertid om lengre kulturen i hPGCLCs i EBs eller som isolert celler kan oppnå mer avanserte stadier av germline differensiering må bestemmes av fremtidige studier.

Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for alle germline celler i begge kjønn. De fleste av vår kunnskap om utviklingen av PGCs i pattedyr embryoer er innhentet gjennom å studere laboratoriet mus1,2. For embryonale dag 6.0-6.5 med musen embryo, er 6 eller lignende lite antall PGC prekursorer plassert i epiblast og grunnla innbyggere ~ 40 PGCs er indusert av dem på en måte avhengig av bein Morfogenetiske proteiner Bmp2 og Bmp4 skilles ut fra tilstøtende celler. De tidligste menneskelige PGCs hittil identifisert i embryo var på endodermal veggen av eggeplomme sac på rundt slutten av tredje uke av svangerskapet3. Fordi dette er samme sted som overfører PGCs er observert i mouse embryoer, er det sannsynlig at de observerte menneskelige PGCs var i veien for overføring, men ikke grunnleggelsen befolkningen. Men studier spore tilbake tidligere stadier av PGCs eller PGC forløpere i menneskelige embryo har vært savnet.
Menneskelige embryonale PGCs er utfordrende på grunn av både tekniske og etiske hindringer. For å overvinne disse hindringene, har PGC-lignende celle kultur modeller nylig generert fra menneskelige pluripotent stamceller (PSCer). Pluripotency er mobilnettet evnen til å differensiere i germline og tre embryonale bakterie lag4. Mens menneskelige PSCer opprettholdt i mTeSR1 medium (en klar til bruk, kommersielt tilgjengelig mellom formulert for vedlikehold av menneskelig PSCer tilstanden primet pluripotency) retter belagt med ekstracellulær matrix protein har primet statuser pluripotency 4, i 2013 Jacob Hanna lab viste at primet pluripotency cellene kan konverteres til en naiv pluripotency tilstand ved å utsette til naiv menneskelige stamceller medium (NHSM) som inneholder kjemiske hemmere til protein kinaser ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, p38 MAPK samt vekstfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Fra naiv-pluripotency menneskelige PSCer, i 2015 oppnådd en forskningsgruppe ledet av Hanna og Azim Surani den første robust produksjonen av menneskelige PGC-Like celler (hPGCLCs) fra PSCer6. Senere rapporterte flere andre laboratorier, inkludert vår, generasjon hPGCLCs fra PSCer bruker litt forskjellige protokoller7,8,9,10. Vår studie gitt bevis for at hPGCLCs generert ved hjelp av forskjellige protokoller (som er oppsummert i tabellen S1 våre tidligere publisert studie10) transcriptomally som ligner hverandre10. Tilgjengelige bevis støtter likheten med menneskelige PGCLCs til tidlig stadium menneskelige embryonale PGCs før den globale epigenetic sletting7 og/eller chemotactic overføring10.
Studier av mus embryonale PGCs mus PGCLCs og menneskelig PGCLCs (men med bare svært begrenset tilgang til menneskelig PGCs) har avdekket at molekylære mekanismer PGC-spesifikasjonen variere betydelig mellom musen og menneskelige1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. For eksempel Prdm14 spiller viktige roller i PGC spesifikasjonen i mouse embryoer, men dens rolle i menneskets PGC spesifikasjon synes begrenset1,15. Derimot er induksjon av SOX17 av EOMESODERMIN viktig for PGC spesifikasjon6,11,14, mens disse transkripsjonsfaktorer synes unnværlig for musen PGC spesifikasjon15. Disse første resultatene av studier med hPGCLCs sterkt støtte betydningen av denne cellen kultur modellen som et surrogat av menneskelige embryonale PGCs.
Nylig publiserte studier, som involverer våre laboratoriets dyp sekvensering evaluering av genomisk DNA kopi nummer analyse, har vist at langvarig vedlikehold av PSCer i naiv pluripotency staten betydelig øker risikoen for chromosomal ustabilitet og strukturelle anomalier. Dette fenomenet ble observert med både mus18 og menneskelige19 PSCer. Den originale hPGCLC produksjon protokollen rapportert av Hanna/Surani ble utviklet for menneskelig PSCer vedlikeholdes i 4i naiv pluripotency medium for minst 2 ukers6. For å bevare den normale diploide karyotype av menneskelige PSCer og PGCLCs, utviklet vi en endret protokoll som menneskelige PSCer er utsatt for 4i mediet for bare 72 timer10, som presenteres i denne artikkelen. Menneskelig iPSCs (hiPSCs) vedlikeholdes under primet pluripotency staten. Umiddelbart før EB formasjon, er celler ruges i 4i naiv reprogramming medium (en modifisert NHSM medium) i 48 timer. Celler deretter avstand og pakket i microwells skjemaet EBs for ytterligere 24 timer i 4i medium. EBs vedlikeholdes i hPGCLC induksjon medium som inneholder en høy konsentrasjon av rekombinant menneskelige BMP4 under en rocking tilstand for ikke-vedlegg kultur for opp til 8 dager å få maksimalt utbytte av hPGCLCs. Etter 8-dagers EB kultur, kan hPGCLCs være isolert fra avstand EB celler av FACS som CD38 + celler med opp til ~ 40% avkastning i FACS-sorterbar enkeltcelle suspensjon. Mens andre publisert genererer metoder7,8,9, inkludert originale protokoll før våre modifikasjoner6, vanligvis hPGCLCs i spontant dannet celle aggregater uten spesifikk lokalisering, hPGCLC produsert av våre protokollen er observert på overflaten av embryoid organer (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for alle germline celler. I mouse embryoer, ~ 40 PGCs grunnleggelsen innbyggere er indusert fra pluripotent epiblast celler av orkestrert eksponeringer til cytokiner, inkludert bein Morfogenetiske proteinet 4 (Bmp4). I menneskelige embryoer, de tidligste PGCs identifisert på endodermal veggen av eggeplomme sac rundt slutten av det 3rd uke av svangerskapet, men lite er kjent om menneskelig PGC spesifikasjon og deres tidlig utvikling. For å omgå tekniske og etiske barrierer av studere menneskelige embryonale PGCs, har surrogat celle kultur modeller nylig generert fra pluripotent stamceller. Her beskriver vi en 13 dagers protokoll for robust produksjon av menneskelige PGC-Like celler (hPGCLCs). Menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) opprettholdes tilstanden primet pluripotency ruges i 4i naive omprogrammering medium i 48 timer, avstand til enkeltceller og pakket inn i microwells. Langvarig vedlikehold av hiPSCs i naiv pluripotency staten forårsaker betydelig chromosomal avvik og bør unngås. hiPSCs i microwells opprettholdes for en ekstra 24 timer i 4i medium til skjemaet embryoid organer (EBs), som deretter kultivert i lav-etterlevelse plasticware under en rocking tilstand i hPGCLC induksjon medium som inneholder en høy konsentrasjon av rekombinant menneskelige BMP4. EBs er mer kultivert for opp til 8 dager rock, ikke-tilhenger tilstanden å oppnå maksimal avkastning av hPGCLCs. Av immunhistokjemi oppdages hPGCLCs lett som celler uttrykke sterkt OCT4 i nesten alle LoF utelukkende på overflaten deres. Når EBs enzymatisk avstand og utsatt for FACS berikelse, hPGCLCs kan hentes som CD38 + celler med opp til 40-45% avkastning.

Microwell platen brukes her i 24-vel format og har 8 brønner holder microwell ark, hver støtter dannelsen av opptil 1200 EBs. Fra ca 24 millioner 4i naiv pluripotency celler, denne microwell platen vanligvis genererer ~ 8000 EBs bestående av ~ 3000 celler per EB. Under ikke-tilhenger kultur for EBs med konstant rock, antall intakt EBs gradvis minsker spontane selv demontering og ~ 3000 EBs overleve til dag 13 i protokollen. De fleste av disse overlevende EBs har 50-200 hPGCLCs på overflaten deres (anslått av immunohistochemical påvisning av OCT4 + celler i seriell deler av EBs, se Figur 8), gir ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs totalt. Enzymatisk fordøyelsen av EBs enkeltceller er en relativt ineffektiv prosess, å redusere avkastningen av FACS-beriket CD38 + hPGCLCs til 9000-47.000 celler. I våre hender var gjennomsnittlig seks uavhengige men påfølgende grupper av eksperimenter 14,038 ± 5,731 (mener ± SEM). Fordi CD38-negativ EB celler celler uttrykke OCT4 mRNA (qPCR) eller protein (Immunohistochemistry) veldig svakt, om ikke helt fraværende, alle EB celler sterkt uttrykke OCT4 protein er praktisk talt lik med hele befolkningen i CD38 + hPGCLCs.
Parameteren kritisk til denne protokollen inneholder cellen tetthet. Når 2.0 x 105 menneskelig iPSCs er inokulert i en ekstracellulær matrix proteiner-belagt godt av 6-vel celle kultur plate (9.60 cm2 vekstområde per brønn) med 2 mL Y27632-supplert medium (2.2.9), cellene kommer til ca 20-30% confluency på 24 timer etter vaksinering (figur 1). Etter en ekstra 24 timers kultur i mTeSR1 medium i fravær av Y7632, celler samlet og skjemaet kolonier, opptar ~ 30% av området vekst (figur 2). Celler er så kultivert i 4i reprogramming medium (2.3.2). Etter 24 timer for kultur i 4i middels, celler bli confluent (Figur 3). En ekstra 24 timers kultur i 4i medium gjør celler tett pakket (Figur 4). Eksakt tidspunkt for medium endring (hver 24 timer +/-4 timer) og celle tettheter er kritiske for vellykket formasjon på EBs og hPGCLCs.
Etter 48-timers kultur i 4i medium, er celler atskilt og inokulert av microwell platen, som har brønner 400 µm i størrelse (2,4). Selv om denne kommersielt tilgjengelig microwell plate er belagt er lav-vedheft overflaten av produsenten, frisk re belegg med vaskemiddel (2.4.3) anbefalt å redusere risikoen for uønskede celleadhesjon. 800 µm microwells førte til redusert utbytte av hPGCLCs, foreslå betydningen av EB størrelse for riktig rettet differensiering. Celler inokulert i 4i medium vil danne EBs microwells på 24-30 timer, som kan observeres med et standard, invertert fase kontrast mikroskop (figur 5). Sirkulær konturene av EBs bli synlig på og etter 24 timers inkubasjon. Høsting EBs på et tidligere tidspunkt (f.eks timer etter vaksinering) før deres sirkulær contour er tydelig anbefales ikke fordi slike EBs er svært sårbare for mekanistisk skader og lett demontere. Merk at betydelige mengder naive hiPSCs ikke er innlemmet i EBs, som er normalt. Disse kommunefritt cellene vil bli vasket vekk før start av rocking kultur EBs på lav-tilhenger overflate (2.5.2). Merk også at i våre protokollen, EBs er dannet i 4i naiv pluripotency medium - ikke i hPGCLC medium. Før dannelsen av solid EBs i 4i medium før eksponering for hPGCLC mediet er viktig for distribusjon av hPGCLCs på overflaten av EBs.
EBs opprettholdt i hPGCLC medium under en gynge, ikke-tilhenger kultur tilstand vil opprettholde sin sfærisk form uten aggregasjon eller fusion (figur 6 og figur 7). For svak rocking tilstand vil føre EB aggregering og fusion, men for harde tilstand vil demontere EBs. Menneskelige PGCLCs fremstå som OCT4-uttrykke celler på overflaten av EBs etter så tidlig som 5 dagers kultur i den hPGCLC mediet, og deres antall øker til 8-dagers kultur (Figur 8). Ytterligere inkubasjonstiden for EBs kan forårsake demontering EBs og tap av hPGCLCs. Menneskelige PGCLCs kan bli beriket fra enzymatisk dissosiert EB celler etter 5-8 dager av kulturen i hPGCLC medium av FACS som CD38 + celler (figur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figur 1: Human iPSC cellekultur i Y27632-supplert medium 24 timer etter vaksinering. Cellen tetthet er ca 20-30% confluent. I nærvær av ROCK inhibitor Y27632, celler har tendens til spre godt med lange, spike-lignende forlengelse. Skala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figur 2: Human iPSC cellekultur 48 timer etter vaksinering. Celler samlet til skjemaet kolonier, med ~ 30% av vekstområde. Skala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figur 3: Human iPSC cellekultur ruges i 4i reprogramming medium i 24 timer. Celler nå til confluency. Skala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figur 4: Human iPSC cellekultur ruges i 4i reprogramming medium i 48 timer. Confluent celler er tett pakket. Skala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figur 5: Human iPSC EBs dannet i microwells etter 24-timers inkubasjon i 4i omprogrammering medium. Sirkulær konturene av EBs blir synlige på 24-30 timer etter vaksinering. Når konturen bekreftes under fase kontrast mikroskop, EBs er klare for overføring til en rocking kultur tilstand. Skala bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figur 6: Human iPSC EBs ruges i 24 timer i hPGCLC medium. EBs hovedsakelig opprettholde sin sfærisk form. Skala bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figur 7: Human iPSC EBs ruges 192 timer i hPGCLC medium. EBs blir forstørret sammenlignet med utseendet på 24-timers kultur, men de har fortsatt i stor grad sfærisk figurer uten aggregering eller fusjon. Skala bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figur 8: Human PGCLCs uttrykke OCT4 er lokalisert på overflaten av hiPSC EBs ruges 192 timer i hPGCLC medium. EBs var innebygd i ekstracellulær matrix proteiner og behandlet for FFPE lysbilde immunohistochemical farging av OCT4 (DAB substrat). Skala bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figur 9: Human PGCLCs er anriket fra enzymatisk dissosiert EB celler av FACS som CD38+ celler. Etter inkubasjon i hPGCLC medium for 5-8 dager kan EBs bli atskilt av enzymatisk fordøyelse å forberede enkeltcelle suspensjon. hPGCLCs kan bli beriket som CD38+ celler av FACS (røde prikker). EB celler som ikke uttrykker CD38 (blå prikker) skal også samles som negativ kontroll. FACS gates CD38 positive og CD38-negativ celler skal skilles med et bredt margin (grønne prikker) å unngå forurensning av alle typer celler. Øvre og nedre panelene viser FACS profiler uten eller med anti-CD38 antistoff flekker, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial bakterie celler (PGCs) er vanlige forløpere for både sæd og egg. Menneskelige embryonale PGCs angis fra pluripotent epiblast celler gjennom interaksjoner av cytokiner. Her beskriver vi en 13 dagers protokoll for å indusere menneskelige celler transcriptomally ligner PGCs på overflaten av embryoid organer fra primet-pluripotency indusert pluripotent stamceller.

Generasjon av menneskelige Primordial bakterie celle-lignende celler på overflaten av Embryoid organer fra primet pluripotency indusert Pluripotent stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i det menneskelige germline toksikologifeltet, for eksempel hvordan skader i genomet til menneskelige primordiale bakterieceller opprettes eller repareres. Den største fordelen med denne teknikken er at menneskelige primordiale bakterieceller kan genereres i to uker fra primet pluripotency iPS celler som huser sykdom predisposisjon genetisk bakgrunn. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot forebygging av genomisk svekkelse i humane germlineceller, fordi vår cellekulturmodell kan hjelpe oss med å redusere germline toksisitet av et terapeutisk legemiddel.Til å begynne med generering av humane primordiale bakteriecellelignende celler, eller menneskelige PGCLCer, forberede ekstracellulære matriseproteinbelagte plater og celleuspensjonering av menneskelige iPSCer, som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en encellede suspensjon av primet pluripotency menneskelig iPSCs i mTeSR1-mediet som inneholder Y-27632 Rho kinasehemmer. Juster celletettheten forsiktig til 100 000 celler per milliliter.Inokuler to milliliter cellesuspensjon av primede menneskelige iPSCer i hver brønn av det ekstracellulære matriseproteinet belagt seksbrønnsplater, og sørg for at cellene fordeles jevnt ved å riste platene vertikalt og horisontalt. Inkuber platene i en co2-inkubator med tre gasser ved 37 grader Celsius. Det er svært viktig å inokulere nøyaktig 200 000 celler i hver brønn av en seksbrønns plate.Nøyaktig telling av celler er kritisk. Etter ferdigstillelse av den forbigående konverteringen til naiv pluripotens, bør cellene se over-samtidig, noe som er normalt. Nøyaktig tidspunkt for middels endring er viktig for å oppnå høye menneskelige PGCLCer og eksperimentell reproduserbarhet.Tettheten av 4i hiPSC-kulturen er høy under disse forholdene, og det forventes at cellen blir samløpet i 48 til 72 timer etter inokulasjon. 24 timer etter inokulasjon, endre mediet med to milliliter per brønn av mTeSR1 medium uten Y27632. Start konvertering av primet pluripotency tilstand menneskelige iPSCs til 4i naive pluripotente stamceller, ved å varme 50 milliliter 4i komplett medium i en 37 grader Celsius vannbad i 15 minutter.Ved 48 og 72 timer etter inokulasjon, fjern platene fra inkubatoren, og endre mediet med 2 milliliter per brønn på 4i komplett medium. Sentrifuger vaskemiddelbelagt mikrobrønnplate ved 1000 g i fem minutter ved romtemperatur. Inspiser brønnene med invertert mikroskop for å sikre fravær av luftbobler.Skyll brønnene som beskrevet i tekstprotokollen, og gjenta sentrifugeringen. Tilsett 4i komplett medium til de skyllede brønnene. Sentrifuger platen ved 1000 g i fem minutter ved romtemperatur, og inspiser brønnene igjen.For å inokulere 4i menneskelige iPSCer inn i mikrobrønnplaten, klargjør menneskelig iPSC-cellesuspensjon som beskrevet i protokollen. Filtrer denne cellesuspensjonen gjennom en cellesil i porstørrelse på 40 mikrometer for å fjerne celleaggregater. Vask silen med en milliliter forhåndsoppvarmet 4i komplett medium tre ganger for å samle alle cellene fra silen, og telle cellene med en kulturteller.Deretter fortynner denne enkeltcellesuspensjonen av 4i naive menneskelige iPSCer til 27 til 32,4 millioner celler i 9 milliliter forhåndsoppvarmet 4i komplett medium som inneholder Y27632. Fjern tidligere forberedt mikrobrønnplate som inneholder 1 milliliter 4i komplett medium per brønn fra en tri-gass inkubator. Inokuler 1 milliliter 4i naiv human iPSC-suspensjon i hver brønn, for å oppnå en konsentrasjon på 3,0 til 3,6 millioner celler per brønn.Pipette forsiktig for å fordele cellene jevnt. Sentrifuger platen ved 100 g i 3 minutter ved romtemperatur. Plasser platen i en co2-inkubator med tre gass, sørg for ikke å forstyrre celler som er pelleted i mikrobrønner, og inkuber i 24 til 30 timer, fordi en inkubasjon over natten ikke er tilstrekkelig for dannelse av trange embryonale legemer eller EBer.Prewarm 5 milliliter av humant PGCLC basal medium og 20 milliliter av menneskelig PGCLC komplett medium i minst fem minutter i en 37 grader Celsius vannbad Legg forsiktig en 40 mikrometer pore størrelse celle sil opp ned over en 50 milliliter polypropylen konisk rør. For å løsne EBer fra mikrobrønner, pipett forsiktig hver brønn av platen. For å fjerne celler som ikke er innlemmet i EB, filtrer innholdet i alle brønner gjennom cellesilen.Vask EB-ene forsiktig på membranen i cellesilen med 1 milliliter forhåndsoppvarmet humant PGCLC basalmedium, og gjenta vasken fem ganger. Plasser et friskt konisk rør på 50 milliliter på cellesilen, slik at cellesilen nå er plassert på høyre side opp i det nye røret. Raskt invertere cellesilen med det nye røret, som vil plassere EBs under membranen av cellesilen.Tilsett 18 milliliter forhåndsoppvarmet humant PGCLC komplett medium til membranen av cellesilen for å samle EBer i det koniske røret. Deretter, plate 3 milliliter per brønn av suspensjon av EBs i brønner av en lav vedlegg seks-brønns plate. Plasser platen på en seesaw-move rocker i en tri-gass inkubator, og sett forsiktig gyngehastigheten på ca. 20 omsvinger per minutt.På dag syv til 13 av eksperimentet, nybered 20 milliliter av menneskelig PGCLC komplett medium hver dag. Fjern platen fra rockeren, noe som vil få EBene til å synke til bunnen av brønnene. Fjern det gamle mediet uten å tørke EBer slik at ca 0,2 milliliter gammelt medium forblir i hver brønn.Tilsett 3 milliliter per brønn med friskt humant PGCLC komplett medium, etter å ha fjernet det gamle mediet hver dag. For å identifisere menneskelige PGCLCer som OCT4-positive celler, høste EB til en 1,5 milliliter lav-bind mikrocentrifuge tube. La EBs synke til bunnen ved romtemperatur, og kast mediet.Skyll EBs med iskald 1X PBS. Etter å ha fjernet PBS, inkubere EBs i 1 milliliter iskald 1% vekt ved volum natriumazid i PBS på is i fem minutter. La EBene synke til bunnen ved romtemperatur.Etter å ha kastet overnatanten, skyll EBs med iskald PBS. Tin 200 mikroliter ekstracellulært matriseprotein på is. Tilsett proteinet til røret som inneholder EBer.La røret stå ved romtemperatur i ca. 10 minutter, til gelen er størknet, og EB-ene er innebygd. For å fikse EBs, tilsett 1 milliliter 4% formaldehyd i PBS til røret, og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter med mild gynge. Deretter kast formaldehyd og skyll EBs en gang med iskald PBS.Tilsett 1 milliliter 70% etanol. Oppbevares i 70 % etanol ved 4 grader Celsius i opptil en uke, eller fortsett å behandle dem med en standard FFPE-protokoll. Celletetthet og til og med fordeling av celler på hver brønn er kritiske.Menneskelige IPSCer i 2 milliliter Y27632 supplert medium per brønn av en seks-brønns plate, nå 20 til 30% samløpet etter 24 timer. Etter en ekstra 24 timers kultur i mTeSR1-mediet, i fravær av Y27632, samlet og dannet celler, som opptar ca 30% av vekstområdet. Etter 24 timers kultur i 4i omprogrammeringsmediet nådde cellene samløpet.Etter ytterligere 24 timer med kultur i 4i-mediet ble cellene mer tettpakket. Etter en 24 timers inkubasjon i mikrobrønner i 4i omprogrammeringsmediet dannet celler EBer med deres sirkulære kontur synlig ved 24 til 30 timer etter inokulasjon. EBs holdt i det menneskelige PGCLC medium, under gynge nonadherent forhold, opprettholdt sin sfæriske form uten aggregering etter 24 timer.Etter 192 timer var EB større, og opprettholdt samme morfologi. Etter 5 dager dukket cellene opp som OCT4 som uttrykte celler på overflaten av EBer, og økte antallet etter 8 dager. Celler fra encelledeuspensjon av humane PGCLCer ble beriket som CD38-positive celler av FACS.Celler som ikke uttrykker CD38 var negativ kontroll. For å unngå kontaminering ble FACS-portene CD38-positive og CD38-negative celler separert med en bred margin. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å følge nøyaktig celletelling og tidspunkter for middels endring.Utelate middels endring selv en enkelt dag, eller redusere volumet av det mediet på ethvert trinn, kan føre til massiv celledød. Hastigheten på gyngekulturen til embryoide kropper må optimaliseres nøye.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Stammer Netthinne Pigment Epitel (RPE) fra Induced pluripotent Stem (IPS) Cells av forskjellige størrelser av embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generasjon Integrerings- fritt menneskeskapte Pluripotent stamceller Bruke Hair-avledet Keratinocytter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra menneske perifere T-celler Bruke Sendai Virus i Feeder-free betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induced pluripotent stamcelle Generation fra Blood Cells hjelp Sendai Virus og sentrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generasjon Integrerings--frie Utførte Pluripotent stamceller fra menneskelige perifere mononukleære blodceller Bruke episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generasjon første hjertet felt-lignende Cardiac Progenitors og ventrikkel som Cardiomyocytes fra menneskelige Pluripotent stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...