Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Reconhecemos o Shiomi Yawata e Chie Owa para assistência técnica, durante os estudos iniciais. Este estudo foi suportado por subvenções NIEHS/NIH R01 ES023316 e R21ES024861 de TS e por JHH grant aeromoça Medical Research Institute (FAMRI).

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	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Produção de robusta de hPGCLCs usando o protocolo descrito aqui foi confirmada com três clones independentes de iPSCs humana com o cariótipo diploide normal10. Estes clones de iPSC foram derivadas do fibroblasto humano neonatal dérmica pele mesma célula cultura10. Serão fornecidos pelos autores deste artigo para os investigadores a pedido e sob o acordo de transferência de materiais adequados e arranjo das células humanas ao vivo congelados do transporte. É atualmente desconhecido se o cariótipo normal é necessário para a produção de robusta hPGCLC usando nosso protocolo ou aqueles relatados por outros laboratórios.
Estudos recentes demonstraram que a produção de hPGCLCs de hiPSCs11 ou CES14 usando um protocolo descrito pelo grupo do Saitou da Universidade de Kyoto8 é dependente da expressão do EOMES, um factor de transcrição do T-caixa necessário para indução de SOX17. SOX17 parece funcionar como a linhagem mestre determinar o factor de transcrição em germline diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas6. EOMES é codificada pelo gene EOMESODERMIN , CRISPR/Cas9 nocaute da EOMESODERMIN causada quase completa ausência de indução de SOX17 na hPGCLC produzindo condição11e expressão de outros genes seguia o mesmo padrão das Células SOX17-nulo nocaute. Superexpressão de EOMES de um vetor inducible no EOMESODERMIN-células de nocaute nulo durante a cultura de indução de hPGCLC resgataram eficientemente a produção de robusta hPGCLC, bem como indução de genes da linha germinal, incluindo SOX17. Em contraste, superexpressão induzida SOX17 também resgatou a produção PGCLC robusta mas sem induzir EOMESODERMIN. Assim, EOMES é um indutor de montante crítico de SOX17, e isto parece o único papel mais importante de EOMES na hPGCLC indução de células-tronco pluripotentes humanas. Nosso protocolo induz SOX17 em hiPSCs10, mas sua dependência na indução EOMESODERMINE aguarda para ser determinado.
Este protocolo converte aprontado-pluripotência iPSCs humano mantido a médio mTeSR1 ERK independente ingênuo pluripotência para 96 horas no 4i reprogramação médio6, que é um ingênuo modificado células-tronco humano médio (NHSM)5. Nossas tentativas de gerar hPGCLCs, começando com os clones humanos iPSC mesmo mas mantido em outros meios de crescimento de iPSC humano disponível comercialmente antes de cultura no 4i reprogramação médio resultou em vários graus de mais baixos rendimentos de hPGCLC. Embora se adaptação de longo prazo em outros meios de comunicação melhora a produção de hPGCLC ou não permanece ser determinado em estudos futuros, esta observação sugere que o estado exato da pluripotência purgado de iPSCs humana antes do 4i reprogramação significativamente formação de EB de impactos no meio 4i e diferenciação de EB hPGCLC médio.
Produção de hPGCLCs de hiPSCs a seguir o nosso protocolo é robusto e altamente reprodutível, em parte devido a utilização das placas de microplacas que permitem a produção eficiente de um grande número de EBs (~ 8.000 EBs por lote) com um tamanho uniforme (3.000 hiPSCs por EB). O número de EBs prontamente produzido em um único lote de experimento usando nosso protocolo pode ser muito maior do que os métodos usando os poços de cultura celular U-fundo regulares. Produção de um grande número de igual tamanho EBs uniformemente cravejado com hPGCLCs pode fornecer oportunidades únicas de alto rendimento químicas projecções para identificar ativadores de pequeno peso molecular ou inibidores que afectam a especificação PGC ou seus características biológicas como reprogramação epigenética. Tais EBs pode também ser útil para avaliações toxicológicas de grande número de tóxicas para a célula da linha germinal, incluindo não só poluentes ambientais, mas também clinicamente prescritos medicamentos como agentes quimioterápicos.
Os fatores críticos da produção robusto e reprodutível de hPGCLCs usando o protocolo apresentado incluem (i) o uso de hiPSCs saudável mantida em mTeSR1 em proteínas de matriz extracelular, (ii) para inocular o número exato de células conforme especificado e estritamente Siga os timings da mudança média e subcultura, (iii) para selecionar muita BMP4 recombinante humano e (iv) para minimizar danos físicos da EBs durante a cultura Rock. É nossa experiência que o melhor lote de reagente BMP4 trabalhou na concentração de 100 ng/mL, Considerando que outros muitos BMP4 reagentes necessários 2 X ou mais doses. Por outro lado, o rendimento de hPGCLCs produção usando o melhor lote de BMP4 diminuiu bastante em doses mais elevadas de BMP4 (por exemplo, 200 ng/mL). Recomendamos para testar vários diferentes lotes de reagentes de BMP4 humanos recombinantes obtidos de vários fornecedores para o seu desempenho no apoio hPGCLC geração e para garantir uma grande quantidade do lote melhor.
Uma característica única do nosso protocolo de hPGCLC é que hPGCLCs estão localizadas sobre a camada de superfície exterior da EBs10 (Figura 8), enquanto outros protocolos podem gerar hPGCLCs no meio da célula agregados6,8. Corpos do embryoid tendem a formar várias camadas distintas como núcleo, escudo exterior, escudo interno e superfície, e as regiões de núcleo central são muitas vezes necróticas devido a oferta limitada de nutrientes, oxigênio, bem como a forma de fatores de crescimento desde que pro-sobrevivendo a cultura médio por difusão20. Localização de hPGCLCs na superfície da EBs sem restrições possíveis devido à limitada difusão em direção ao centro da EBs pode ser benéfica para a direta, exposição e dose-controlada por tempo de hPGCLCs a drogas ou substâncias tóxicas para farmacológica ou estudos toxicológicos.
Considerando que o rato PGCLCs mostrar robusto todo o genoma ADN desmetilação envolvendo a impressão controlar regiões pelo menos em parte7,19,20, o grau de desmetilação gDNA global em hPGCLCs parece mais fraco do que o rato PGCLCS ou PGCs6,7. Transcriptomal perfis sugerem que hPGCLCs pode assemelhar-se numa fase anterior do PGCs embrionárias de rato PGCLCs10. Tem sido relatado que cultura prolongada do EBs sob a condição de hPGCLC produção causou um maior grau de gDNA desmetilação7; no entanto, se um longo período da cultura de hPGCLCs em EBs ou como células isoladas pode atingir estágios mais avançados da diferenciação do germline precisa ser determinada por estudos futuros.

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de todas as células da linha germinal em ambos os sexos. A maioria de nosso conhecimento sobre o desenvolvimento do PGCs em embriões de mamíferos foi obtido através do estudo de1,de ratos de laboratório2. No dia embrionário 6.0-6.5 de embriões de rato, 6 ou similar um número pequeno de precursores PGC está localizado no epiblasto e uma população de fundador de ~ 40 que PGCs são induzidas a partir deles de forma dependente de proteínas morfogenéticas ósseas Bmp2 e Bmp4 secretada de adjacentes células. Os primeiros PGCs humanas até agora identificados em embriões foram na parede do saco vitelino por volta do final da terceira semana de gestação3endodermal. Porque esse é o mesmo lugar como migrar PGCs são observadas em embriões do rato, é provável que o PGCs humanas observados foram o caminho de migração, mas não a população fundadora. No entanto, estudos de rastreamento volta a estágios anteriores do PGCs ou PGC precursores em embriões humanos desapareceram.
Acesso ao PGCs embrionárias humanas é um desafio devido a obstáculos técnicos e éticos. Para superar estes obstáculos, modelos de cultura celular de PGC-como foram recentemente gerados a partir de células-tronco pluripotentes humanas (EPS). Pluripotência é a capacidade celular de se diferenciarem no germline e três camadas germinativas embrionárias4. Considerando que PSCs humanos mantiveram-se no meio de mTeSR1 (ready-to-use, comercialmente disponível meio formulado para manutenção das EPS humanas no estado de pluripotência aprontada) em pratos revestidos com as proteínas da matriz extracelular tem aprontado-estado pluripotência 4, em 2013, laboratório de Jacob Hanna mostrou que as células de pluripotência aprontada podem ser convertidas em um estado de pluripotência ingênuo, expondo o meio de célula-tronco humana ingênua (NHSM) contendo químicos inibidores de quinases de proteínas ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, e p38 MAPK, bem como fatores de crescimento LIF, TGF, bFGF5. Partir os PSCs humana ingênua-pluripotência, em 2015, um grupo de investigação conduzido por Hanna e Azim Surani realizado a primeira produção de robusta de células humanas de PGC-Like (hPGCLCs) de EPS6. Vários outros laboratórios, incluindo a nossa, relataram mais tarde, geração de hPGCLCs de EPS usando protocolos ligeiramente diferentes7,8,9,10. Nosso estudo apresentou provas que hPGCLCs gerados usando protocolos diferentes (que são resumidos na tabela S1 de nosso estudo anteriormente publicado10) são transcriptomally semelhante ao outro10. Evidência disponível suporta a semelhança de PGCLCs humanos para fase inicial humanas PGCs embrionárias antes do apagamento epigenéticas global7 e/ou migração quimiotáctica10.
Estudos de mouse PGCs embrionárias, rato PGCLCs e PGCLCs humanos (mas apenas com acesso muito limitado aos humanos PGCs) revelaram que os mecanismos moleculares da especificação PGC diferem significativamente entre mouse e humano1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Por exemplo, Prdm14 tem um papel crítico na especificação de PGC em embriões de rato, mas seu papel na especificação de PGC humana parece limitada1,15. Em contraste, a indução de SOX17 por EOMES é essencial para PGC especificação6,11,14, Considerando que esses fatores de transcrição parecem dispensáveis para rato PGC especificação15. Estes primeiros resultados de estudos usando hPGCLCs fortemente apoiar a importância desse modelo de cultura celular como um substituto do PGCs embrionárias humanas.
Estudos publicados recentemente, envolvendo avaliação de sequenciamento profunda do nosso laboratório de DNA cópia número análise genômica, têm mostrado que a manutenção prolongada das EPS no estado de pluripotência ingênuo aumenta significativamente o risco de instabilidade cromossômica e anomalias estruturais. Este fenômeno foi observado com rato18 e humano19 EPS. O protocolo de produção original hPGCLC relatado por Hanna/Surani foi desenvolvido para PSCs humanos mantidos na meio de pluripotência 4i ingênuo pelo menos 2 semanas6. Para preservar o cariótipo diploide normal de humanos PSCs e PGCLCs, desenvolvemos um protocolo modificado no qual PSCs humanas são expostos para o meio 4i para apenas 72 horas10, que é apresentada neste artigo. IPSCs humanas (hiPSCs) são mantidas sob o estado de pluripotência condicionadas. Imediatamente antes da formação do EB, as células são incubadas a ingênua 4i médio de reprogramação (um meio NHSM modificado) por 48 horas. Células são então dissociadas e embaladas em poços da microplaca para formar EBs para um adicional de 24 horas no meio 4i. EBs são mantidas em meio de indução de hPGCLC que contém uma alta concentração de BMP4 humana recombinante sob uma condição de balanço para a cultura do não-apego por até 8 dias para obter o máximo rendimento de hPGCLCs. Após 8-cultura EB, hPGCLCs pode ser isolado de células dissociadas do EB por FACS como CD38 + células com até ~ 40% de rendimento em suspensão de célula única FACS-classificáveis. Considerando que outros publicados métodos7,8,9, incluindo o protocolo original antes de nossas modificações6, tipicamente gerar hPGCLCs em agregados de células formado espontaneamente sem específicos localização, hPGCLC produzido por nosso protocolo são observados na superfície dos órgãos do embryoid (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de todas as células da linha germinal. Em embriões de rato, uma população fundadora de ~ 40 PGCs são induzidas de células do epiblasto pluripotentes por exposições orquestradas de citocinas, incluindo a Proteína morfogenética óssea 4 (Bmp4). Em embriões humanos, os primeiros PGCs foram identificados na parede do saco vitelino por volta do final da semana de gestação 3rd endodermal, mas pouco se sabe sobre o processo de especificação de PGC humana e seu desenvolvimento precoce. Para contornar as barreiras técnicas e éticas de estudar PGCs embrionárias humanas, modelos de cultura celular substituto foi recentemente gerados de células-tronco pluripotentes. Aqui, descrevemos um protocolo de 13 dias para a produção de robusta de células PGC-Like humanas (hPGCLCs). Células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) mantidas no estado de pluripotência aprontada são incubadas no ingênuo 4i reprogramação médio por 48 horas, dissociadas de células únicas e embaladas em poços da microplaca. Manutenção prolongada de hiPSCs no estado de pluripotência ingênuo provoca aberrações cromossômicas significativas e deve ser evitada. hiPSCs aos micropoços são mantidas por um adicional 24 horas a médio 4i corpos de forma do embryoid (EBs), que são então cultivadas em baixa aderência plasticware sob uma condição de balanço no meio de indução de hPGCLC, que contém uma alta concentração de BMP4 humana recombinante. EBs são mais cultivadas por até 8 dias na condição de balanço, não aderente, para obter o máximo rendimento de hPGCLCs. Por imuno-histoquímica, hPGCLCs são facilmente detectados como células expressando fortemente OCT4 em quase todos os EBs exclusivamente em sua superfície. Quando EBs são enzimaticamente dissociada e submetido ao enriquecimento de FACS, hPGCLCs podem ser coletados como CD38 + células com até 40-45% de rendimento.

A placa de micropoços usada aqui é no formato 24-bem e tem 8 poços segurando os lençóis de microplacas, cada um deles suporta a formação de até 1.200 EBs. De aproximadamente 24 milhões de células de pluripotência 4i ingênuo, esta placa de micropoços normalmente gera ~ 8.000 EBs consistindo de ~ 3.000 células por EB. Durante a cultura de não-aderente da EBs com balanço constante, diminui gradualmente o número de EBs intacto devido ao desmantelamento Self espontâneo e ~ 3.000 EBs sobreviver até o dia 13 do protocolo. A maioria destes sobreviventes EBs tem 50-200 hPGCLCs em sua superfície (estimada pela detecção de imuno-histoquímica de células OCT4 + serial seções de EBs; consulte a Figura 8), rendendo ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs no total. Digestão enzimática da EBs em células individuais é um processo relativamente ineficiente, reduzindo o rendimento do FACS-enriquecido CD38 + hPGCLCs para células de 9.000-47.000. Em nossas mãos, uma média de seis lotes consecutivos mas independentes de experimentos foi 14.038 ± 5.731 (média ± SEM). Porque células de células CD38-negativo EB expressam OCT4 mRNA (qPCR) ou proteína (imuno-histoquímica) só muito fraca, se não completamente ausente, todas as células do EB fortemente expressando proteínas OCT4 são praticamente equivalente a toda a população do CD38 + hPGCLCs.
O parâmetro crítico do presente protocolo inclui a densidade celular. Quando 2,0 x 105 humano iPSCs são inoculadas em uma proteína-revestido bem da placa de cultura de células de 6-bem (área de crescimento de2 cm 9,60 por alvéolo) com 2 mL de Y27632-completado meio (2.2.9) da matriz extracelular, células chegará a cerca de 20-30% confluencia em 24 horas após a inoculação (Figura 1). Depois de um adicional de 24 horas cultura no meio de mTeSR1, na ausência de Y7632, células agregadas e formam colônias, ocupando ~ 30% da área de crescimento (Figura 2). As células são então cultivadas no meio de reprogramação de 4i (2.3.2). Após 24 horas de cultura em confluente de células tornam-se médias, o 4i (Figura 3). Uma cultura de 24 horas adicional no meio 4i faz células densamente (Figura 4). O momento exato da mudança média (cada 24 horas + /-4 horas) e densidades de célula são críticos para o sucesso formação de EBs e hPGCLCs.
Após 48 horas cultura em meio de 4i, as células são dissociadas e inoculadas para a placa de micropoços, que tem 400 µm poços em tamanho (2.4). Embora esta placa de micropoços comercialmente disponível é revestida para baixa aderência pelo fabricante, fresco de revestir novamente com detergente (2.4.3) é recomendada para reduzir o risco de aderência de célula indesejados. os poços da 800 microplaca µm resultaram em rendimento reduzido do hPGCLCs, sugerindo a importância do tamanho do EB para diferenciação corretamente direcionado. Células inoculadas em meio de 4i formarão EBs em poços da microplaca de 24 a 30 horas, que pode ser observadas usando um padrão, invertido fase microscópio de contraste (Figura 5). O contorno circular da EBs tornam-se claramente visível no e após 24 horas de incubação. Colheita de EBs em um momento anterior (por exemplo, 16 horas após a inoculação) antes que seu contorno circular é claramente visível não é recomendado porque tais EBs são muito vulneráveis a danos mecânicos e desmontar facilmente. Note-se que uma quantidade significativa de ingênuo hiPSCs não é incorporados na EBs, que é normal. Estas células não-incorporadas vão ser lavadas afastado antes do início da cultura do EBs na superfície de baixo-aderente (2.5.2) de balanço. Observe também que, no nosso protocolo, EBs são formadas no meio de pluripotência 4i ingênua - não no meio de hPGCLC. Pré-formação do sólido EBs no meio 4i antes da exposição ao meio de hPGCLC é importante para a distribuição de hPGCLCs na superfície da EBs.
EBs mantidas em meio de hPGCLC sob um balanço, condição de cultura não-aderente manterão sua forma esférica sem agregação ou fusão (Figura 6 e Figura 7). Muito fraca condição de balanço fará com agregação de EB e fusão, mas muito dura condição irá desmontar EBs. PGCLCs humanas emergem como OCT4-expressando células na superfície da EBs após tão cedo quanto a cultura de 5 dias no meio de hPGCLC e seu número aumenta até a cultura de 8 dias (Figura 8). Incubação adicional de EBs pode causar a desmontagem de EBs e perda de hPGCLCs. PGCLCs humanas podem ser enriquecidos de células EB enzimaticamente dissociadas após 5-8 dias de cultura em meio de hPGCLC pela FACS como células CD38 + (Figura 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figura 1: cultura de células humanas iPSC em meio Y27632-completadas 24 horas após a inoculação. A densidade celular é de cerca de 20-30% confluentes. Na presença de inibidor ROCK Y27632, células tendem a se espalhar bem com o tempo, spike, como alongamento. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figura 2: cultura de células humanas de iPSC 48 horas após a inoculação. Agregado que formam colônias, ocupando ~ 30% da área de crescimento de células. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figura 3: cultura de células humanas de iPSC incubadas na meio de reprogramação 4i durante 24 horas. Células alcangam a confluência. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figura 4: cultura de células humanas de iPSC incubadas na meio de reprogramação 4i durante 48 horas. São densamente confluentes. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figura 5: iPSC humana EBs formada em poços da microplaca após 24 horas de incubação no 4i reprogramação médio. O contorno circular da EBs tornam-se visíveis em 24-30 horas após a inoculação. Quando o contorno é confirmado sob um microscópio de contraste de fase, EBs estão prontos para transferência para uma condição de cultura Rock. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figura 6: humano iPSC EBs incubadas durante 24 horas em meio de hPGCLC. EBs em grande parte manter sua forma esférica. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figura 7: iPSC humana EBs incubadas durante 192 horas em meio de hPGCLC. EBs são ampliados em relação à sua aparência no 24 horas de cultura, mas eles ainda em grande parte mantenham formas esféricas com nenhuma agregação ou fusão. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figura 8: humanos PGCLCs expressando OCT4 são localizadas na superfície da EBs incubadas durante 192 horas em meio de hPGCLC de hiPSC. EBs foram incorporados em proteínas de matriz extracelular e processadas para FFPE slide coloração imuno-histoquímica de OCT4 (substrato DAB). Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figura 9: PGCLCs humanas são enriquecidos de células enzimaticamente dissociadas do EB por FACS como CD38+ células. Após incubação em meio de hPGCLC de 5-8 dias, EBs pode ser dissociado por digestão enzimática para preparar a suspensão de célula única. hPGCLCs pode ser enriquecido como CD38+ células por FACS (pontos vermelhos). Células EB que não expressam CD38 (pontos azuis) também devem ser coletados como controlo negativo. Portões de FACS do CD38-positivo e negativo-CD38 células devem ser separadas com uma larga margem (pontos verdes) para evitar a contaminação de cada tipo de células. Os painéis superiores e inferiores mostram perfis FACS sem ou com anticorpo anti-CD38, coloração, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de esperma e de ovos. PGCs embrionárias humanas são especificados de células do epiblasto pluripotentes através de interações de citocinas. Aqui, descrevemos um protocolo de 13 dias de induzir células humanas transcriptomally PGCs assemelhando-se à superfície dos órgãos do embryoid de células-tronco pluripotentes aprontado-pluripotência induzida.

Geração de células humanas de células germinativas, como Primordial na superfície dos órgãos do Embryoid de aprontado-pluripotência induzida por células estaminais pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo toxicológico da germinação humana, como como os danos no genoma das células germinativas primordiais humanas são criados ou reparados. A principal vantagem dessa técnica é que as células germinativas primordiais humanas podem ser geradas em duas semanas a partir das células de pluripotência primitivas que abrigam o fundo genético de predisposição da doença. As implicações dessa técnica se estendem para a prevenção do comprometimento genômico em células germinais humanas, porque nosso modelo de cultura celular pode nos ajudar a reduzir a toxicidade germinal de uma droga terapêutica.Para começar com a geração de células germinativas primordiais humanas, ou PGCLCs humanos, preparem placas extracelulares revestidas de proteínas e suspensão celular de iPSCs humanos, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma suspensão unicelular de iPSCs humanos de pluripotência primed no meio mTeSR1 contendo o inibidor de quinase Rho Y-27632. Ajuste cuidadosamente a densidade celular para 100.000 células por mililitro.Inocular dois mililitros de suspensão celular de iPSCs humanos preparados em cada poço da proteína de matriz extracelular revestida de seis poços, certificando-se de que as células são distribuídas uniformemente sacudindo as placas vertical e horizontalmente. Incubar as placas em uma incubadora de CO2 tri-gás a 37 graus Celsius. É muito importante inocular exatamente 200.000 células em cada poço de uma placa de seis poços.A contagem precisa das células é crítica. Após a conclusão da conversão transitória para pluripotência ingênua, as células devem parecer super-confluentes, o que é normal. O tempo exato de mudança média é importante para alcançar pgclcs humanos elevados e reprodutibilidade experimental.A densidade da cultura 4i hiPSC é alta nessas condições, e espera-se que as células se tornem confluentes nas 48 a 72 horas após a inoculação. 24 horas após a inoculação, troque o meio com dois mililitros por poço de mTeSR1 médio sem Y27632. Inicie a conversão de iPSCs humanos de estado pluripotency primed para 4i células-tronco pluripotentes ingênuos, aquecendo 50 mililitros de 4i meio completo em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos.Às 48 e 72 horas após a inoculação, retire as placas da incubadora e troque o meio com 2 mililitros por poço de 4i meio completo. Centrifugar a placa de microwell revestida de detergente a 1.000 g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Inspecione os poços com microscópio invertido para garantir a ausência de bolhas de ar.Enxágüe os poços conforme descrito no protocolo de texto e repita a centrifugação. Adicione 4i meio completo aos poços enxaguados. Centrifugar a placa a 1.000 g durante cinco minutos em temperatura ambiente, e inspecione os poços novamente.Para inocular 4i iPSCs humanos na placa de microwell, prepare a suspensão celular iPSC humana, conforme descrito no protocolo. Filtre esta suspensão celular através de um coador de células de tamanho de poros de 40 micrômetros para remover agregados celulares. Lave o coador com um mililitro de 4i pré-aquecido meio completo três vezes para coletar todas as células do coador, e conte as células com um contador de cultura.Em seguida, diluir esta suspensão celular única de 4i iPSCs humanos ingênuos para 27 a 32,4 milhões de células em 9 mililitros pré-aquecidos 4i meio completo contendo Y27632. Remova a placa de microwell previamente preparada contendo 1 mililitro de 4i meio completo por poço de uma incubadora de três gáss. Inocular 1 mililitro de 4i ingenuidade humana suspensão iPSC em cada poço, para alcançar uma concentração de 3,0 a 3,6 milhões de células por poço.Pipeta suavemente para distribuir uniformemente as células. Centrifugar a placa a 100 g por 3 minutos em temperatura ambiente. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 tri-gás, certificando-se de não perturbar as células pelleted em microwells, e incubar por 24 a 30 horas, pois uma incubação noturna é insuficiente para a formação de corpos embrionários apertados ou EBs.Pré-aquecimento 5 mililitros de meio basal pgclc humano e 20 mililitros de pgclc humano meio completo por pelo menos cinco minutos em um banho de água 37 graus Celsius Coloque cuidadosamente um coador de células do tamanho de um poro de 40 micrômetros de cabeça para baixo sobre um tubo de polipropileno de 50 milímetros. Para separar os EBs de microwells, bato suavemente cada poço da placa. Para remover células não incorporadas em EBs, filtrar o conteúdo de todos os poços através do coador celular.Lave suavemente os EBs retidos na membrana do coador celular com 1 mililitro de meio basal PGCLC humano pré-aquecido e repita a lavagem cinco vezes. Coloque um tubo cônico fresco de 50 mililitros no coador celular, de modo que o coador de células esteja agora posicionado do lado direito para cima no novo tubo. Inverta rapidamente o coador celular com o novo tubo, que posicionará os EBs abaixo da membrana do coador celular.Adicione 18 mililitros de PGCLC humano pré-aquecido meio completo à membrana do coador celular para coletar EBs no tubo cônico. Em seguida, a placa 3 mililitros por poço da suspensão de EBs em poços de uma placa de seis poços de baixa fixação. Coloque a placa em um roqueiro de movimento de gangorra em uma incubadora de três gáss, e coloque cuidadosamente a velocidade de balanço em aproximadamente 20 voltas por minuto.No sétimo dia a 13 do experimento, preparem recentemente 20 mililitros de pgclc humano completos por dia. Retire a placa do roqueiro, o que fará com que os EBs afundem até o fundo dos poços. Remova o meio antigo sem secar EBs de modo que cerca de 0,2 mililitros de médio antigo permaneça em cada poço.Adicione 3 mililitros por poço de meio completo pgclc humano fresco, depois de remover o antigo meio todos os dias. Para identificar pgclcs humanos como células OCT4 positivos, colher os EBs para um tubo de microcentrifuge de baixa ligação de 1,5 mililitro. Deixe os EBs afundarem até o fundo à temperatura ambiente e descarte o meio.Enxágüe os EBs com PBS 1X frio. Depois de remover o PBS, incubar os EBs em 1 mililitro de gelo frio 1% de peso em volume de azida de sódio em PBS no gelo por cinco minutos. Deixe os EBs afundarem até o fundo à temperatura ambiente.Depois de descartar o supernasce, enxágue os EBs com PBS gelado. Descongele 200 microliters de proteína de matriz extracelular no gelo. Adicione a proteína ao tubo que contém EBs.Deixe o tubo em temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos, até que o gel esteja solidificado, e os EBs estejam embutidos. Para fixar os EBs, adicione 1 mililitro de 4% de formaldeído no PBS ao tubo e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos com balanço suave. Depois disso, descarte o formaldeído e enxágue os EBs uma vez com PBS gelado.Adicione 1 mililitro de 70% de etanol. Armazene 70% de etanol a 4 graus Celsius por até uma semana, ou prossiga para processá-los com um protocolo padrão FFPE. A densidade celular e até mesmo a distribuição de células em cada poço são críticas.IpSCs humanos em 2 mililitros de Y27632 complementados médios por poço de uma placa de seis poços, atingem 20 a 30% de confluência após 24 horas. Após mais 24 horas de cultura no meio mTeSR1, na ausência de Y27632, as células agregaram e formaram colônias, ocupando aproximadamente 30% da área de crescimento. Após 24 horas de cultura no meio de reprogramação 4i, as células atingiram a confluência.Depois de mais 24 horas de cultura no meio 4i, as células ficaram mais densamente embaladas. Após uma incubação de 24 horas em microwells no meio de reprogramação 4i, as células formaram EBs com seu contorno circular visível entre 24 e 30 horas após a inoculação. Os EBs mantidos no meio pgclc humano, sob condições nãoadherent, mantiveram sua forma esférica sem agregação após 24 horas.Após 192 horas, os EBs foram maiores, mantendo a mesma morfologia. Após 5 dias, as células emergiram como CÉLULAS DE EXPRESSÃO OCT4 na superfície dos EBs, aumentando seu número após 8 dias. As células de suspensão de células únicas de PGCLCs humanos foram enriquecidas como células CD38 positivas pelo FACS.As células que não expressam CD38 foram de controle negativo. Para evitar contaminação, as células CD38-positive e CD38 negativos foram separadas por uma ampla margem. Ao tentar este procedimento, é importante seguir a contagem exata de células e os tempos de mudança média.Omitir a mudança média mesmo um dia, ou reduzir o volume desse meio em qualquer etapa, pode causar morte celular maciça. A velocidade da cultura de balanço de corpos embrionários tem que ser cuidadosamente otimizada.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

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Biologia do Desenvolvimento

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...