Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Reconocemos Shiomi Yawata y Chie Owa para asistencia técnica en estudios iniciales. Este estudio fue apoyado por subvenciones NIEHS/NIH R01 ES023316 y R21ES024861 a TS y por concesión del Instituto de investigación médica (FAMRI) de auxiliar de vuelo a JHH.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Producción robusta de hPGCLCs utilizando el protocolo descrito aquí fue confirmada con tres clones independientes de iPSCs humana con el karyotype diploide normal10. Estos clones de iPSC se derivan de la misma piel cutánea neonatal humana fibroblastos célula cultura10. Se proporcionará por los autores de este artículo a los investigadores a petición y bajo acuerdo de transferencia de materiales apropiados y envío a disposición de las células humanas vivas. Es actualmente desconocido si el karyotype normal es necesario para producción de hPGCLC robusto usando nuestro protocolo o los reportados por otros laboratorios.
Estudios recientes han demostrado que la producción de hPGCLCs de hiPSCs11 o CES14 utilizando un protocolo descrito por grupo de Saitou de la Universidad de Kyoto8 es dependiente en la expresión de EOMESODERMIN, un factor de transcripción T-box requeridos para inducción de SOX17. SOX17 parece funcionar como el linaje principal determinar el factor de la transcripción en línea germinal diferenciación de las células de vástago de pluripotent humana6. EOMESODERMIN es codificada por el gen EOMES , CRISPR/Cas9 nocaut de EOMES causado ausencia casi completa de la inducción de SOX17 en la hPGCLC producir condición11y expresión de otros genes siguió el mismo patrón de la Células SOX17-null nocaut. La sobreexpresión de EOMESODERMIN de un vector inducible en EOMES-células null nocaut durante cultura de inducción hPGCLC rescataron eficientemente la hPGCLC robusta producción así como la inducción de genes de línea germinal, incluyendo SOX17. Por el contrario, sobreexpresión inducida SOX17 también rescató la robusta producción PGCLC pero sin inducir EOMES. Así, EOMESODERMIN es un inductor crítico aguas arriba de SOX17, y esto parece el solo papel más importante de EOMESODERMIN en hPGCLC inducción de células madre pluripotentes humanas. Nuestro protocolo induce SOX17 en hiPSCs10, pero su dependencia sobre la inducción de EOMESODERMINE espera para determinarse.
Este protocolo convierte pluripotencia cebada iPSCs humano mantenida en el medio mTeSR1 a ERK-independiente ingenuo pluripotencia durante 96 horas en el 4i reprogramación media6, que es un ingenuo modificado células madre humanas medio (NHSM)5. Nuestros intentos de generar hPGCLCs a partir de los mismos clones de iPSC humanas pero mantenido en otros medios de crecimiento de iPSC humanas disponibles en el mercado antes de la cultura en el 4i reprogramación medio dio lugar a diversos grados de un menor rendimiento de hPGCLC. Aunque si adaptación a largo plazo en otros medios mejora la producción de hPGCLC o no sigue siendo determinar en estudios futuros, esta observación sugiere que el estado exacto de la pluripotencia preparado de iPSCs humana antes de la 4i reprogramación significativamente formación de EB de impactos en el medio de 4i y diferenciación de EB en medio de hPGCLC.
Producción de hPGCLCs de hiPSCs siguiendo nuestro protocolo es robusto y altamente reproducible, en parte debido a la utilización de las placas de pocillos que permiten la producción eficiente de un gran número de EBs (~ 8.000 EBs por lote) con un tamaño uniforme (3.000 hiPSCs por EB). El número de EBs fácilmente producido en un único lote de experimento usando nuestro protocolo puede ser mucho mayor que los métodos usando los pozos de cultura regulares de fondo U celular. Producción de un gran número de igual tamaño EBs uniforme tachonado con hPGCLCs puede proporcionar oportunidades únicas de exámenes químicos de alto rendimiento para identificar pequeñas peso molecular activadores o inhibidores que afectan a la especificación del PGC o sus características biológicas tales como reprogramación epigenética. Tal EBs también puede ser útil para la evaluación toxicológica de un gran número de sustancias tóxicas de células germinales, incluyendo no sólo los contaminantes ambientales sino también clínico prescritos medicamentos como agentes quimioterapéuticos.
Los factores críticos de la producción robusta y reproducible de hPGCLCs usando el protocolo presentado incluyen (i) el uso de hiPSCs saludable mantenidas en mTeSR1 en la proteína de matriz extracelular, (ii) para inocular a un número exacto de células especificadas y estrictamente Siga los tiempos de cambio medio y subcultura, (iii) seleccionar mucho buena BMP4 recombinante humano y (iv) para minimizar los daños físicos de EBs en la cultura rock. Es nuestra experiencia que el mejor lote del reactivo de BMP4 trabajó en concentración de 100 ng/mL mientras que otro lote de reactivos de BMP4 había requerido 2 X o mayor dosis. Por otro lado, producción de hPGCLCs producción usando el mejor lote de BMP4 algo disminuido en dosis más altas de BMP4 (p. ej., 200 ng/mL). Recomendamos probar varios lotes distintos de recombinante humano BMP4 reactivos obtenidos de múltiples proveedores para su desempeño en el apoyo a generación de hPGCLC y para garantizar una gran cantidad del mejor lote.
Una característica única de nuestro protocolo de hPGCLC es que hPGCLCs se localizan en la capa superficial externa de EBs10 (figura 8), mientras que otros protocolos pueden generar hPGCLCs en el medio celular agregados6,8. Embryoid cuerpos tienden a formar múltiples capas distintas tales como superficie, exterior, cáscara interna y base, y las regiones centrales son a menudo necróticas debido al limitado suministro de nutrientes, oxígeno, así como forma de factores de crecimiento previstos pro-sobrevivir la cultura medio de difusión20. Localización de hPGCLCs en la superficie de EBs sin restricciones posible debido a la limitada difusión hacia el centro de EBs puede ser beneficioso para, controlada por la dosis y el tiempo la exposición directa de hPGCLCs a drogas o sustancias tóxicas para el farmacológico o estudios toxicológicos.
Mientras que el ratón PGCLCs Mostrar robusto genoma desmetilación del ADN que implican la impresión controlar regiones al menos en parte7,19,20, el grado de desmetilación global gDNA en hPGCLCs parece más débil que el ratón PGCLCS o PGCs6,7. Perfiles de Transcriptomal sugieren que hPGCLCs puede asemejarse a una etapa anterior de PGCs embrionarias de ratón PGCLCs10. Se ha informado de que cultura prolongada del EBs con la condición de la producción de hPGCLC causó un grado creciente de gDNA desmetilación7; sin embargo, si un largo período de la cultura de hPGCLCs en EBs o como células aisladas puede alcanzar etapas más avanzadas de la diferenciación de la línea germinal debe ser determinada por estudios futuros.

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de todas las células del germline en ambos sexos. La mayoría de nuestro conocimiento sobre el desarrollo de las PGCs en embriones de mamíferos se ha obtenido a través del estudio de1,de ratones de laboratorio2. En el día embrionario 6.0-6.5 de embriones de ratón, 6 o similar una pequeña cantidad de precursores PGC se encuentra en el epiblasto y una población fundadora de ~ 40 que PGCs son inducidos de ellos de una manera dependiente de proteínas morfogenéticas óseas Bmp2 y Bmp4 secretada de adyacentes células. Las PGCs humanas más tempranas hasta ahora identificadas en embriones estaban en la pared endodérmico del saco vitelino en alrededor del final de la tercera semana de gestación3. Porque este es el mismo lugar como PGCs migratorias son observados en embriones de ratón, es probable que las PGCs humanas observadas fueron en el camino de la migración pero no la población fundadora. Sin embargo, los estudios remonta a etapas anteriores de PGCs o PGC precursores en los embriones humanos se ha estado perdiendo.
PGCs embrionarios humanos es desafiante debido a obstáculos técnicos y éticos. Para superar estos obstáculos, los modelos de cultura de célula PGC-como se han generado recientemente de las células de vástago pluripotent humanas (PSCs). Pluripotencia es la capacidad celular para diferenciarse en la línea germinal y tres capas germinales embrionarias4. Mientras que PSC humano mantenido en el medio de mTeSR1 (un medio listo para su uso, disponible en el mercado formulado para el mantenimiento de PSCs humanas en el estado de pluripotencia cebada) en platos recubiertas con la proteína de matriz extracelular tiene preparado estado pluripotencia 4, en el 2013 laboratorio de Jacob Hanna demostró que las células de pluripotencia preparado pueden convertirse en un estado de pluripotencia de ingenuo al exponer al medio de células madre humanas ingenuo (NHSM) que contienen inhibidores químicos para proteínas quinasas ERK1/2, GSK3, JNK, roca, PKC, p38 MAPK como factores de crecimiento LIF, TGF, bFGF5. Desde el PSC humano ingenuo pluripotencia, en 2015 un grupo de investigación dirigido por Hanna y Azim Surani logra la primera producción sólida de las células PGC-Like humanas (hPGCLCs) del PSC6. Varios otros laboratorios, incluyendo el nuestro, informaron más tarde, generación de hPGCLCs de PSCs utilizando protocolos ligeramente diferente7,8,9,10. Nuestro estudio proporciona evidencia de que hPGCLCs mediante diferentes protocolos (que se resumen en la tabla S1 de nuestro estudio previamente publicado10) son transcriptomally similar a10. La evidencia disponible apoya la semejanza del PGCLCs humanos a humanos PGCs embrionarios inicial antes de proceder al borrado epigenética global7 o migración quimiotáctica10.
Estudios del ratón embrionarios PGCs, ratón PGCLCs y PGCLCs humanas (pero con sólo un acceso muy limitado a PGCs humanos) han revelado que los mecanismos moleculares de la especificación de PGC difieren significativamente entre ratón y humano1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Por ejemplo, Prdm14 juega un papel crítico en la especificación de PGC en embriones de ratón, pero su papel en la especificación de PGC humana parece limitada1,15. En contraste, la inducción de SOX17 por EOMESODERMIN es esencial para PGC especificación6,11,14, considerando que estos factores de transcripción parecen prescindibles para ratón PGC especificación15. Estos logros iniciales de los estudios con hPGCLCs fuertemente apoyan la importancia de este modelo de cultivo celular como sustituto de PGCs embrionarios humanos.
Estudios recientemente publicados, que implica evaluación de secuenciación profunda de nuestro laboratorio de análisis genomic DNA copia número, han demostrado que el mantenimiento prolongado del PSC en el estado de pluripotencia ingenuo aumenta significativamente el riesgo de inestabilidad cromosómica y anomalías estructurales. Este fenómeno fue observado con ratón18 y humana19 PSCs. El protocolo original de producción de hPGCLC por Hanna/Surani fue desarrollado para PSC humano mantenida en medio de pluripotencia 4i ingenuo para por lo menos 2 semanas6. Para preservar el normal karyotype diploide de PSC y PGCLCs humanos, hemos desarrollado un protocolo modificado que PSCs humanas están expuestos al medio 4i por solamente 72 horas10, que se presenta en este artículo. Humanos iPSCs (hiPSCs) se mantienen en el estado de pluripotencia preparado. Inmediatamente antes de la formación de EB, las células se incuban en el medio de la reprogramación de la ingenua 4i (un medio modificado de NHSM) durante 48 horas. Las células son entonces disociadas y embaladas en los micropocillos para formar EBs por 24 horas en el medio de 4i. EBs se mantienen en medio de inducción de hPGCLC que contiene una alta concentración de BMP4 humana recombinante bajo una condición oscilante para cultura no-accesorio para hasta 8 días para obtener el máximo rendimiento de hPGCLCs. Después de 8-EB cultura, hPGCLCs puede ser aislada de células disociadas de EB por FACS como células CD38 +, con ~ 40% de rendimiento en FACS-ordenar suspensión unicelular. Mientras que otro publicado métodos7,8,9, incluido el protocolo original antes de la modificaciones6, generar típicamente hPGCLCs en agregados de células formadas espontáneamente sin específico localización, hPGCLC de nuestro protocolo se observan en la superficie de los cuerpos de embryoid (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de todas las células del germline. En embriones de ratón, una población fundadora de ~ 40 PGCs son inducidos de las células del epiblasto pluripotentes por exposición orquestada a citoquinas, incluyendo la proteína morfogenética ósea 4 (Bmp4). En embriones humanos, las PGCs más tempranas se han identificado en la pared endodérmico del saco vitelino alrededor del final de la semana 3rd de la gestación, pero poco se sabe sobre el proceso de especificación de PGC humana y su desarrollo temprano. Para evitar las barreras técnicas y éticas de estudiar PGCs embrionarios humanos, sustituto de la célula cultura modelos se han generado recientemente de células madre pluripotentes. Aquí, describimos un protocolo de 13 días para la producción de robusta de células PGC-Like humanas (hPGCLCs). Células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) mantenidas en el estado de pluripotencia preparado son incubadas en la ingenua 4i reprogramación medio de 48 horas, disociar a las células y embaladas en los micropocillos. Mantenimiento prolongado de hiPSCs en el estado de pluripotencia ingenuo provoca aberraciones cromosómicas significativas y debe evitarse. hiPSCs en los micropocillos se mantienen por 24 horas en el medio de 4i organismos embryoid forma (EBs), que luego adicionales cultivan en recipientes de plástico de baja adherencia bajo una condición oscilante en el medio de inducción de hPGCLC que contiene una alta concentración de BMP4 humana recombinante. EBs se cultivan más un máximo de 8 días en la condición oscilante, no adherente para obtener rendimientos máximos de hPGCLCs. Por inmunohistoquímica, hPGCLCs se detectan fácilmente como las células fuertemente OCT4 en casi todos EBs exclusivamente en su superficie. Cuando EBs son enzimáticamente disociado y sometidos al enriquecimiento de la FACS, hPGCLCs puede recogerse como células CD38 +, con hasta un 40-45% rendimiento.

La placa de micropocillos utilizada aquí es en el formato de 24 pocillos y tiene 8 pocillos con las hojas de pocillos, cada uno de ellos apoya formación de hasta 1.200 EBs. De aproximadamente 24 millones de células de pluripotencia 4i ingenuo, esta placa de micropocillos de genera normalmente ~ 8.000 EBs de ~ 3.000 células por EB. Durante la cultura de no adherente de EBs con oscilación constante, el número de EBs intacto disminuye gradualmente debido a la espontánea uno mismo-desmontaje y ~ 3.000 EBs sobrevivir hasta el día 13 del protocolo. La mayoría de estos sobrevivientes EBs tiene 50-200 hPGCLCs en su superficie (estimado por la detección de immunohistochemical de OCT4 + células en secciones seriadas de EBs; vea la figura 8), rendimiento ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs en total. Digestión enzimática de EBs en las células es un proceso relativamente ineficiente, reduciendo el rendimiento de FACS-enriquecido CD38 + hPGCLCs a 9.000-47.000 células. En nuestras manos, un promedio de seis lotes independientes pero consecutivos de experimentos fue de 14.038 ± 5.731 (media ± SEM). Porque células CD38-negativa EB expresan OCT4 mRNA (qPCR) o proteína (inmunohistoquímica) solamente muy débil, si no totalmente ausentes, de todas las células de la EB fuertemente expresan la proteína OCT4 equivalen prácticamente a toda la población de CD38 + hPGCLCs.
El parámetro crítico de este protocolo incluye la densidad celular. Cuando 2.0 x 105 iPSCs humano se inoculan en una matriz extracelular proteína cubierta de placa de cultivo celular 6-pozo (área de2 9,60 cm crecimiento por pozo) con medio de suplementada con Y27632 2 mL (2.2.9), las células alcanzarán a unos 20-30% confluency en 24 horas después de la inoculación (figura 1). Después de una cultura de 24 horas adicional en el medio mTeSR1 en la ausencia de Y7632, agregados de células y forma colonias, ocupando un ~ 30% de la zona de crecimiento (figura 2). Las células son luego cultivadas en medio reprogramación 4i (2.3.2). Después de 24 horas de cultura en el confluente de células se convierten en medio, 4i (figura 3). Una cultura adicional de 24 horas en el medio de 4i hace que las células densamente poblado (figura 4). El momento exacto del cambio medio (cada 24 horas +-4 horas) y las densidades de célula son cruciales para el éxito formación de EBs y hPGCLCs.
Después de 48 horas cultura en el medio de 4i, las células son disociadas e inoculadas a la placa de micropocillos, que tiene pozos 400 μm en tamaño (2,4). Aunque esta placa de micropocillos de disponible en el mercado es cubierta por baja adherencia por el fabricante, fresco decubrir con detergente (2.4.3) se recomienda para reducir el riesgo de adherencia de células no deseadas. 800 μm micropocillos dio lugar a la producción reducida de hPGCLCs, lo que sugiere la importancia del tamaño de EB para diferenciar correctamente dirigida. Células inoculadas en el medio de 4i forman EBs en los micropocillos a 24-30 horas, que puede ser observados con un estándar, invertido fase microscopio de contraste (figura 5). El contorno circular del EBs se hacen claramente visibles en y después de 24 horas de incubación. EBs de la cosecha en un tiempo anterior (por ejemplo, 16 horas después de la inoculación) antes de que su contorno circular es claramente visible no se recomienda porque tal EBs son muy vulnerables a los daños mecanicistas y desmontar fácilmente. Tenga en cuenta que cantidades significativas de hiPSCs ingenuo no se incorporan en EBs, que es normal. Estas células no incorporadas serán arrastradas antes de la iniciación de la oscilante cultura de EBs en adherente de baja superficie (2.5.2). También tenga en cuenta que, en nuestro protocolo, EBs se forman en el medio de pluripotencia de ingenuo 4i - no en el medio hPGCLC. La formación de sólidos EBs en el medio de 4i antes de la exposición al medio hPGCLC es importante para la distribución de hPGCLCs en la superficie de EBs.
EBs se mantuvo en el medio hPGCLC en una mecedora, condición no adherente cultura mantendrá su forma esférica sin agregación o fusión (figura 6 y figura 7). Demasiado débil oscilación condición causará EB la agregación y fusión, pero demasiado dura condición desmantelará EBs. PGCLCs humanos emergen como OCT4-expresar las células en la superficie de EBs después tan pronto como la cultura de 5 días en el medio de hPGCLC y su número aumenta hasta la cultura de 8 días (figura 8). Incubación más de EBs puede provocar desmantelamiento de EBs y la pérdida de hPGCLCs. PGCLCs humanos pueden ser enriquecidas de células disociadas enzimáticamente de EB después de 5 a 8 días de cultivo en el medio hPGCLC por FACS como células CD38 + (figura 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figura 1: cultivo de células humanas iPSC en suplementada con Y27632 medio 24 horas después de la inoculación. Densidad celular es aproximadamente un 20-30% confluente. En presencia del inhibidor de la roca Y27632, las células tienden a propagarse con elongación largo, como spike. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figura 2: cultivo de células iPSC humanas 48 horas después de la inoculación. Agregado a las colonias de forma, ocupando un ~ 30% del área de crecimiento de las células. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figura 3: cultivo de células iPSC humanas incubadas en medio reprogramación 4i durante 24 horas. Las células llegar a confluencia. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figura 4: cultivo de células iPSC humanas incubadas en medio reprogramación 4i durante 48 horas. Las células confluentes son densamente pobladas. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figura 5: iPSC humana EBs formado en los micropocillos después de 24 horas de incubación en el 4i reprogramación medio. El contorno circular del EBs se hacen visibles a las 24-30 horas después de la inoculación. Cuando el contorno es confirmado bajo el microscopio de contraste de fase, EBs está listo para la transferencia a una condición oscilante de la cultura. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figura 6: iPSC humana EBs se incubaron durante 24 horas en el medio de hPGCLC. EBs en gran parte mantienen su forma esférica. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figura 7: iPSC humana EBs se incubó durante 192 horas en el medio de hPGCLC. EBs se agrandan en comparación con su aspecto en cultivo de 24 horas, pero aún mantienen esféricas sin agregación o fusión. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figura 8: PGCLCs humanos expresan OCT4 se localizan en la superficie de hiPSC EBs se incubó durante 192 horas en el medio de hPGCLC. EBs se incorporado en la proteína de matriz extracelular y procesados para la coloración de immunohistochemical FFPE diapositiva de OCT4 (sustrato DAB). Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figura 9: PGCLCs humanos están enriquecidas de células disociadas enzimáticamente de EB por FACS como CD38+ células. Después de incubación en el medio de hPGCLC 5-8 días, EBs puede ser disociado por digestión enzimática para preparar suspensión unicelular. hPGCLCs puede ser enriquecido como CD38+ de las células por FACS (puntos rojos). Las células de la EB que no expresan CD38 (puntos azules) también deben ser recopilados como control negativo. Puertas de FACS de células CD38 positivas y CD38-negativas deben estar separados con un amplio margen (puntos verdes) para evitar la contaminación de cada tipo de células. Los paneles superiores e inferiores muestran perfiles de FACS sin o con anticuerpos anti-CD38 coloración, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de espermatozoides y óvulos. Se especifican PGCs embrionarias humanas de células del epiblasto pluripotentes a través de interacciones de citoquinas. Aquí, describimos un protocolo de 13 días de inducir transcriptomally células humanas que se asemejan a PGCs en la superficie de embryoid cuerpos de células madre pluripotentes de cebada-pluripotencia inducida.

Generación humana Primordial células germinales-como las células en la superficie de cuerpos de Embryoid de pluripotencia cebada inducida por células madre pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología germinal humana, como cómo se crean o reparan los daños en el genoma de las células germinales primordiales humanas. La principal ventaja de esta técnica es que las células germinales primordiales humanas se pueden generar en dos semanas a partir de las células iPS de pluripotencia cebada que albergan antecedentes genéticos de predisposición de la enfermedad. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prevención del deterioro genómico en las células germinales humanas, porque nuestro modelo de cultivo celular puede ayudarnos a reducir la toxicidad germinal de un fármaco terapéutico.Para comenzar con la generación de células germinales primarias humanas, o PGCLC humanos, prepare placas recubiertas de proteínas de matriz extracelular y suspensión celular de iPSC humanos, como se describe en el protocolo de texto. Preparar una suspensión de una sola célula de iPSC humanos de pluripotencia cebada en el medio mTeSR1 que contiene el inhibidor de la quinasa Y-27632 Rho. Ajuste cuidadosamente la densidad celular a 100.000 células por mililitro.Inocular dos mililitros de suspensión celular de iPSC humanos cebados en cada poc de la proteína de matriz extracelular recubierta de seis pomos, asegurándose de que las células se distribuyen uniformemente agitando las placas vertical y horizontalmente. Incubar las placas en una incubadora de CO2 de tres gases a 37 grados centígrados. Es muy importante inocular exactamente 200.000 células en cada pozo de una placa de seis pozos.El conteo preciso de las células es crítico. Después de completar la conversión transitoria a la pluripotencia ingenua, las celdas deben verse sobre-confluentes, lo cual es normal. La sincronización exacta del cambio medio es importante para lograr altos PGCLC humanos y reproducibilidad experimental.La densidad del cultivo de hiPSC 4i es alta en estas condiciones, y se espera que la célula se confluya en las 48 a 72 horas después de la inoculación. 24 horas después de la inoculación, cambie el medio con dos mililitros por pozo de mTeSR1 medio sin Y27632. Comience la conversión de iPSC humanos de estado de pluripotencia cebado a células madre pluripotentes ingenuas de 4i, calentando 50 mililitros de 4i de medio completo en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos.A las 48 y 72 horas después de la inoculación, retire las placas de la incubadora y cambie el medio con 2 mililitros por pocillo de 4i de medio completo. Centrifugar la placa de micropocillos recubierto de detergente a 1.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Inspeccione los pozos con microscopio invertido para garantizar la ausencia de burbujas de aire.Enjuague los pozos como se describe en el protocolo de texto y repita la centrifugación. Añadir 4i medio completo a los pozos enjuagados. Centrifugar la placa a 1.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente e inspeccione de nuevo los pozos.Para inocular iPSC humanos 4i en la placa de micropocillos, prepare la suspensión de células iPSC humanas como se describe en el protocolo. Filtre esta suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros de tamaño de poro para eliminar agregados celulares. Lavar el colador con un mililitro de 4i precale calentado medio tres veces para recoger todas las células del colador, y contar las células con un contador de cultivo.Luego, diluir esta suspensión de una sola célula de iPSC humanos ingenuos de 4i a 27 a 32,4 millones de células en 9 mililitros precalendigado 4i medio completo que contiene Y27632. Retire la placa de micropocillos previamente preparada que contenga 1 mililitro de 4i de medio completo por pozo de una incubadora de tres gases. Inocular 1 mililitro de suspensión iPSC humana ingenua de 4i en cada poc, para lograr una concentración de 3,0 a 3,6 millones de células por pozo.Pipeta suavemente para distribuir uniformemente las células. Centrifugar la placa a 100 g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Colocar la placa en una incubadora de CO2 de gas trigás, asegurándose de no molestar a las células peletizadas en micropocillos, e incubar durante 24 a 30 horas, porque una incubación durante la noche es insuficiente para la formación de cuerpos embrionarios apretados o EBs.Precalzo 5 mililitros de medio basal PGCLC humano y 20 mililitros de PGCLC humanos completo medio durante al menos cinco minutos en un baño de agua de 37 grados Celsius Coloque cuidadosamente un colador celular de 40 micrómetros de tamaño poro al revés sobre un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros. Para separar los EB de los micropocillos, pipetee suavemente cada pozo de la placa. Para eliminar las células no incorporadas en los EB, filtre el contenido de todos los pozos a través del colador celular.Lave suavemente los EBs retenidos en la membrana del colador celular con 1 mililitro de medio basal PGCLC humano precalegado, y repita el lavado cinco veces. Coloque un tubo cónico fresco de 50 mililitros en el colador celular, de modo que el colador celular ahora se coloque del lado derecho hacia arriba en el nuevo tubo. Invierta rápidamente el colador celular con el nuevo tubo, que colocará los EBs por debajo de la membrana del colador celular.Añadir 18 mililitros de PGCLC humano precale calentado medio completo a la membrana del colador celular para recoger EBs en el tubo cónico. A continuación, placa de 3 mililitros por pozo de la suspensión de EBs en pozos de una placa de seis pozos de fijación baja. Coloque la placa sobre un balancín de movimiento de sierra en una incubadora de tres gases, y ajuste cuidadosamente la velocidad de balanceo a aproximadamente 20 vueltas por minuto.En el día siete al 13 del experimento, recién preparar 20 mililitros de PGCLC humano medio completo cada día. Retire la placa del balancín, lo que hará que los EBs se hundan hasta el fondo de los pozos. Retire el medio viejo sin secar los EB de modo que unos 0,2 mililitros de medio viejo permanezcan en cada pozo.Añadir 3 mililitros por pozo de nuevo medio humano PGCLC, después de retirar el medio antiguo todos los días. Para identificar los PGCLC humanos como células OCT4 positivas, cosecha los EBs a un tubo de microcentrífuga de unión baja de 1,5 mililitros. Deje que los EBs se hundan hasta el fondo a temperatura ambiente y deseche el medio.Enjuague los EBs con hielo frío 1X PBS. Después de retirar el PBS, incubar los EBs en 1 mililitro de hielo frío 1%peso en volumen azida sódica en PBS en hielo durante cinco minutos. Deje que los EBs se hundan hasta el fondo a temperatura ambiente.Después de desechar el sobrenadante, enjuague los EB con PBS helado. Descongelar 200 microlitros de proteína de matriz extracelular sobre hielo. Agregue la proteína al tubo que contiene los EB.Deje el tubo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos, hasta que el gel esté solidificado y los EB estén incrustados. Para fijar los EBs, agregue 1 mililitro de 4%formaldehído en PBS al tubo, e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos con un suave balanceo. Después de eso, deseche el formaldehído y enjuague los EB una vez con PBS frío.Añadir 1 mililitro de 70%etanol. Almacenar en 70%etanol a 4 grados Celsius por hasta una semana, o proceder a procesarlos con un protocolo FFPE estándar. La densidad celular y la distribución uniforme de las células en cada pozo son fundamentales.Los IPSC humanos en 2 mililitros de Y27632 suplementados medio por pozo de una placa de seis pozos, alcanzan 20 a 30% de confluencia después de 24 horas. Después de un cultivo adicional de 24 horas en el medio mTeSR1, en ausencia de Y27632, las células se sumaron y formaron colonias, ocupando aproximadamente el 30% del área de crecimiento. Después de 24 horas de cultivo en el medio de reprogramación 4i, las células alcanzaron la confluencia.Después de 24 horas adicionales de cultivo en el medio 4i, las células se volvieron más densamente embaladas. Después de una incubación de 24 horas en micropocillos en el medio de reprogramación 4i, las células formaron EBs con su contorno circular visible a las 24 a 30 horas después de la inoculación. Los EB mantenidos en el medio humano de LA PGCLC, en condiciones no adherentes, mantuvieron su forma esférica sin agregación después de 24 horas.Después de 192 horas, los EBs eran más grandes, manteniendo la misma morfología. Después de 5 días, las células surgieron como OCT4 que expresa las células en la superficie de los EBs, aumentando su número después de 8 días. Las células de la suspensión de una sola célula de los PGCL humanos fueron enriquecidas como células CD38 positivas por FACS.Las células que no expresan CD38 fueron un control negativo. Para evitar la contaminación, las puertas FACS CD38-positivas y CD38-negativas se separaron por un amplio margen. Al intentar este procedimiento, es importante seguir el conteo exacto de celdas y los tiempos de cambio medio.Omitir el cambio medio incluso un solo día, o reducir el volumen de ese medio en cualquier paso, puede causar la muerte masiva de células. La velocidad del cultivo de balanceo de los cuerpos embrionados tiene que ser cuidadosamente optimizada.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...