Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi erkänner Shiomi Yawata och Chie Owa för tekniskt bistånd under inledande studier. Denna studie stöddes genom NIEHS/NIH grants R01 ES023316 och R21ES024861 till TS och flygvärdinna Medical Research Institute (FAMRI) bidrag till datorer.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Robust tillverkning av hPGCLCs med hjälp av protokollet som beskrivs här bekräftades med tre oberoende kloner av mänskliga iPSCs med normala diploida karyotyp10. Dessa iPSC kloner härleddes från samma mänskliga neonatal dermal huden fibroblast cell kultur10. De kommer att tillhandahållas av författarna till denna artikel till utredare på begäran och enligt avtal om lämpliga material och frakt arrangemang av fryst levande mänskliga celler. Det är för närvarande okänt huruvida normal karyotyp är krävs för robust hPGCLC produktionen använda våra protokoll eller de rapporterats av andra laboratorier.
Nyligen genomförda studier har visat att produktionen av hPGCLCs från hiPSCs11 eller ESCs14 använder ett protokoll som beskrivs av Saitous grupp Kyoto University8 är beroende av uttryck av EOMESODERMIN, krävs en T-box transkriptionsfaktor för induktion av SOX17. SOX17 verkar fungera som master släktlinje fastställande transkriptionsfaktor i könsceller differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller6. EOMESODERMIN kodas av genen EOMES , CRISPR/Cas9 knockout av EOMES orsakade nästan total avsaknad av SOX17 induktion i den hPGCLC som producerar skick11och uttryck för andra gener följt samma mönster av den SOX17 är null knockout celler. Överuttryck av EOMESODERMIN från en inducerbara vektor i den EOMES-null knockout celler under hPGCLC induktion kultur effektivt räddade den robusta hPGCLC produktion samt induktion av könsceller gener, inklusive SOX17. Däremot inducerad överuttryck SOX17 också räddade robust PGCLC produktion men utan förmå EOMES. Således, EOMESODERMIN är en kritisk uppströms inducerare av SOX17, och detta verkar vara den enda viktigaste rollen av EOMESODERMIN i hPGCLC induktion från mänskliga pluripotenta stamceller. Våra protokoll inducerar SOX17 i hiPSCs10, men beroendet EOMESODERMINE induktion väntar skall fastställas.
Detta protokoll konverterar primas-pluripotenta mänskliga iPSCs underhålls i mTeSR1 medellång till ERK-oberoende naiva pluripotency i 96 timmar i 4i omprogrammering medium6, som är en modifierad naiva mänskliga stamceller medium (NHSM)5. Våra försök att generera hPGCLCs börjar med samma mänskliga iPSC klonerna men underhålls i andra kommersiellt tillgängliga mänskliga iPSC tillväxt medier innan kultur i 4i omprogrammering medium resulterade i varierande grad av lägre hPGCLC avkastning. Även om huruvida långsiktiga anpassning i andra medier förbättrar hPGCLC produktion eller inte är fortfarande fastställas i framtida studier, denna observation tyder på att den exakta delstaten den primade pluripotency av mänskliga iPSCs innan 4i omprogrammering betydligt effekter EB bildandet i 4i medium och EB differentiering i hPGCLC medium.
Produktion av hPGCLCs från hiPSCs följande våra protokoll är robust och mycket reproducerbara, delvis på grund av användning av mikrobrunn plattorna som möjliggör effektiv produktion av ett stort antal EBs (~ 8000 EBs per sats) med en enhetlig storlek (3 000 hiPSCs per EB). Antalet EBs lätt produceras i ett parti av experiment med hjälp av våra protokoll kan vara långt större än metoder med regelbundna U-botten cell kultur brunnarna. Produktion av ett stort antal lika stora EBs enhetligt översållad med hPGCLCs kan ge unika möjligheter hög genomströmning kemiska filmvisningar att identifiera små molekylvikt aktivatorer eller hämmare påverkar PGC specifikation eller deras biologiska egenskaper såsom epigenetiska omprogrammering. Sådan EBs kan också vara användbara för toxikologiska bedömningar av stora mängder könsceller cell gifter, inklusive inte bara miljömässiga föroreningar utan också kliniskt föreskrivna mediciner såsom kemoterapeutika.
De kritiska faktorerna av robusta och reproducerbara produktion av hPGCLCs använda protokollet presenteras inkluderar (i) användning av friska hiPSCs underhålls i mTeSR1 på extracellulära matrix protein, (ii) att Inokulera exakta antalet celler som anges och strikt Följ tidpunkterna för medelstora förändring och subkultur, (iii) för att välja en bra massa humant rekombinant BMP4 och (iv) för att minimera fysiska skador av EBs under den gungande kulturen. Det är vår erfarenhet att den bästa massa BMP4 reagens arbetade på 100 ng/mL koncentration medan andra massa BMP4 reagenser krävs 2 X eller större doser. Å andra sidan, avkastningen av hPGCLCs produktion använder den bästa massa BMP4 snarare minskade vid högre doser av BMP4 (t.ex. 200 ng/mL). Vi rekommenderar att testa flera olika massor av rekombinant human BMP4 reagenser erhållits från flera leverantörer för deras prestanda stödja hPGCLC generation och att säkra en stor mängd bästa partiet.
En unik funktion i vårt hPGCLC protokoll är att hPGCLCs är lokaliserade på yttersta ytskiktet av EBs10 (figur 8), medan andra protokoll kan generera hPGCLCs i mitten av cellen aggregat6,8. Embryoid organ tenderar att bilda flera distinkta lager såsom yta, yttre skal, inre skal och kärna, och Regionkommittén central kärna är ofta nekrotisk på grund av begränsad tillförsel av näringsämnen, syre, samt pro-överlevande tillväxt faktorer anges form kulturen medium genom diffusion20. Lokalisering av hPGCLCs på ytan av EBs utan möjliga restriktioner på grund av begränsad spridning mot centrum av EBs kan vara fördelaktigt för direkt, tid - och dos-kontrollerad exponering av hPGCLCs för läkemedel eller giftiga ämnen för farmakologisk eller toxikologiska studier.
Medan musen PGCLCs Visa robust genome-wide DNA demetylering som involverar imprinting kontrollerar regioner åtminstone delvis verkar7,19,20, graden av globala gDNA demetylering i hPGCLCs svagare än mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler tyder på att hPGCLCs kan likna ett tidigare skede av embryonala PGCs än mus PGCLCs10. Det har rapporterats att långvarig kultur av EBs under förutsättning att hPGCLC produktionen orsakade en ökad grad av gDNA demetylering7; om en längre period av kultur av hPGCLCs i EBs eller som isolerade celler kan uppnå mer avancerade stadier av könsceller differentiering måste dock fastställas genom framtida studier.

Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av alla könsceller celler hos båda könen. De flesta av våra kunskaper om utveckling av PGCs i däggdjur embryon har erhållits genom att studera laboratorium möss1,2. På embryonala dag 6,0-6,5 musembryon, är 6 eller liknande litet numrerar av PGC prekursorer belägna i epiblast, och en grundande population ~ 40 PGCs induceras från dem på ett sätt som är beroende av bone morphogenetic proteiner Bmp2 och Bmp4 utsöndras från angränsande celler. De tidigaste mänskliga PGCs hittills identifierat i embryon var på endodermal väggen i gulesäcken på runt slutet av den tredje veckan av dräktigheten3. Eftersom detta är samma ställe som migrerar PGCs observeras i musembryon, är det troligt att de observerade mänskliga PGCs var i vägen för migration men inte den ursprungliga befolkningen. Dock studier spåra tillbaka tidigare stadier av PGCs eller PGC prekursorer i mänskliga embryon har saknats.
Tillgång till mänskliga embryonala PGCs är utmanande på grund av både tekniska och etiska hinder. För att övervinna dessa hinder, har PGC-liknande cell kultur modeller genererats nyligen från mänskliga pluripotenta stamceller (PSC). Pluripotency är cellulära förmåga att differentieras till könsceller och tre embryonala könsceller lager4. Medan mänskliga PSC underhålls i mTeSR1 medium (en ready-to-use, kommersiellt tillgängliga medium som framtagen för underhåll av människors gemensamma kontaktpunkter i tillståndet primade pluripotency) på rätter överdragna med extracellulära matrix protein har primas-state pluripotens 4, 2013 Jacob Hanna's lab visade att de grundmålade pluripotenta cellerna kan omvandlas till en naiv pluripotency stat genom att utsätta för den naiva mänskliga stamceller medium (NHSM) som innehåller kemiska hämmare till proteinkinaser GSK3, ROCK, JNK, ERK1/2, PKC, och p38 MAPK samt tillväxtfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Från naiva-pluripotenta mänskliga kontaktpunkterna, i 2015 fulländade en forskargrupp ledd av Hanna och Azim Surani den första robusta produktionen av mänskliga PGC-Like celler (hPGCLCs) från PSC6. Flera andra laboratorier, inklusive vår, rapporterade senare, generation av hPGCLCs från PSC använder något olika protokoll7,8,9,10. Vår studie som bevis för att hPGCLCs genereras med hjälp av olika protokoll (som sammanfattas i tabell S1 av vår tidigare publicerade studien10) är transcriptomally liknar varandra10. Tillgängliga bevis stöder likheten av mänskliga PGCLCs till nystartade mänskliga embryonala PGCs före den globala epigenetiska erasure7 eller kemotaktisk migration10.
Studier av mus embryonala PGCs, mus PGCLCs och mänskliga PGCLCs (men med endast mycket begränsad tillgång till mänskliga PGCs) har avslöjat att molekylära mekanismer av PGC specifikationen skiljer sig avsevärt mellan mus och människa1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Exempelvis Prdm14 spelar avgörande roller i PGC specifikation i musembryon, men dess roll i mänsklig PGC specifikation verkar begränsad1,15. Däremot är induktion av SOX17 av EOMESODERMIN avgörande för PGC specifikation6,11,14, medan dessa transkriptionsfaktorer verkar dispensable för mus PGC specifikation15. Dessa inledande framgångar av studier med hPGCLCs starkt stödja vikten av denna cell kultur modell som ett surrogat för mänskliga embryonala PGCs.
Nyligen publicerade studier, vårt lab's djupsekvensering utvärdering av genomisk DNA-kopia nummer analys, har visat att långvarig underhåll av PSC i tillståndet naiva pluripotency avsevärt ökar risken för kromosominstabilitet och strukturella anomalier. Fenomenet observerades med både mus18 och mänskliga19 PSC. Den ursprungliga hPGCLC produktion protokollet rapporteras av Hanna/Surani utvecklades för mänskliga PSC underhålls i 4i naiva pluripotency medium för minst 2 veckor6. För att bevara den normala diploida karyotyp av mänskliga PSC och PGCLCs, utvecklade vi ett modifierat protokoll där mänskliga PSC är utsatta till 4i medium för bara 72 timmar10, som presenteras i denna artikel. Mänskliga iPSCs (hiPSCs) bibehålls under den primade pluripotency staten. Omedelbart före bildandet av EB inkuberas celler i 4i naiva omplanering medium (en modifierad NHSM medium) i 48 timmar. Celler är sedan skiljas och packas in i mikrobrunnarna att bilda EBs för ytterligare 24 timmar i 4i medium. EBs underhålls i hPGCLC induktion medium som innehåller en hög koncentration av rekombinant human BMP4 under ett gungande villkor för no-attachment kultur för upp till 8 dagar att få den högsta avkastningen av hPGCLCs. Efter 8 dagars EB kultur, kan hPGCLCs vara isolerade från dissocierade EB celler med FACS CD38 + celler med upp till ~ 40% direktavkastning FACS-sorterbara enda cellsuspension. Medan andra publicerade genererar metoder7,8,9, inklusive den ursprungliga protokollet före våra ändringar6, vanligtvis hPGCLCs i spontant bildade cell aggregat utan specifika lokalisering, hPGCLC producerad av våra protokoll observeras på ytan av embryoid organ (EBs).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av alla könsceller celler. I musembryon induceras en grundande befolkning på ~ 40 PGCs från pluripotenta epiblast celler av iscensatt exponeringar mot cytokiner, däribland benmorfogent protein 4 (Bmp4). I mänskliga embryon, de tidigaste PGCs har identifierats på endodermal väggen i gulesäcken runt slutet av 3rd veckan av dräktigheten, men lite är känt om processen för mänskliga PGC specifikation och sin tidiga utveckling. För att kringgå de tekniska och etiska hinder för att studera mänskliga embryonala PGCs, har surrogat cell kultur modeller genererats nyligen från pluripotenta stamceller. Här beskriver vi ett 13-dagars protokoll för robust produktion av mänskliga PGC-Like celler (hPGCLCs). Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) underhålls i tillståndet primade pluripotency inkuberas i 4i naiva omprogrammering medium för 48 timmar, dissocierade att enstaka celler, och packas in i mikrobrunnarna. Långvarig underhåll av hiPSCs i tillståndet naiva pluripotency orsakar betydande kromosomavvikelser och bör undvikas. hiPSCs i mikrobrunnarna bibehålls för ytterligare 24 timmar på 4i medellång till formuläret embryoid organ (EBs), som sedan odlade i låg-följsamhet plasticware under ett gungande tillstånd hPGCLC induktion medium som innehåller en hög koncentration av rekombinant humant BMP4. EBs odlas vidare upp till 8 dagar i den gungande, icke-anhängare skick för att få maximal avkastning av hPGCLCs. Av immunohistokemi upptäcks lätt hPGCLCs som celler som uttrycker starkt OCT4 i nästan alla EBs uteslutande på deras yta. När EBs är enzymatiskt skiljas och utsätts för FACS anrikning, hPGCLCs kan samlas som CD38 + celler med upp till 40-45% avkastning.

Mikrobrunn plattan används här är i formatet 24-väl och har 8 brunnar holding mikrobrunn arken, som alla stöder bildandet av upp till 1200 EBs. Från cirka 24 miljoner av 4i naiva pluripotenta celler, denna mikrobrunn platta vanligtvis genererar ~ 8000 EBs bestående av ~ 3 000 celler per EB. Under icke-anhängare kultur av EBs med konstant gunga, minskar antalet intakt EBs gradvis på grund av spontan egen nedmontering och ~ 3000 EBs överleva tills dag 13 i protokollet. De flesta av dessa överlevande EBs har 50-200 hPGCLCs på deras yta (beräknad genom immunhistokemisk detektion av OCT4 + celler i seriell avsnitt av EBs, se figur 8), vilket ger ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs totalt. Enzymatisk nedbrytning av EBs in enstaka celler är en relativt ineffektiv process, minska avkastningen av FACS-berikad CD38 + hPGCLCs till 9.000-47 000 celler. I våra händer var ett genomsnitt av sex oberoende men sammanhängande partier av experiment 14,038 ± 5 731 (medelvärde ± SEM). Eftersom CD38-negativ EB celler celler uttrycker OCT4 mRNA (qPCR) eller protein (immunohistokemi) endast mycket svagt, om inte helt frånvarande, alla EB celler starkt uttrycker OCT4 protein är praktiskt taget motsvarar den CD38 + hPGCLCs hela befolkning.
Den viktiga parametern i detta protokoll innehåller cell densiteten. 2,0 x 105 mänskliga iPSCs inokuleras i ett extracellulära matrix protein-belagd väl av 6-väl cell kultur plattan (9.60 cm2 tillväxtområde per brunn) med 2 mL Y27632-kompletteras medium (2.2.9), celler når till ca 20-30% confluency 24 timmar efter inympningen (figur 1). Efter en ytterligare 24-timmars kultur i det mTeSR1 mediet i avsaknad av Y7632, cellerna aggregerade och bildar kolonier, ockuperar ~ 30% av tillväxtområdet (figur 2). Celler odlas sedan i 4i omplanering medium (2.3.2). Efter 24 timmar av kulturen i den 4i medium, celler bli konfluenta (figur 3). En ytterligare 24-timmars kultur i 4i medium gör cellerna tätt packade (figur 4). Exakt tidpunkt för medelstora förändring (varje dygn +/-4 timmar) och cell densiteter är avgörande för framgångsrika bildandet av EBs och hPGCLCs.
Efter 48-timmars kultur på 4i medellång, celler separerade och inokuleras på mikrobrunn plattan, som har wells 400 µm i storlek (2,4). Även om detta kommersiellt tillgängliga mikrobrunn plattan är belagd för rekommenderas av tillverkaren, färska åter beläggning med tvättmedel (2.4.3) yta med låg friktion att minska risken för oönskade celladhesion. 800 µm mikrobrunnar resulterade i minskad avkastning av hPGCLCs, tyder på vikten av EB storlek för korrekt riktat differentiering. Celler som inokuleras i 4i medium kommer bilda EBs i mikrobrunnarna vid 24-30 timmar, som kan observeras med standard, inverterad fas kontrast Mikroskop (figur 5). Cirkulär konturen av EBs blir tydligt synliga vid och efter 24 timmars inkubation. Skörda EBs vid en tidigare tidpunkt (t.ex. 16 timmar efter inympningen) innan deras cirkulär kontur syns tydligt rekommenderas inte eftersom sådana EBs är mycket känsliga för mekaniska skador och enkelt demontera. Observera att betydande mängder naiva hiPSCs inte införlivas i EBs, vilket är normalt. Dessa unincorporated celler kommer att tvättas bort före inledandet av vaggande kultur av EBs på låg-anhängare yta (2.5.2). Observera också att EBs i våra protokoll, bildas i 4i naiva pluripotency medium - inte i hPGCLC medium. Före bildandet av solid EBs 4i medium före exponering till hPGCLC medium är viktigt för distribution av hPGCLCs på ytan av EBs.
EBs underhålls i hPGCLC mediet under en gungande, icke-anhängare kultur skick kommer att bibehålla sin sfäriska form utan aggregering eller fusion (figur 6 och figur 7). Alltför svagt vaggande skick kommer att orsaka EB aggregering och fusion, men alltför hårda villkor kommer att avveckla EBs. Mänskliga PGCLCs dyka upp som OCT4-uttryckande celler på ytan av EBs efter så tidigt som 5-dagars kulturen i hPGCLC medium, och deras antal ökar fram till den 8-dagars kulturen (figur 8). Ytterligare inkubering av EBs kan orsaka demonteringen av EBs och förlust av hPGCLCs. Mänskliga PGCLCs kan berikas från enzymatiskt dissocierade EB celler efter 5-8 dagar av kultur i det hPGCLC medlet av FACS som CD38 + celler (figur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Figur 1: mänskliga iPSC cellkultur i Y27632-kompletteras medium 24 timmar efter inympningen. Cell densiteten är ca 20-30% konfluenta. I närvaro av ROCK-hämmare Y27632 tenderar celler att sprida bra med långa, spike-liknande töjning. Skalstapeln = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Figur 2: mänskliga iPSC cellkultur 48 timmar efter inympningen. Celler aggregerad form kolonierna, ockuperar ~ 30% av tillväxtområde. Skalstapeln = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Figur 3: mänskliga iPSC cellkultur inkuberas i 4i omplanering medium för 24 timmar. Celler nå till konfluens. Skalstapeln = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Figur 4: mänskliga iPSC cellkultur inkuberas i 4i omplanering medium i 48 timmar. Konfluenta celler är tätt packade. Skalstapeln = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Figur 5: mänskliga iPSC EBs bildades mikrobrunnar efter 24-timmars inkubation i 4i omprogrammering medium. Cirkulär konturen av EBs blir synliga 24-30 timmar efter inympningen. När konturen bekräftas i fas kontrast Mikroskop, EBs är redo för överföring till en gungande kultur skick. Skalstapeln = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Figur 6: mänskliga iPSC EBs inkuberas i 24 timmar i hPGCLC medium. EBs behåller till stor del sin sfäriska form. Skalstapeln = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Figur 7: mänskliga iPSC EBs inkuberas i 192 timmar i hPGCLC medium. EBs är förstorade jämfört med deras utseende på 24-timmars kultur, men de fortfarande till stor del behålla sfäriska former utan aggregering eller fusion. Skalstapeln = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Figur 8: mänskliga PGCLCs uttrycker OCT4 är lokaliserade på ytan av hiPSC EBs inkuberas i 192 timmar i hPGCLC medium. EBs var inbäddade i extracellulär matrix protein och bearbetas för FFPE bild immunhistokemisk färgning av OCT4 (DAB-substrat). Skalstapeln = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Figur 9: Mänskliga PGCLCs berikas från enzymatiskt dissocierade EB celler av FACS som CD38+ celler. Efter inkubation i hPGCLC medium för 5-8 dagar, kan EBs särskiljas genom enzymatisk nedbrytning att förbereda enda cellsuspension. hPGCLCs kan berikas som CD38+ celler av FACS (röda prickar). EB-celler som inte uttrycker CD38 (blå prickar) bör också samlas som negativ kontroll. FACS gates CD38-positiva och CD38-negativa celler ska avgränsas med bred marginal (gröna prickar) att undvika kontaminering av varje typ av celler. Övre och nedre panelerna visar FACS profiler utan eller med anti-CD38 antikroppar färgning, respektive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordiala könsceller (PGCs) är gemensamma prekursorer av både spermier och ägg. Mänskliga embryonala PGCs specificeras från pluripotenta epiblast celler genom växelverkan av cytokiner. Här beskriver vi ett 13-dagars protokoll inducera humana celler transcriptomally som liknar PGCs på ytan av embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller.

Generation av mänskliga primordiala könsceller-liknande celler på ytan av Embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i den mänskliga sett toxikologi området, såsom hur skador i arvsmassan av mänskliga primordial könsceller skapas eller repareras. Den största fördelen med denna teknik är att mänskliga primordial könsceller kan genereras i två veckor från den primade pluripotency iPS celler hyser sjukdom predisposition genetisk bakgrund. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot förebyggande av genomisk nedskrivningar i mänskliga sett celler, eftersom vår cellkultur modell kan hjälpa oss att minska sett toxicitet av ett terapeutiskt läkemedel.Till att börja med generering av mänskliga primordial könsceller-liknande celler, eller mänskliga PGCLCs, förbereda extracellulära matris protein-belagda plattor och cell suspension av mänskliga iPSCs, som beskrivs i textprotokollet. Förbered en encellig suspension av primade pluripotency mänskliga iPSCs i mTeSR1 medium som innehåller Y-27632 Rho kinashämmare. Justera försiktigt celltätheten till 100, 000 celler per milliliter.Inokulera två milliliter cell suspension av primade mänskliga iPSCs i varje brunn av extracellulära matrisprotein belagda sex-brunn plattor, se till att cellerna är jämnt fördelade genom att skaka plattorna vertikalt och horisontellt. Inkubera plattorna i en tri-gas CO2 inkubator vid 37 grader Celsius. Det är mycket viktigt att inokulera exakt 200, 000 celler i varje brunn av en sex-brunnsplatta.Exakt räkning av celler är kritisk. Efter avslutad den övergående omvandlingen till naiv pluripotency, celler bör se överkonfluent, vilket är normalt. Exakt tidpunkten för medelhög förändring är viktigt att uppnå hög mänskliga PGCLCs och experimentell reproducerbarhet.Densiteten av 4i hiPSC-kulturen är hög under dessa förhållanden, och det förväntas för cellen att bli konfluent vid 48 till 72 timmar efter inokulering. 24 timmar efter inokulering, byt medium med två milliliter per brunn av mTeSR1 medium utan Y27632. Börja omvandling av primade pluripotency tillstånd mänskliga iPSCs till 4i naiva pluripotenta stamceller, genom att värma 50 milliliter av 4i komplett medium i en 37 grader Celsius vattenbad i 15 minuter.Vid 48 och 72 timmar efter inokulering, ta bort plattorna från inkubatorn, och ändra mediet med 2 milliliter per brunn av 4i komplett medium. Centrifugera den diskmedelsbelagda mikrobrunnsplattan vid 1, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur. Inspektera brunnarna med inverterat mikroskop för att säkerställa frånvaron av luftbubblor.Skölj brunnarna enligt beskrivningen i textprotokollet, och upprepa centrifugeringen. Tillsätt 4i komplett medium till sköljda brunnar. Centrifugera plattan vid 1, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur, och inspektera brunnarna igen.Att inokulera 4i mänskliga iPSCs i microwell plattan, förbereda mänskliga iPSC cell suspension som beskrivs i protokollet. Filtrera denna cell suspension genom en 40 mikrometer porstorlek cell sil för att ta bort cell aggregat. Tvätta silen med en milliliter av förvarvda 4i komplett medium tre gånger för att samla alla celler från silen, och räkna cellerna med en odlingsräknare.Sedan späda denna enda cell suspension av 4i naiva mänskliga iPSCs till 27 till 32,4 miljoner celler i 9 milliliter förvättnad 4i komplett medium som innehåller Y27632. Avlägsna tidigare beredd mikrobrunnsplatta innehållande 1 milliliter 4i komplett medium per brunn från en tri-gasinkubator. Inokulera 1 milliliter av 4i naiva mänskliga iPSC suspension i varje brunn, för att uppnå en koncentration av 3,0 till 3,6 miljoner celler per brunn.Försiktigt pipetter för att jämnt fördela cellerna. Centrifugera plattan vid 100 g i 3 minuter vid rumstemperatur. Placera plattan i en tri-gas CO2 inkubator, se till att inte störa celler pelleterade i mikrobrunnar, och inkubera i 24 till 30 timmar, eftersom en övernattning inkubation är otillräcklig för bildandet av snäva embryonala kroppar eller EBs.Prewarm 5 milliliter av mänskliga PGCLC basala medelstora och 20 milliliter av mänskliga PGCLC komplett medium i minst fem minuter i en 37 grader Celsius vattenbad Placera försiktigt en 40 mikrometer por storlek cell sil upp och ner över en 50 milliliter polypropylen koniska röret. För att lossa EBs från mikrobrunnar, försiktigt pipettera varje brunn av plattan. Om du vill ta bort celler som inte ingår i EBs filtrerar du innehållet i alla brunnar genom cellsilen.Tvätta försiktigt EBs kvar på membranet i cellen sil med 1 milliliter av förvörd mänskliga PGCLC basala medium, och upprepa tvätten fem gånger. Placera ett färskt koniskt rör på 50 milliliter på cellsilen, så att cellsilen nu placeras rätt sida uppåt i det nya röret. Snabbt invertera cellsilen med det nya röret, som kommer att placera EBs under membranet i cellsilen.Tillsätt 18 milliliter av förvörd mänskliga PGCLC komplett medium till membranet i cellen silen att samla EBs i koniska röret. Sedan, tallrik 3 milliliter per brunn av suspensionen av EBs i brunnar av en låg fastsättning sex-brunn plåt. Placera plattan på en gungbräda-flytta vipp i en tri-gas inkubator, och försiktigt ställa gunga hastighet på cirka 20 varv per minut.På dag sju till 13 av experimentet, nybekreda 20 milliliter av mänskliga PGCLC komplett medium varje dag. Ta bort plattan från vipp, som kommer att göra EBs sjunka till botten av brunnarna. Ta bort det gamla mediet utan att torka EBs så att ca 0,2 milliliter gammalt medium finns kvar i varje brunn.Tillsätt 3 milliliter per brunn av färsk mänsklig PGCLC komplett medium, efter att ha tagit bort det gamla mediet varje dag. För att identifiera mänskliga PGCLCs som OCT4-positiva celler, skörda EBs till en 1,5 milliliter låg binda mikrocentrifugrör. Låt EBs sjunka till botten i rumstemperatur, och kasta mediet.Skölj EBs med iskall 1X PBS. Efter att PBS har tagits bort, inkubera EBs i 1 milliliter iskall 1%vikt i volym natriumazid i PBS på is i fem minuter. Låt EBs sjunka till botten i rumstemperatur.När du har kastat supernatanten sköljer du EBs med iskall PBS. Tina 200 mikroliter av extracellulärt matrixprotein på is. Tillsätt proteinet till röret som innehåller EBs.Låt röret vara i rumstemperatur i cirka 10 minuter, tills gelen stelnat, och EBs är inbäddade. För att fixa EBs, tillsätt 1 milliliter av 4%formaldehyd i PBS till röret, och inkubera i rumstemperatur i 15 minuter med mild gungning. Därefter kassera formaldehyden och skölj eb-gummina en gång med iskall PBS.Tillsätt 1 milliliter 70%etanol. Förvara i 70%etanol vid 4 grader Celsius i upp till en vecka, eller fortsätt att bearbeta dem med ett standard FFPE-protokoll. Celltäthet och jämn fördelning av celler på varje brunn är kritiska.Mänskliga IPSCs i 2 milliliter av Y27632 kompletteras medium per brunn av en sex-brunn platta, nå 20 till 30%konfluency efter 24 timmar. Efter ytterligare en 24 timmarskultur i mTeSR1-mediet, i avsaknad av Y27632, samlade celler och bildade kolonier, upptar cirka 30%av tillväxtområdet. Efter 24 timmars kultur i 4i omprogrammering medium, celler nått confluency.Efter ytterligare 24 timmars kultur i 4i-mediet blev celler tätare packade. Efter en 24 timmars inkubation i mikrobrunnar i 4i omprogrammering medium, bildade celler EBs med sin cirkulära kontur syns vid 24 till 30 timmar efter inokulering. EBs hålls i den mänskliga PGCLC medium, under gungande nonadherent villkor, behöll sin sfäriska form utan aggregering efter 24 timmar.Efter 192 timmar var EBs större, upprätthålla samma morfologi. Efter 5 dagar, cellerna fram som OCT4 uttrycker celler på ytan av EBs, öka deras antal efter 8 dagar. Celler från enda cell suspension av mänskliga PGCLCs berikades som CD38-positiva celler av FACS.Celler som inte uttrycker CD38 var negativ kontroll. För att undvika kontaminering, FACS grindar CD38-positiva och CD38-negativa celler var åtskilda av en bred marginal. Medan du försöker detta förfarande, dess viktigt att följa exakt cellräkning och timings av medium förändring.Utelämna medium förändring även en enda dag, eller minska volymen av detta medium vid varje steg, kan orsaka massiv celldöd. Hastigheten hos den gungkultur som embryoidkroppar har måste optimeras noggrant.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Härrör näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stamceller (iPS) Celler med olika storlekar av Embryoid organ

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation Integrations- fria Human inducerade pluripotenta stamceller Använda Hair-härledda Keratinocyter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humana perifera T-celler med Sendai virus i Feeder fria förhållanden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation Integrations-fria inducerade pluripotenta stamceller från humant perifert blod mononukleära celler med användning av episomala vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation av första hjärtat fält-liknande hjärt stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna från mänskliga pluripotenta stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...