Name: generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Biz Shiomi Yawata ve Şef Owa ilk çalışmaları sırasında teknik yardım almak için kabul edersiniz. Bu çalışmada NIEHS/NIH hibe R01 ES023316 ve R21ES024861 TS ve JHH uçuş görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü (FAMRI) hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+primordial+germ+cell.">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), 245-252 (2014).</li><li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+mice.">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).</li><li>De Felici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+Migration,+and+Proliferation+of+Human+Primordial+Germ+Cells.">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li><li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate.">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li><li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification.">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li><li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li><li>Sugawa, F., Ara&#250;zo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile.">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li><li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs.">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li><li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li><li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).</li><li>Magn&#250;sd&#243;ttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice.">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li><li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin.">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li><li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li><li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems.">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li><li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erasure+of+DNA+methylation,+genomic+imprints,+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells.">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li><li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells.">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokolü kullanarak hPGCLCs sağlam üretimi normal diploit karyotip10ile insan iPSCs üç bağımsız klonları ile doğrulandı. Bu IPSC klonlar aynı insan yenidoğan dermal skin fibroblast hücre kültür10elde edilmiştir. Müfettişler istek üzerine ve altında uygun malzeme transfer anlaşması ve aranjman dondurulmuş canlı insan hücrelerinin nakliye için bu makalenin yazarları tarafından sağlanacaktır. Normal karyotip bizim iletişim kuralı ya da diğer laboratuvarlar tarafından bildirilen kullanarak sağlam hPGCLC üretim için gerekli olup halen bilinmemektedir.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda hPGCLCs hiPSCs11 veya Kyoto Üniversitesi8 Saitou'nın grup tarafından açıklanan bir iletişim kuralı kullanılarak ESCs14 üretimini EOMESODERMIN ifade üzerinde bağımlı olduğunu göstermiştir, bir T-box transkripsiyon faktörü için gerekli İndüksiyon SOX17. SOX17 insan pluripotent kök hücreler6germline ayrımında transkripsiyon faktörü belirleme ana soy olarak çalışmaya görünüyor. EOMESODERMIN EOMES Gen tarafından kodlanır ve EOMES CRISPR/Cas9 nakavt neden neredeyse SOX17 indüksiyon olmaması koşulu11üreten hPGCLC ve diğer genlerin ifade izledi aynı desen SOX17 null nakavt hücreleri. EOMESODERMIN overexpression EOMESindüklenebilir bir vektörde üzerinden-null nakavt hücreleri hPGCLC indüksiyon kültür sırasında etkili bir şekilde kurtarıldı sağlam hPGCLC üretim hem de indüksiyon germline gen, SOX17 de dahil olmak üzere. Buna ek olarak, indüklenen overexpression SOX17 de sağlam PGCLC üretim kurtarıldı ama EOMES inducing olmadan. Bu nedenle, EOMESODERMIN SOX17 bir kritik ters yönde uyarıcı ve bu insan pluripotent kök hücrelerden EOMESODERMIN tek en önemli rol hPGCLC indüksiyon içinde görünüyor. Bizim protokol SOX17 hiPSCs10dakika sonra indükler ama belirlenecek EOMESODERMINE indüksiyon bağımlı bekliyor.
Bu iletişim kuralı astarlanmalıdır pluripotency insan iPSCs mTeSR1 orta ERK bağımsız saf pluripotency için 96 değiştirilmiş saf insan kök hücre Orta (NHSM)5olduğu orta6, yeniden programlama saat için 4i içinde tutulan dönüştürür. Bizim girişimleri aynı insan IPSC klonlar ile başlayan ancak daha düşük hPGCLC verimleri derecelerde orta yeniden programlama kültür 4i sonuçlandı önce diğer ticari olarak mevcut insan IPSC büyüme medyada Bakımı hPGCLCs oluşturmak için. Bu gözlem öneriyor olup diğer ortamlarda daha uzun vadeli adaptasyon hPGCLC üretim artırır veya değil kalır gelecek çalışmalarda belirlenir rağmen önemli ölçüde yeniden programlama insan iPSCs 4i önce astarlanmalıdır pluripotency tam durumunu EB oluşumu 4i orta ve EB farklılaşma hPGCLC ortamda etkiler.
Bizim protokol sonrası hiPSCs üzerinden hPGCLCs yapımıdır güçlü ve son derece verimli üretimi çok sayıda EBs etkinleştirmek microwell plakaları kullanımı sayesinde kısmen tekrarlanabilir (~ 8.000 EBs toplu iş başına) ile üniforma büyüklük (EB başına 3.000 hiPSCs). EBs kolayca üretilen deney bizim protokolünü kullanarak tek bir toplu iş sayısı normal U-alt hücre kültür wells kullanarak yöntemlerden daha çok daha büyük olabilir. Çok sayıda eşit büyüklükte EBs düzgün hPGCLCs ile çivili üretimini küçük molekül ağırlıklı aktivatörleri veya PGC belirtimi etkileyen inhibitörleri tanımlamak için benzersiz fırsatlar yüksek üretilen iş kimyasal gösterimleri sağlayabilir veya onların Epigenetik yeniden programlama gibi biyolojik özellikleri. Böyle EBs da germline hücre toxicants, sadece çevresel kirleticiler ama kemoterapötik ajanlar gibi Ayrıca klinik olarak reçete ilaçlar da dahil olmak üzere çok sayıda toksikolojik değerlendirmeler için yararlı olabilir.
(İ) sağlıklı hiPSCs mTeSR1 hücre dışı matriks proteini, (ii) hücre belirtilen ve kesinlikle tam sayısı aşılamak için üzerinde saklanır kullanımı sunulan protokolü kullanılarak hPGCLCs sağlam ve tekrarlanabilir üretim kritik faktörler Orta değiştirmek ve alt kültür, (III) insan rekombinant BMP4 ve (iv) sırasında sallanan kültür EBs fiziksel zararlarını en aza indirmek için iyi bir sürü seçmek için zamanlamaları izleyin. 2 X veya daha büyük dozlarda BMP4 reaktifler diğer çok gerekli ise, en çok BMP4 reaktif 100 ng/mL konsantrasyonu çalıştı bizim deneyimdir. Diğer taraftan, verim hPGCLCs BMP4 en iyi sürü oldukça azaldı BMP4 daha yüksek dozlarda kullanma (Örneğin, 200 ng/mL). Rekombinant insan BMP4 reaktifler performanslarını hPGCLC üretimi destekleme için birden çok satıcı elde edilen birkaç farklı bir sürü test etmek ve en iyi çok büyük miktarda güvenliğini sağlamak için önerilir.
Diğer iletişim kuralları hPGCLCs hücre toplamları6,8ortasında oluşturabilirsiniz, ancak bizim hPGCLC iletişim kuralı benzersiz bir özelliği hPGCLCs EBs10 (Şekil 8), en dış yüzey katman üzerinde lokalizedir var. Embryoid organları yüzeyinde, dış kabuk, iç kabuk ve çekirdek gibi birden çok farklı katmanları oluşturmak eğilimindedir ve merkezi çekirdeğe bölgeler genellikle besin, oksijen gibi büyüme faktörleri sağlanan form kültür pro hayatta kalan sınırlı kaynağı nedeniyle kangren olan Orta difüzyon20tarafından. Yerelleştirme hPGCLCs EBs yüzeyi merkezi EBs doğru sınırlı difüzyon nedeniyle mümkün kısıtlama olmaksızın doğrudan, süre ve dozda kontrol maruz hPGCLCs, uyuşturucu ya da toksik maddeler için yararlı olabilir farmakolojik veya Toksikolojik çalışmalar.
Oysa kontrol fare PGCLCs gösteri sağlam genom çapında DNA demethylation sürecinden içeren bölgeleri en azından kısmen7,19,20, hPGCLCs genel gDNA demethylation derecesini fare zayıf görünüyor PGCLCS veya PGCs6,7. Transcriptomal profiller hPGCLCs embriyonik PGCs bir İngiliz kontu sahne fare PGCLCs10' dan benzeyebilir öneririz. Bu EBs hPGCLC üretim koşul altında uzun süreli kültür gDNA demethylation7artan bir ölçüde neden olduğu bildirilmiştir; Ancak, kültür hPGCLCs EBs veya izole hücreler olarak uzun bir süre daha ileri aşamalarında germline farklılaşma elde edebilirsiniz gelecekteki çalışmaları tarafından belirlenecektir gerekir.

Primordial germ hücreleri (PGCs) her iki cinsiyette bütün germline hücrelerinin ortak öncüleri vardır. Çoğu memeli embriyo PGCs gelişiminde bizim bilgi, elde laboratuvar fareler1,2eğitim yoluyla. Embriyonik gün fare embriyo 6.0-6.5, PGC öncüleri 6 veya benzeri az sayıda epiblast ve ~ 40 PGCs onlardan bir şekilde bağlı olarak kemik morfogenetik proteinler Bmp2 ve Bmp4 üzerinden bitişik salgılanan indüklenir kurucu nüfusu bulunmaktadır hücreleri. Sarısı sac gebelik3üçüncü haftanın sonunda etrafında endodermal duvarına erken insan PGCs defa embriyo tespit edildi. Çünkü bu aynı yerde geçirme PGCs fare embriyo gözlemlediği gibi gözlenen insan PGCs geçiş ama değil kurucu nüfus yolunda olduğunu muhtemeldir. Ancak, geri önceki aşamaları takip çalışmalar PGCs veya PGC kara filmin tarih öncesi insan embriyosu içinde eksik olmuştur.
İnsan embriyonik PGCs erişim etik ve teknik engeller nedeniyle meydan okuyor. Bu engelleri aşmak için PGC benzeri hücre kültür modelleri son zamanlarda insan pluripotent kök hücrelerden (PSC) üretilmedi. Pluripotent germline ve üç embriyonik mikrop katmanlar4ayırt etmek için hücresel yetenektir. Hücre dışı matriks proteini ile kaplı yemekleri mTeSR1 Orta (kullanıma hazır, piyasada bulunan Orta astarlanmalıdır pluripotency devlet insan PSC'ler bakımı için formüle edilmiş) insan PSC'ler saklanır, ancak astarlanmalıdır durumlu pluripotency var 4, 2013 yılında Jacob Hanna'nın laboratuar astarlanmalıdır pluripotent hücreler tarafından protein kinaz için kimyasal inhibitörleri içeren saf insan kök hücre Orta (NHSM) açığa ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, saf pluripotency durumuna dönüştürülebileceğini gösterdi p38 MAPK ve büyüme faktörleri LIF, TGF, bFGF5. Saf-pluripotency insan PSC'ler 2015 yılında Hanna ve Azim Surani liderliğindeki bir araştırma grubu insan PGC-Like hücreleri (hPGCLCs) PSC6ilk sağlam üretimi tamamlandı. Daha sonra bizimki de dahil olmak üzere birçok diğer laboratuvarlar, hPGCLCs biraz farklı protokolleri7,8,9,10kullanarak PSC'ler gelen nesil rapor. Bizim çalışma (ki bizim daha önce yayımlanmış çalışma10içinde tablo S1 özetlenmiştir) farklı protokolleri kullanılarak oluşturulan hPGCLCs transcriptomally birbirlerine10' a benzer olduğuna dair bir kanıt sağladı. Eldeki kanıtlar insan PGCLCs için küresel epigenetik silme7 ve/veya kemotaktik geçiş10önce aşamasındaki insan embriyonik PGCs benzerliğe destekler.
Çalışmaların fare embriyonik PGCs, fare PGCLCs ve insan PGCLCs (ama yalnızca insan PGCs çok sınırlı erişim) moleküler mekanizmaları PGC belirtiminin fare ve insan1,6, önemli ölçüde farklıdır ortaya koymuştur 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. Örneğin, Prdm14 fare embriyo belirtiminde PGC kritik rol oynar, ama insan PGC belirtimi rolü sınırlı1,15görünüyor. Buna ek olarak, bu transkripsiyon faktörleri için fare PGC belirtimi15gereksiz görünüyor ise SOX17 EOMESODERMIN tarafından indüksiyon PGC belirtimi6,11,14için önemlidir. HPGCLCs güçlü kullanarak çalışmalar ilk bu başarılarının önemini bu hücre kültür model insan embriyonik PGCs bir vekil olarak destekler.
Bizim lab's derin sıralama genomik DNA kopyalama numara analizi, değerlendirilmesi ile ilgili kısa bir süre önce çalışmalar PSC'ler saf pluripotency durumda uzun süreli bakım önemli ölçüde kromozom istikrarsızlık riski artırır göstermiştir ve yapısal anomaliler. Bu olay hem fare18 ve insan19 PSC'ler gözlendi. Hanna/Surani tarafından bildirilen özgün hPGCLC üretim Protokolü insan PSC'ler 4i saf pluripotency orta için en az 2 hafta6muhafaza için geliştirilmiştir. Normal diploit karyotip insan PSC'ler ve PGCLCs korumak için biz hangi insan PSC'ler için bu makalede sunulan sadece 72 saat10, 4i orta maruz değiştirilmiş bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. İnsan iPSCs (hiPSCs) altında astarlanmalıdır pluripotency durumu korunur. Hemen EB oluşumu önce hücreleri 4i saf programlama Orta (değiştirilmiş NHSM orta) 48 saat inkübe. Hücreler sonra ayrışmış ve paketlenmiş forma EBs microwells 4i Orta içinde ek bir 24 saat. EBs rekombinant insan BMP4 8 gün için no-eki kültür için sallanan bir koşul altında hPGCLCs maksimum verim elde etmek için yüksek konsantrasyon içeren hPGCLC indüksiyon ortamda sürdürülür. CD38 + % ~ 40 hücrelerle FACS sıralanabilir tek hücre süspansiyon verim olarak 8 günlük EB kültür sonra hPGCLCs Disosiye EB hücrelerden FACS tarafından ayrılmış olabilir. Yayınlayan diğer ise bizim değişiklikler6önce özgün protokolü de dahil olmak üzere yöntemleri7,8,9, genellikle oluşturmak hPGCLCs içinde özel olmadan kendiliğinden oluşan hücre toplamları yerelleştirme, bizim iletişim kuralı tarafından üretilen hPGCLC embryoid organları (EBs) yüzeyde görülmektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primed pluripotency hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 &#956;L). Use cold tubes. Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 &#176;C for up to 
			4 weeks without affecting cell culture performance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1683</td>
			<td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &#956;L water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 &#956;m). Aliquot 20 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i hiPSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1286101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td>Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 &#956;L/tube x 15 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human LIF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-05</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human LIF with 250 &#956;L water. Add 750 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is &#62;10,000 units/&#956;g. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 &#956;g/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TGF-&#946;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Reconstitite 50 &#956;g with 50 &#956;L of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL human TGF-&#946;1 stock solution. Aliquot 4 &#956;L/tube x 50 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4i basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make 4i basal medium. 
			500 mL of KnockOut DMEM 
			100 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			650 &#181;L of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 
			40 &#181;L of 250 &#181;g/mL human LIF 
			20 &#181;l of 200 &#181;g/ml human FGF2 
			4 &#181;l of 250 &#181;g/ml human TGF-&#946;1 
			Aliquots 40 ml/tube and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 &#956;L DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 35 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 &#956;L DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 20 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIRB796</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1358</td>
			<td>Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 &#956;L DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP600125</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1496</td>
			<td>Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 &#956;L DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 &#956;L/tube x 18 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27845</td>
			<td>Microwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#8217;s MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPGCLC basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 
			500 mL of Glasgow&#8217;s MEM 
			75 mL of KnockOut Serum Replacement 
			6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 
			6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 
			6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) 
			Aliquots 40 mL/tube and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Dilute 350 &#956;L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 &#956;g/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 &#956;L/tube x 40 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Reconstitute 250 &#956;g human SCF with 500 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 &#956;g/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 &#956;L/tube x 14 tubes and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 &#956;L/tube x 10 tubes. Dilute 100 &#956;L of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 &#956;L of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 &#956;g/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 &#956;L/tube x 20 tubes. Store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Pore size = 40 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low attachment plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vari-Mix Platform Rocker</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M79735Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical staining </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOXALL Blocking Solution</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse serum 
			ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-8629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolating hPGCLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryoid Body Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD38 antibody conjugated to APC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab134399</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human primordial germ cell-like cells at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells

Primordial germ hücreleri (PGCs) germline hücrelerin tümünü ortak öncüleri vardır. Fare embriyo ~ 40 PGCs kurucu nüfusu sitokinler, kemik morfogenetik protein 4 (Bmp4) de dahil olmak üzere için orkestra Etkilenmeler tarafından pluripotent epiblast hücrelerinden indüklenen. İnsan embriyosu, en erken PGCs sarısı sac gebeliğin 3rd haftanın sonunda etrafında endodermal duvara tespit edilmiştir ama insan PGC belirtimi ve erken geliştirme süreci hakkında az şey bilinir. İnsan embriyonik PGCs okuyan teknik ve etik engelleri aşmak için vekil hücre kültür modelleri son zamanlarda pluripotent kök hücrelerden üretilmedi. Burada, biz insan PGC-Like hücre (hPGCLCs) sağlam üretim için bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) astarlanmalıdır pluripotency durumda tutulan orta 48 saat boyunca yeniden programlama 4i saf içinde inkübe, tek kişilik hücrelere ayrışmış ve microwells paketlenmiştir. Uzun süreli hiPSCs ve saf pluripotency Devlet bakımından önemli kromozom anomalileri neden olur ve kaçınılmalıdır. 24 saat içinde daha sonra formu embryoid organları (EBs), 4i ortamına düşük-bağlılık plasticware yüksek konsantrasyon içeren hPGCLC indüksiyon orta sallanan bir koşulda içinde kültürlü bir ek için hiPSCs microwells içinde korunur Rekombinant insan BMP4. EBs daha da hPGCLCs en yüksek verimi elde etmek için sallanan, Sigara yapışık durumda 8 güne kadar kültürlü. İmmünhistokimya, hPGCLCs kolayca güçlü OCT4 neredeyse tüm EBs içinde sadece onların yüzeyinde ifade hücreler olarak algılanır. EBs enzimatik ayrışmış ve FACS zenginleştirme için tabi hPGCLCs CD38 + % 40-45'e kadar hücrelerle olarak toplanabilir verim.

Burada kullanılan microwell plaka 24-şey biçiminde ve her biri çekmek ilâ 1200 oluşumu microwell sayfaları tutan 8 kuyu vardır EBs. Of 4i saf pluripotent hücreler yaklaşık 24 milyon bu microwell plaka tipik olarak ~ 8.000 üretir EB başına ~ 3.000 hücre oluşan EBs. Sürekli sallanan ile yapışık olmayan kültür EBs sırasında bozulmamış EBs sayısı yavaş yavaş kendiliğinden kendi kendine sökülmesi ve ~ 3.000 nedeniyle azalır EBs Protokolü'nün 13 gün kadar hayatta kalmak. En-in bunlar EBs hayatta var 50-200 hPGCLCs onların yüzeyinde (OCT4 + EBs seri bölümlerini hücrelerde immunohistokimyasal tespiti tarafından tahmini; bkz. Şekil 8), ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs Toplam verimli. EBs enzimatik sindirim tek hücreye 9.000-47.000 hücrelere FACS zenginleştirilmiş CD38 + hPGCLCs verimini azaltarak nispeten verimsiz bir süreçtir. Bizim ellerimizde deneyler altı bağımsız ama ardışık toplu işlemleri ortalama 14,038 ± 5,731 (± SEM demek) olduğunu. CD38 negatif EB hücreler hücreleri OCT4 mRNA (qPCR) veya protein (immünhistokimya) sadece çok zayıf hızlı değilse, çünkü tamamen yok, tüm EB hücreleri şiddetle CD38 + hPGCLCs tüm popülasyona hemen hemen eşdeğer OCT4 protein ifade.
Bu protokol kritik parametresi hücre yoğunluğu içerir. Ne zaman 2.0 x 105 insan iPSCs içinde bir hücre dışı matriks protein kaplı de, 6-şey hücre kültür plaka (2 büyüme alanı iyi ücret 9.60 cm) 2 mL Y27632 takıma Orta (2.2.9) ile aşılanmış, hücreleri için yaklaşık % 20-30 ulaşacak 24 confluency saat sonra aşılama (Şekil 1). MTeSR1 orta Y7632, hücre toplama ve form kolonileri yokluğunda ek bir 24 saatlik kültür sonra büyüme alanı (Şekil 2) % ~ 30'u işgal. Hücreleri sonra 4i programlama Orta (2.3.2) kültürlü. Kültür 4i orta, hücreleri haline birleşmesi (Şekil 3) 24 saat sonra. Ek bir 24 saatlik kültür 4i orta yoğun (Şekil 4) Paketli hücreleri yapar. Orta değiştirmek (+/-4 saat 24 saatte) ve hücre yoğunluğu tam zamanlaması EBs ve hPGCLCs başarılı oluşumu için kritiktir.
4i orta 48 saat kültür sonra hücreleri ayrışmış ve kuyu 400 µm boyutu (2.4) olan microwell plaka aşılandı. Bu piyasada bulunan microwell plaka için kaplı rağmen düşük yapışma yüzey deterjan (2.4.3) ile yeniden kaplama taze üretici tarafından istenmeyen hücre yapışma riskini azaltmak için önerilir. 800 µm microwells hPGCLCs, EB boyutu düzgün yönlendirilmiş farklılaşma için önemini telkin düşük verim sonuçlandı. Hücreleri 4i ortamda aşısını EBs microwells içinde 24-30 saat, bir standart, ters faz kontrast mikroskop (Şekil 5) kullanarak gözlenen oluşturacak. EBs dairesel kontur haline ve, kuluçka 24 saat sonra açıkça görülebilir. Önceki bir zamana (Örneğin 16 saat sonra aşı), EBs hasat onların dairesel dağılımı açıkça görünür olmadan böyle EBs Mekanik hasarlar için çok hassas ve kolayca ortadan kaldırmak için önerilmez. Saf hiPSCs önemli miktarda değildir Not normal olan EBs içinde dahil. Bu adi hücreler EBs kültür düşük-yapışkan yüzeyi (2.5.2) sallanan başlatma önce yıkanıp. Ayrıca bizim iletişim kuralında, EBs kurdu, 4i saf pluripotency orta - hPGCLC ortamda dikkat edin. Öncesi 4i orta hPGCLC orta maruz önce katı EBs oluşumu EBs yüzeyinde hPGCLCs, dağıtımı için önemlidir.
EBs tutulan bir sallanan altında hPGCLC orta yapışık kültür durumu küresel şekilleri toplama veya füzyon (Şekil 6 ve Şekil 7) olmadan koruyacaktır. Çok zayıf durumu sallanan EB toplama ve füzyon neden olur, ancak çok sert koşul EBs ortadan kaldırmak. İnsan PGCLCs OCT4 ifade hücreler EBs yüzeyi olarak 5 günlük kültür hPGCLC orta ve onların sayı artar gibi erken sonra 8 günlük Kültür (Şekil 8) kadar ortaya çıkar. EBs daha da kuluçka EBs ve hPGCLCs kaybı söküm neden olabilir. İnsan PGCLCs enzimatik Disosiye EB hücrelerden kültür hPGCLC orta 5-8 gün sonra FACS tarafından CD38 + hücreler (Şekil 9) olarak zenginleştirilmiş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> Şekil 1: insan IPSC hücre kültüründe Y27632 takıma orta 24 saat sonra aşı. Hücre yoğunluğudur yaklaşık 20-%30 konfluent. ROCK inhibitörü Y27632 huzurunda, hücreleri de uzun, spike gibi uzama ile yayılmış eğilimindedir. Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> Şekil 2: insan IPSC hücre kültürü 48 saat sonra aşı. Hücreler büyüme alanı % ~ 30'u işgal formu kolonileri için toplamak. Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> Şekil 3: insan IPSC hücre kültürü 24 saat boyunca 4i programlama ortamda inkübe. Hücreleri confluency için ulaşmak. Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> Şekil 4: insan IPSC hücre kültürü 4i programlama ortamında 48 saat inkübe. Konfluent hücreleri yoğun paketlenmiştir. Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> Şekil 5: insan IPSC EBs oluşan microwells içinde orta yeniden programlama 24 saatlik kuluçka sonra içinde 4i. 24-30 saat sonra aşı görünür hale EBs dairesel kontur. Kontur faz kontrast mikroskop altında onaylandığında, EBs sallanan bir kültür durumu aktarmak için hazır. Ölçek çubuğu 500 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> Şekil 6: insan IPSC EBs inkübe hPGCLC Orta içinde 24 saat. EBs büyük ölçüde onların küresel şekli korumak. Ölçek çubuğu 500 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> Şekil 7: insan IPSC EBs inkübe hPGCLC orta 192 saat. EBs görünümlerini, 24 saatlik kültürüne göre genişlemiş, ama onlar hala büyük ölçüde küresel şekillerle hiçbir toplama ya da füzyon korumak. Ölçek çubuğu 500 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> Şekil 8: insan PGCLCs OCT4 ifade lokalize hPGCLC orta 192 saat inkübe EBs hiPSC yüzeyinde. EBs hücre dışı matriks proteini gömülü ve FFPE slayt immunohistokimyasal OCT4 boyama için işlenen (DAB substrat). Ölçek çubuğu 1 mm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> Şekil 9: İnsan PGCLCs enzimatik Disosiye EB hücrelerden FACS CD38 olarak tarafından zenginleştirilmiş+ hücreleri. 5-8 gün boyunca hPGCLC orta kuluçka sonra EBs tek hücre süspansiyon hazırlamak için enzimatik sindirim tarafından ayrışmış. hPGCLCs CD38 zenginleştirilmiş+ hücreleri tarafından FACS (kırmızı nokta). CD38 ifade edemediği EB hücreleri (mavi noktalar)-da var toplanan negatif kontrol. FACS gates CD38 pozitif ve negatif CD38 hücre hücreleri her tür kirlenmesini önlemek için geniş kenar boşluğu ile (yeşil nokta) ayrılmalıdır. Alt ve üst panelleri FACS profilleri olmadan veya anti-CD38 antikor boyama, sırasıyla göster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ hücreleri (PGCs) ortak öncüleri sperm ve yumurta vardır. İnsan embriyonik PGCs pluripotent epiblast hücreleri sitokinler etkileşimleri aracılığıyla belirtilir. Burada, biz insan hücreleri transcriptomally embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotency indüklenen pluripotent kök hücreler, PGCs benzeyen inducing bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak.

Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Bu yöntem, insan mikrop toksikolojisi alanında, insan ilkel mikrop hücrelerinin genomundaki hasarların nasıl yaratıldığı veya onarıldığı gibi anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, insan ilkel mikrop hücrelerinin hastalık yatkınlığı genetik arka plan barındıran astarlı pluripotency iPS hücrelerinden iki hafta içinde oluşturulabilir olmasıdır. Bu tekniğin etkileri insan germline hücrelerinde genomik bozulmanın önlenmesine doğru uzanır, çünkü hücre kültürü modelimiz terapötik bir ilacın germline toksisitesini azaltmamıza yardımcı olabilir.İnsan ilkel germ hücre benzeri hücrelerin üretimi ile başlamak için, veya insan PGCLCs, ekstrasellüler matris protein kaplı plakalar ve insan iPSCs hücre süspansiyon hazırlamak, metin protokolünde açıklandığı gibi. Y-27632 Rho kiril inhibitörü içeren mTeSR1 ortamda astarlı pluripotency human iPSCs tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Hücre yoğunluğunu mililitrebaşına 100,000 hücreye dikkatlice ayarlayın.Hücre dışı matriks protein kaplı altı iyi plakalar her kuyuda astarlanmış insan iPSCs hücre süspansiyon hücre süspansiyon iki mililitre aşılamak, hücrelerin dikey ve yatay plakalar sallayarak eşit olarak dağıtılan emin olun. Plakaları 37 derecede üç gazlık bir CO2 kuluçka makinesiyle kuluçkaya yatırın. Altı kuyulu bir plakanın her kuyuda tam olarak 200.000 hücre aşılamak çok önemlidir.Hücrelerin doğru saysayımı çok önemlidir. Naif pluripotency geçici dönüşüm tamamlandıktan sonra, hücreler normal dir aşırı konfluent bakmak gerekir. Orta değişimin tam zamanlaması yüksek insan PGCLC'leri ve deneysel tekrarlanabilirlik elde etmek için önemlidir.4i hiPSC kültürünün yoğunluğu bu koşullar altında yüksektir ve aşılamadan sonraki 48 ila 72 saat içinde hücrenin konsepsiye olması beklenmektedir. Aşılamadan 24 saat sonra, Y27632 olmadan mTeSR1 ortamının kuyubaşına iki mililitre ile orta değiştirin. Astarlı pluripotency devlet insan iPSCs 4i saf pluripotent kök hücrelere dönüşüm başlayın, 15 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda 4i tam orta 50 mililitre ısıtarak.Aşıdan 48 ve 72 saat sonra, kuvözden plakaları çıkarın ve 4i tam orta kuyu başına 2 mililitre ile orta değiştirin. Deterjan kaplı mikrokuyu plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.000 g'da santrifüj edin. Hava kabarcıklarının yokluğunu sağlamak için kuyuları ters mikroskopla inceleyin.Metin protokolünde açıklandığı gibi kuyuları durulayın ve santrifüjünü tekrarlayın. Durulanmış kuyulara 4i tam orta ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1,000 g'de santrifüj edin ve kuyuları tekrar inceleyin.Mikrokuyu plaka içine 4i insan iPSCs aşılamak için, protokolde açıklandığı gibi insan iPSC hücre süspansiyon hazırlamak. Hücre agregalarını çıkarmak için bu hücre süspansiyonuna 40 mikrometre lik gözenek boyutunda bir hücre süzgeciuygulayın. Süzgeçten tüm hücreleri toplamak için bir mililitre önceden ısıtılmış 4i tam orta üç kez süzgeç ile yıkayın ve bir kültür sayacı ile hücreleri saymak.Daha sonra, 4i saf insan iPSCs bu tek hücresüspansiyon seyreltmek 27 için 32.4 milyon hücre 9 mililitre önceden ısıtılmış 4i tam orta Y27632 içeren. Üç gazlı bir kuluçka makinesinden kuyu başına 1 mililitre 4i komple orta içeren önceden hazırlanmış mikro kuyu plakasını çıkarın. Her kuyuya 1 mililitre saf insan iPSC süspansiyonu aşılamak, kuyu başına 3,0 ila 3,6 milyon hücre konsantrasyonu elde etmek için.Hücreleri eşit olarak dağıtmak için yavaşça pipet. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 g olarak plaka santrifüj. Plakayı üç gazlı CO2 kuluçka makinesine yerleştirin, mikrowelllerde bulunan hücreleri rahatsız etmemeyi unutmayın ve bir gecede kuluçka ya da sıkı embriyonik cisimlerin veya EB'lerin oluşumu için yetersiz olduğundan 24 ila 30 saat kuluçkaya yatırın.Prewarm 5 mililitre insan PGCLC bazal orta ve insan PGCLC 20 mililitre 37 derece santigrat su banyosu en az beş dakika boyunca orta dikkatle bir 40 mikrometre gözenek büyüklüğünde hücre süzgeç baş aşağı bir 50 mililitre polipropilen konik tüp üzerinde yerleştirin. EB'leri mikro kuyulardan ayırmak için, plakanın her kuyusu için yavaşça pipet. EB'lerde yer alan hücreleri kaldırmak için, tüm kuyuların içeriğini hücre süzgecinden geçirin.Hücre süzgecinin zarında tutulan EB'leri 1 mililitre önceden ısıtılmış insan PGCLC bazal orta ile hafifçe yıkayın ve beş kez yıkayın. Hücre süzgeci nin üzerine 50 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin, böylece hücre süzgeci şimdi yeni tüp sağ tarafa konumlandırılmış. EB'leri hücre süzgecinin zarının altına yerleştirecek olan yeni tüple hücre süzgecini hızlı bir şekilde ters çevirin.Konik tüpTE EB toplamak için hücre süzgeci nin zarına önceden ısıtılmış insan PGCLC tam orta 18 mililitre ekleyin. Daha sonra, düşük eki altı iyi plaka kuyuları içine EBs süspansiyon kuyu başına plaka 3 mililitre. Plakayı üç gazlı bir kuluçka makinesine bir tahterevalli kayasına yerleştirin ve sallanan hızı dakikada yaklaşık 20 dönüşte dikkatlice ayarlayın.Deneyin yedinci ila 13 gününde, her gün 20 mililitre insan PGCLC tam orta hazırlayın. EBs kuyuların altına lavabo yapacak rocker, plaka çıkarın. EB'leri kurutmadan eski ortamı çıkarın, böylece her kuyuda yaklaşık 0,2 mililitre eski ortam kalır.Taze insan PGCLC tam orta kuyu başına 3 mililitre ekleyin, eski orta günlük çıkardıktan sonra. OKT4-pozitif hücreler olarak insan PGCLCs tanımlamak için, 1.5 mililitre düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüp EBs hasat. EB'ler oda sıcaklığında dibe batar ve ortayı atın.EB'leri buz gibi 1X PBS ile durula. PBS'yi çıkardıktan sonra, EB'leri 1 mililitre buz soğuğunda %1 ağırlıkta, PBS'de beş dakika boyunca buzun üzerindeki hacim sodyum aziti ile kuluçkaya yatırın. EB'ler oda sıcaklığında dibe batar.Supernatant attıktan sonra, buz gibi PBS ile EBs durula. Buz üzerinde 200 mikrolitre ekstrasellüler matriks proteini eritin. Proteini EB içeren tüpe ekleyin.Jel katılaştırılı ve EB'ler gömülü olana kadar tüpü oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika bekletin. EB'leri düzeltmek için, tüpe PBS'de 1 mililitre formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hafif sallanan bir kuluçka yakala. Bundan sonra, formaldehit atın ve buz gibi PBS ile bir kez EBs durulamak.% 70 etanol 1 mililitre ekleyin. Bir haftaya kadar 4 santigrat derecede %70 etanol de saklayın veya standart bir FFPE protokolü ile işlemeye devam edin. Hücre yoğunluğu ve her kuyudaki hücrelerin eşit dağılımı kritik tir.Y27632 2 mililitre insan IPSCs altı iyi plaka kuyu başına orta takviye, 24 saat sonra% 20-30 kesişme ulaşmak. MTeSR1 ortamında 24 saatlik ek bir kültürden sonra, Y27632'nin yokluğunda, hücreler biraraya gelip koloniler oluşturmuş ve büyüme alanının yaklaşık %30'una sahiptir. 4i yeniden programlama orta kültür 24 saat sonra, hücreler biraraya ulaştı.4i ortamda ek bir kültür 24 saat sonra, hücreler daha yoğun paketlenmiş oldu. 4i yeniden programlama ortamındaki mikrokuyularda 24 saatlik bir kuluçkadan sonra hücreler, aşılamadan 24 ila 30 saat sonra dairesel konturları ile EB'ler oluşturdular. İnsan PGCLC ortamda tutulan EB'ler, sallanan yapışmaz koşullar altında, 24 saat sonra küresel şekillerini toplamadan korudular.192 saat sonra, EB'ler daha büyüktü ve aynı morfolojiyi korudular. 5 gün sonra, hücreler EBs yüzeyinde hücreleri ifade OCT4 olarak ortaya çıktı, 8 gün sonra sayılarını artırarak. İnsan PGCLCs tek hücreli süspansiyon hücreleri FACS tarafından CD38-pozitif hücreler olarak zenginleştirilmiştir.CD38'i ifade amayan hücreler negatif denetimdi. Kontaminasyonu önlemek için, FACS kapıları CD38-pozitif ve CD38-negatif hücreler geniş bir farkla ayrılmıştır. Bu yordamı çalışırken, onun önemli tam hücre sayımı ve orta değişim zamanlamaları takip etmektir.Bir gün bile orta değişimi atlayarak, ya da herhangi bir adımda bu ortamın hacmini azaltarak, büyük hücre ölümüne neden olabilir. Embriyoid cisimlerin sallanan kültürünün hızı dikkatle optimize edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...