Name: tchip-seq: cell-type-specific epigenome profiling
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling at JoVE.com

Мы благодарим всех членов Ивасаки лаборатории для критических чтении рукописи. Эта работа была частично поддерживается за счет целевых субсидий для научных исследований в инновационных областях (#26113005 с.н. и JP17H05679 с.и.); субсидий для молодых ученых () (JP17H04998 для с.и.) от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии (МПКСНТ); и новаторские проекты всех RIKEN проект «Заболевания и Epigenome «от RIKEN (чтобы с.н. и с.и.) и «Сотовой эволюция».

Все методы, описанные здесь были утверждены отделом безопасности RIKEN (H27-EP071) и проведены с соответствующими руководящими принципами и правилами.
1. рассечение тканей
<ol><li>Вскрыть тканях интерес на мелкие кусочки (примерно < 3 мм2) с помощью тонкой весной ножницы. При...

<ol>
	<li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing.">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).</li><li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution.">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).</li><li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments.">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li><li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+remodeling+and+epigenetics.">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).</li><li>Kidder, B. L., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+library+preparation+for+next-generation+sequencing+analysis+of+genome-wide+epigenetic+and+transcriptional+landscapes+in+embryonic+stem+cells.">Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq.">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645 (2012).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Hornstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-free+ribosome+profiling+of+cell+type-specific+translation+in+the+brain.">Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.</a> Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).</li><li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications.">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).</li><li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+crosslinking:+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes.">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li></ol>

Наш протокол был оптимизирован для нейронов мозга мыши, в котором выражение с тегами Флаг H2B индуцируется тамоксифен инъекции. Промоутеры, используемые для выражения H2B, исходных материалов ткани и количество тканей являются ключевой параметрами для успешной tChIP след Таким образом опт?...

Ткани животных состоят из клеток различных типов. Ген регулирование в каждой ячейке определяет тип ячейки. Chromatin изменения - ДНК метилирования и гистонов модификации - лежат в основе тип ячейки специфика экспрессии генов. Таким образом необходимости измерения эпигеномные регулирования в каждой ячейке тип, но это был технический вызов.
Расследовать эпигенетики в конкретной ячейке тип, секвенирование иммунопреципитации chromatin тандем (tChIP-Seq) был недавно разработанных ()Рисунок 1)1. В tChIP белка гистонов epitope тегами ядро H2B выражается от промоутера определенного типа клеток. Эта функция позволяет изоляции chromatins из клеток интерес, хотя материал начинается из смеси различных типов клеток. Следующие чип-Seq — хроматина очищение через изменение гистона Марк и глубокие секвенирование нового поколения изолированной ДНК — мы можем контролировать эпигеномные статус тип целевой ячейки в геном всей манере.
Используя эту технику, мы недавно исследовали нейрон конкретных trimethylation гистонов H3 белка на лизина 4 (H3K4me3) знаки. В этом исследовании мы разработали стук в мышь, в котором C-неизлечимо флаг тегами H2B белка была выражена при рекомбинации Cre опосредованной (Rosa26ЦАГ floxed ПА H2B-флаг). Путем скрещивания с помощью мыши, имеющих КРР эндоплазматического ретикулума (ER) гена под контролем промотора CamK2a, полученные мыши линии индуцированной H2B-флаг в активных нейронов на тамоксифен инъекций (Camk2aH2B-флаг)1. Начиная от мозга установленной мыши линии, мы провели tChIP-Seq с анти H3K4me3 антител. Так как H3K4me3 знаки часто соответствуют промоутер регионов, мы могли бы обнаружить сотни мРНК, конкретно выражена в нейроны1.
Здесь мы описываем метод типичный tChIP-Seq, который охватывает шаги от рассечение тканей для библиотеки строительных ()Рисунок 1). Конечная цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы поделиться своим передовым опытом для выполнения tChIP-Seq и будущее применение этого метода в другие типы клеток и изменения гистона.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.&#160;0030108132</td>
			<td>For cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.&#160;0030108116</td>
			<td>For ChIP and library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.&#160;0030108051</td>
			<td>For ChIP and library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tube</td>
			<td>BIO-BIK</td>
			<td>3247-00</td>
			<td>For ChIP and library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SK Mill</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>SK-200</td>
			<td>Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bullet</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>SK-100-DLC10</td>
			<td>Accessory of SK Mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL stainless steel tube</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>TK-AM5-SUS</td>
			<td>An option for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL stainless steel tube holder</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>SK-100-TL</td>
			<td>An option for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde (w/v), methanol-free</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28906</td>
			<td>To fix cells. Prepare 1% solution before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17109-35</td>
			<td>Prepare 2.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (-)(1x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>For washing lysate and purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02443-05</td>
			<td>For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl, molecular biology grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06900-14</td>
			<td>For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, molecular biology grade</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>072-04945</td>
			<td>For lysis buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25223-75</td>
			<td>For lysis buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, molecular biology grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-32</td>
			<td>For Lysis buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35406-91</td>
			<td>For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M EGTA pH neutral</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08947-35</td>
			<td>For Lysis Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-24</td>
			<td>To block degradation of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>For cell lysis and washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520130</td>
			<td>Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220 or E220</td>
			<td>To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 10% SDS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15553-027</td>
			<td>For ChIP Elution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30141-14</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115887001</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>054-07225</td>
			<td>Make 70% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>To purify chromatin expressed in cells of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11201D</td>
			<td>This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>301-34811</td>
			<td>Any other antibody that works for ChIP analysis will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Blocking Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>For blocking during affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10727-74</td>
			<td>For blocking during affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>For quantification of isolated DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>For quantification of isolated DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-830</td>
			<td>For quantification by Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25970-56</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>SPRI magnetic beads for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal ice rack</td>
			<td>Funakoshi</td>
			<td>IR-1</td>
			<td>To keep the cell lysate frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Cooler</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T7771S</td>
			<td>Helps fix cells with minimal damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100 Expert Software</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946CA</td>
			<td>Supplied with the Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>To check the quality of the isolated DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA LTP Library Preparation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07961898001</td>
			<td>Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTflex DNA Barcodes</td>
			<td>BIOO Scientific</td>
			<td>NOVA-514101</td>
			<td>Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Real-Time Library Amplification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07959028001</td>
			<td>Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KM2602</td>
			<td>For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>386-well qPCR plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309849</td>
			<td>For real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4485701</td>
			<td>To quantify DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>For real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4306311</td>
			<td>For plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-repair master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 1.4 &#181;L of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 &#181;L of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-taling master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 1 &#181;L of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 &#181;L of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation buffer mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 2 &#181;L of KAPA ligation buffer and 6 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 5 &#181;L of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 &#181;L of PCR Primer Mix (10 &#181;M each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 10 &#181;L of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 &#181;L of PCR Primer Mix, and 0.6 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>IGV_2.3.88</td>
			<td>Genome browser to visualize sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA olgionucleotide: 5&#8242;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>A primer to amplify the promoter region of GAPDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA olgionucleotide: 5&#8242;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>A primer to amplify the promoter region of GAPDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420L</td>
			<td>To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler Dice</td>
			<td>Takara</td>
			<td>TP870</td>
			<td>To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tchip-seq: cell-type-specific epigenome profiling

Эпигеномные регулирование играет центральную роль в экспрессии генов. Поскольку изменения гистона был обнаружен в 1960-х, его физиологических и патологических функции были широко изучены. Действительно появление глубоких секвенирование нового поколения и иммунопреципитации chromatin (чип) через конкретные гистона модификации антитела изменил наш взгляд эпигеномные регулирования через генома. И наоборот тканей, как правило, состоят из типов различных клеток, и их сложные смеси создает аналитические проблемы для расследования epigenome в конкретной ячейке тип. Для решения состояния конкретного типа хроматин клеток в геном всей манере, мы недавно разработали тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), которая основана на выборочной очистки хроматина тегами ядро гистоны из ячейки виды интересов, следуют чип-Seq. Целью настоящего Протокола является внедрение наилучшей практики tChIP-след Эта технология предоставляет универсальный инструмент для epigenome ткани конкретного расследования гистона различных модификаций и модельные организмы.

Здесь мы описываем рассечение тканей, фиксации, лизис клеток, тандем очистки хроматина, и подготовка библиотеки ДНК для следующего поколения секвенсорами. Во время процедур один можно проверить качество ДНК, которая является ключом к успешной виртуализации, на нескол...

Watch this Scientific Journal Video about TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling at JoVE.com

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Мы опишем пошаговое протокол для тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), который позволяет проводить анализ изменения определенного типа клеток геном wide гистонов.

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как, сколько хроматических модификаций регулируются определенным образом типа клетки вместе с геномами. Основным преимуществом этой техники является то, что мы можем изолировать хроматин от целевых клеток, а затем следовать типичным цыган вниз по течению. Таким образом, этот метод может обеспечить понимание нейрона конкретных триминцил, лисинк 4, opisoncilly.Он также может быть применен к другим модификации гистон, другие типы клеток, а затем другие модели организмов. Демонстрацией процедуры будет Мари Мито, техник из моей лаборатории. Для начала используйте тонкие весенние ножницы, чтобы вскрыть ткани интерес на мелкие кусочки.Добавьте фрагменты тканей в чистый контейнер, наполненный жидким азотом. Затем перенесите фрагменты тканей в две миллилитровые трубки, наполненные жидким азотом. Храните трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут с крышкой открытой для испарения жидкого азота.Поместите трубки, содержащие образцы тканей, на охлажденную металлическую ледяную стойку. Затем поместите металлическую пулю в 1,5 миллилитровую трубку и охладите ее жидким азотом. Поместите охлажденную металлическую пулю в одну из пробных трубок.Закройте крышку и установите трубку в трубку держателя криогенной шлифовальной машины. Немедленно окуните собранный держатель трубки в жидкий азот на одну минуту. Вставьте замороженный держатель трубки во внешнюю кассету криогенной шлифовальной машины.И встряхните его энергично в течение 30 секунд, 60 раз. После этого разберите криогенную мясорубку, удалите металлическую пулю. И поместите трубку в предварительно охлажденный кулер образца.Храните кулер при отрицательном 20 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Затем добавьте 900 микролитров 1%формальдегида в трубку и пипетку для смешивания. Перенесите подвеску на новую двухми миллилитровую трубку с 900 микролитров 1%формальдегида.Затем зафиксьте подвеску на 10 минут с нежным вращением при 23 градусах по Цельсию. Чтобы остановить реакцию фиксации, добавьте в трубку 100 микролитров 2,5 молярного глицина. И центрифуга при 3000 раз гравитации в течение пяти минут при четырех градусах цельсия.После этого, отказаться от супер супернатанта. Добавить один миллилитр PBS в трубку и вихрь, чтобы смешать. Центрифуга при 3000 раз гравитации в течение пяти минут при четырех градусах цельсия.Повторите этот шаг мытья, еще два раза. Затем добавьте 500 микролитров буфера лиза один к гранулам и пипетки для смешивания. Центрифуга трубки в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта.Добавьте один миллилитр буфера лиза два гранулы и вихрь, чтобы смешать. Затем центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отбросить супернатант. После этого добавьте 800 микролитров буфера анализа радиодефицита с ингибитором протеазы в гранулы и пипетку для смешивания.Центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта. Затем добавьте в гранулы 500 микролитров буфера RIPA с ингибитором протеазы. Затем центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отбросить супернатант.Добавьте один миллилитр буфера RIPA с коктейлем ингибитора протеазы. Сразу же после добавления буфера RIPA с коктейлем ингибитор протеазы, перенесите лизат в трубку sonicator. И поместите трубку на ультразвуковой.Используя настройки, изложенные в текстовом протоколе, свяйте хроматин. Затем перенесите образец в 1,5 миллилитровую белковую трубку с низким связывающим. И центрифугать его в течение пяти минут при 20 000 раз гравитации при четырех градусах Цельсия.Соберите супернатант из образца и перенесите его в новую белковую трубку с низким связывающим. В этом протоколе было введено и продемонстрировано тандемное секвенирование иммунопреципиентации хроматина. Во время процедуры качество ДНК проверялось на нескольких этапах.Сразу же после звуковой связи, стрижка ДНК была изолирована и протестирована с помощью микрофлюидной электрофорезной машины. После использования анти-FLAG антитела и анти-H3K3me3 антитела для выполнения сродства очистки качества ДНК была проверена снова. Специфика иммунной очистки ДНК на H2B-FLAG была подтверждена отрицательными контрольных пробами.Где было обнаружено незначительное количество ДНК. Далее в протоколе было проверено качество библиотеки секвенирования. Успешные ChIP и T-ChIP были улики с помощью анализа обогащения с использованием грунтовки ориентации промоутер области гена GAPDH.Получены репрезентативные перераспределения по трем генам нейронов. И обогащение читает на пяти основных концах генов нейроном T-ChIP искать на весь мозг T-ChIP искать наблюдалось. После стабилизации, этот метод прокладывает путь для исследователей в эпигенетической области для изучения типа клеток конкретных модификаций гистона в целом широко в нейронах у мышей.Не забывайте, что работа с формальдегидом может быть чрезвычайно опасной и принимать меры предосторожности, такие как ношение резиновой одежды и очков, всегда следует принимать при выполнении этой процедуры.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Антитела профилирования по люциферазы Системы Иммунопреципитация (LIP)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Легкий способ для растений полисом профилирование

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Сотовый тип-специфический Джин Выражение Профилирование в печени мыши

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...