Name: tchip-seq: cell-type-specific epigenome profiling
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling at JoVE.com

Iwasaki laboratuvar şekilde alt alta yazılmalıdır eleştirel okuma için tüm üyeleri teşekkür ediyoruz. Bu eser kısmen yenilikçi alanları (#26113005); S.N. ve JP17H05679 sı için bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir Genç bilim adamları için bir Grant-in-Aid (A) sı için (JP17H04998) Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya (MEXT); ve Pioneering "Hücresel evrim" ve tüm RIKEN proje "Hastalığı ve Epigenome" RIKEN üzerinden (için S.N. ve sı) projeleri.

Burada açıklanan tüm yöntemleri RIKEN (H27-EP071) Emanet bölümü tarafından onaylanmış ve ilgili kurallar ve düzenlemeler yapılmıştır.
1. doku diseksiyon
<ol><li>Küçük parçalar halinde faiz dokuların teşrih (yaklaşık < 3 mm2) güzel bahar makas kullanarak. Not: Daha büyük doku parçaları dondurmak için daha uzun sürer ve daha küçük parçalar arabellek, ikisi de sonuçları etkileyebilecek daha büyük birimleri üzerinde taşıyacak.</li>
	<li>Sıv...

<ol>
	<li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing.">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).</li><li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution.">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).</li><li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments.">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li><li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+remodeling+and+epigenetics.">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).</li><li>Kidder, B. L., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+library+preparation+for+next-generation+sequencing+analysis+of+genome-wide+epigenetic+and+transcriptional+landscapes+in+embryonic+stem+cells.">Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq.">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645 (2012).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Hornstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-free+ribosome+profiling+of+cell+type-specific+translation+in+the+brain.">Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.</a> Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).</li><li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications.">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).</li><li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+crosslinking:+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes.">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li></ol>

Bizim iletişim kuralı H2B bayrak öğesini ifade tamoxifen enjeksiyonu ile indüklenen olduğu fare beynin nöronlar için optimize edildi. H2B ifade, başlangıç doku malzeme ve doku miktarı için kullanılan Rehberleri başarılı tChIP-devamı çok önemli parametreleridir Böylece, bu faktörlerin optimizasyonu ilgi her hücre türü için düşünülmelidir.
Bu protokol için kullanılan yordamlar arasında önemli bir adım 100-500 bp5kromatin uzunluğunu elde...

Hayvan dokuları farklı hücre türleri oluşur. Gen düzenlemesi her hücrede hücre türü tanımlar. Kromatin değişiklikler - DNA metilasyonu ve histon değişikliği - gen ekspresyonu hücre tipi özgüllük altında yatan. Bu nedenle, her hücre tipi epigenetik yönetmelikle ölçülmesi istenen ancak teknik bir mücadele vardı.
Tandem kromatin immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) belirli bir hücreye epigenetik araştırmak için son zamanlarda geliştirilen (resim 1)1yapıldı. TChIP içinde bir hücre türüne özgü organizatörü epitope öğesini çekirdek histon protein H2B ifade edilir. Malzeme çeşitli hücre türlerinin bir karışımını başlar, ancak bu özellik chromatins ilgi, hücrelerden yalıtım sağlar. Aşağıdaki ChIP-Seq — kromatin arınma yolu ile bir değişikliğin histon işareti ve yeni nesil derin sıralama, izole DNA — bir genom geniş şekilde hedeflenen hücre tipi epigenetik durumunu izleyebilirsiniz.
Bu tekniği kullanarak, biz son zamanlarda araştırdık histon H3 protein lizin 4 (H3K4me3), nöron özel trimethylation işaretleri. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir çakma fare hangi C-ölümcül içinde bayrak öğesini H2B protein Cre-aracılı rekombinasyon (Rosa26CAG floxed-pA H2B-bayrak) ifade edildi. Cre-endoplasmic retikulum (ER) gen CamK2a Düzenleyicinin kontrolü altında sahip bir fare ile geçiş tarafından elde edilen fare çizgi üzerine tamoxifen enjeksiyon (Camk2aH2B-bayrak)1aktif nöron H2B-bayrak indüklenen. Kurulan fare çizgi beyinden başlayarak, biz tChIP-Seq anti-H3K4me3 antikor ile gerçekleştirilen. Bu yana H3K4me3 işaretleri çoğunlukla organizatörü bölgelere karşılık, özellikle nöronlar1' ifade mRNA'ların yüzlerce keşfetmek olabilir.
Burada, doku diseksiyon adımlarına Kütüphane inşaat ()Şekil 1)kapsayan bir tipik tChIP-Seq yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı son tChIP-Seq performansını ve diğer hücre tipleri ve histon değişiklikler bu yöntemin uygulama gelecek için bizim en iyi uygulamaları paylaşmak için hedeftir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.&#160;0030108132</td>
			<td>For cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.&#160;0030108116</td>
			<td>For ChIP and library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No.&#160;0030108051</td>
			<td>For ChIP and library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tube</td>
			<td>BIO-BIK</td>
			<td>3247-00</td>
			<td>For ChIP and library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SK Mill</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>SK-200</td>
			<td>Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bullet</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>SK-100-DLC10</td>
			<td>Accessory of SK Mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL stainless steel tube</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>TK-AM5-SUS</td>
			<td>An option for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL stainless steel tube holder</td>
			<td>TOKKEN</td>
			<td>SK-100-TL</td>
			<td>An option for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde (w/v), methanol-free</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28906</td>
			<td>To fix cells. Prepare 1% solution before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17109-35</td>
			<td>Prepare 2.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (-)(1x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>For washing lysate and purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02443-05</td>
			<td>For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl, molecular biology grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06900-14</td>
			<td>For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, molecular biology grade</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>072-04945</td>
			<td>For lysis buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25223-75</td>
			<td>For lysis buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, molecular biology grade</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-32</td>
			<td>For Lysis buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35406-91</td>
			<td>For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M EGTA pH neutral</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08947-35</td>
			<td>For Lysis Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-24</td>
			<td>To block degradation of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>For cell lysis and washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520130</td>
			<td>Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220 or E220</td>
			<td>To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 10% SDS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15553-027</td>
			<td>For ChIP Elution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30141-14</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115887001</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>054-07225</td>
			<td>Make 70% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>To purify chromatin expressed in cells of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11201D</td>
			<td>This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>301-34811</td>
			<td>Any other antibody that works for ChIP analysis will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Blocking Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>For blocking during affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>10727-74</td>
			<td>For blocking during affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>For quantification of isolated DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>For quantification of isolated DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-830</td>
			<td>For quantification by Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25970-56</td>
			<td>To purify DNA from lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>SPRI magnetic beads for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal ice rack</td>
			<td>Funakoshi</td>
			<td>IR-1</td>
			<td>To keep the cell lysate frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Cooler</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T7771S</td>
			<td>Helps fix cells with minimal damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100 Expert Software</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946CA</td>
			<td>Supplied with the Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>To check the quality of the isolated DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA LTP Library Preparation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07961898001</td>
			<td>Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTflex DNA Barcodes</td>
			<td>BIOO Scientific</td>
			<td>NOVA-514101</td>
			<td>Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Real-Time Library Amplification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07959028001</td>
			<td>Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KM2602</td>
			<td>For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>386-well qPCR plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309849</td>
			<td>For real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4485701</td>
			<td>To quantify DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>For real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4306311</td>
			<td>For plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-repair master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 1.4 &#181;L of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 &#181;L of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-taling master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 1 &#181;L of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 &#181;L of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation buffer mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 2 &#181;L of KAPA ligation buffer and 6 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 5 &#181;L of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 &#181;L of PCR Primer Mix (10 &#181;M each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 10 &#181;L of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 &#181;L of PCR Primer Mix, and 0.6 &#181;L of H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>IGV_2.3.88</td>
			<td>Genome browser to visualize sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA olgionucleotide: 5&#8242;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>A primer to amplify the promoter region of GAPDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA olgionucleotide: 5&#8242;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&#8242;</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>A primer to amplify the promoter region of GAPDH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420L</td>
			<td>To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler Dice</td>
			<td>Takara</td>
			<td>TP870</td>
			<td>To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tchip-seq: cell-type-specific epigenome profiling

Epigenetik yönetmelik gen ifadesinde merkezi rol oynar. Histon değişiklik 1960'larda keşfetti, fizyolojik ve patolojik fonksiyonları kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Gerçekten de, yeni nesil derin sıralama ve kromatin immunoprecipitation (ChIP) belirli histon değişiklik antikorlar ile bizim görünümü epigenetik Yönetmeliğin genom arasında devrim yarattı. Diğer taraftan, dokular genellikle farklı hücre türleri oluşur ve onların karmaşık karışımı belirli bir hücreye epigenome soruşturma için analitik sorunlar teşkil etmektedir. Biz son zamanlarda kromatin seçici arıtma tagged çekirdek histon proteinleri hücre tarafından dayanmaktadır tandem kromatin immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq), hücre türüne özgü kromatin devlet bir genom geniş şekilde yönelik olarak geliştirilen faiz, ChIP-Seq. tarafından takip türleri Bu iletişim kuralının amacı tChIP-devamı en iyi uygulamalar giriştir Bu teknik için çeşitli histon modifikasyonları ve model organizmalar doku özel epigenome soruşturma çok yönlü bir araç sağlar.

Burada, tandem arıtma kromatin ve DNA Kütüphane hazırlık yeni nesil sıralayıcılar için doku diseksiyon, fiksasyon, hücre lizis tarif. İşlemler sırasında bir birden çok adımı (resim 2), başarılı sıralama anahtarıdır DNA kalitesini test edebilirsiniz. Bir tek nucleosome genellikle 147 bp DNA 4tarafından çevrili beri yamultulmuş DNA o boyutundan daha kısa olmamalıdır. Hemen ultrasonication sonra DNA izole ve b...

Watch this Scientific Journal Video about TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling at JoVE.com

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Bu yöntem, genomlarla birlikte hücre tipine özgü bir şekilde ne kadar renk modifikasyonlarının düzenlendiği gibi epigenetik alanındaki anahtar soruların yanıtalmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kromatini hedeflenen hücrelerden izole edip tipik çingene akıntısını takip edebilesek. Yani bu yöntem nöron spesifik trimincil, lysinc 4, opisoncilly içine anlayışlar sağlayabilir.Ayrıca diğer histon modifikasyonu, diğer hücre tipleri ve daha sonra diğer model organizmalar uygulanabilir. Prosedürü gösteren Mari Mito, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için, küçük parçalar halinde ilgi doku incelemek için ince bahar makas kullanın.Sıvı nitrojen dolu temiz bir kap için doku parçaları ekleyin. Daha sonra, sıvı nitrojen dolu iki mililitre tüpler doku parçaları aktarın. Tüpleri eksi 80 derecede beş dakika saklayın ve kapağı açık olarak sıvı nitrojeni buharlaştırın.Doku örneklerini içeren tüpleri soğutulmuş metal buz rafına yerleştirin. Sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp içine metal bir mermi yerleştirin ve sıvı nitrojen ile soğutun. Soğutulmuş metal mermiyi numune tüplerinden birine yerleştirin.Kapağı kapatın ve tüpü kriyojenik öğütücünün tüp tutucusu içine yerleştirin. Hemen, bir dakika için sıvı nitrojen monte tüp tutucu daldırma. Donmuş tüp tutucuyu kriyojenik öğütücünün dış kasetine takın.Ve 30 saniye, 60 kez şiddetle sallayın. Bundan sonra, kriyojenik öğütücü sökmek, metal mermi kaldırın. Ve tüpü önceden soğutulmuş bir numune soğutucusuna yerleştirin.Soğutucuyu 20 derecede 15 dakika saklayın. Daha sonra, tüp ve pipet karıştırmak için% 1 formaldehit 900 mikrolitre ekleyin. Süspansiyonu 900 mikrolitre %1 formaldehit içeren yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın.Daha sonra, 23 santigrat derecede hafif bir dönüş ile 10 dakika süspansiyon düzeltmek. Fiksasyon reaksiyonunu durdurmak için, tüpe 2,5 molar glisin 100 mikrolitre ekleyin. Ve santrifüj 3,000 kat yerçekimi için dört santigrat derecede beş dakika.Bundan sonra, süper supernatant atın. Karıştırmak için tüp ve girdap için PBS bir mililitre ekleyin. Santrifüj 3,000 kat yerçekimi nde beş dakika boyunca dört santigrat derecede.Bu yıkama adımLarını iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, karıştırmak için pelet ve pipet için lysis tampon bir 500 mikrolitre ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 3,000 kat yerçekimini 4 santigrat derecede niçin santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Karıştırmak için pelet ve girdap bir mililitre lysis tampon iki ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, karıştırmak için pelet ve pipet proteaz inhibitörü kokteyl ile radyo immünopremasyon asssay tampon 800 mikrolitre ekleyin.Süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Daha sonra, pelet proteaz inhibitörü kokteyl ile RIPA tampon 500 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 3,000 kat yerçekiminde beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Proteaz inhibitörü kokteyli ile bir mililitre RIPA tampon ekleyin. Proteaz inhibitörü kokteyli ile RIPA tamponu ekledikten hemen sonra, bir sonicator tüpü ne lysate aktarın. Ve tüpü ultrasonatöre yerleştirin.Metin protokolünde belirtilen ayarları kullanarak kromatini yayı. Daha sonra, 1.5 mililitre protein düşük bağlayıcı tüp örnek aktarın. Ve 20,000 kat daha fazla yer çekiminde dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Örnekten süpernatant toplayın ve yeni bir protein düşük bağlayıcı tüp aktarın. Bu protokolde tandem kromatin immünopresipitasyon dizilimi tanıtıldı ve gösterilmiştir. İşlem sırasında DNA'nın kalitesi birden fazla adımda test edildi.Sonication hemen sonra, yığılmış DNA izole edildi ve mikroakışkan elektroforez makinesi ile test edildi. Afinite saflaştırma yapmak için anti-FLAG antikor ve anti-H3K3me3 antikor kullanılarak DNA kalitesi tekrar kontrol edildi. H2B-FLAG'de DNA'nın immün arınma özgüllüğü negatif kontrol örnekleri ile doğrulandı.Önemsiz miktarda DNA tespit edildiği yer. Protokolün devamında, sıralama kitaplığı kalitesi doğrulandı. Başarılı ChIP ve T-ChIP, GAPDH geninin promotör bölgesini hedefleyen astarlar kullanılarak zenginleştirme analizi ile kanıtlanmıştır.Üç nöron geni boyunca temsili yeniden dağılımlar elde edildi. Ve tüm beyin T-ChIP arama nöron T-ChIP arama tarafından genlerin beş asal ucunda okuma zenginleştirme gözlenmiştir. Bir stabilite sonra, bu teknik farelerde nöronlarda yaygın olarak hücre tipi özel histon modifikasyonu keşfetmek için epigenetik alanda araştırmacılar için önünü açıyor.Formaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi yaparken her zaman lastik giysi ve gözlük takmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Antikor Profil Lusiferaz Immunoprecipitation Sistemleri (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...