Name: modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00
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这项工作得到芬兰文化基金会、坦佩雷结核病基金会 (M.V.、M.M.H.、宪兵)、芬兰抗结核协会 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen säätiö) 基金会的支持。M.M.H.、宪兵)、西格丽德 jusélius 基金会 (mp)、埃米尔 Aaltonen 基金会 (M.M.H.)、简和 Aatos Erkko 基金会 (mp) 和芬兰科学院 (mp)。琳娜 mäkinen, 汉娜-琳娜卡里和珍娜 ilomäki 被承认为他们的技术援助。作者承认坦佩雷斑马鱼实验室为他们的服务。

所有斑马鱼实验都已获得芬兰动物实验委员会 (ESAVI/8245/04.10.07/2015) 的批准。方法是根据《法令》 (497/2013) 和政府关于保护在芬兰用于科学或教育目的的动物的法令 (564/2013) 执行的。
1. marinum 分枝杆菌的培养
注: 由于 marinum 分枝杆菌是一种能够引起人类表面感染的病原体, 在开始与这种细菌合作之前, 找出当地的人身安全和生物危害废物处置指南。
...

这里我们描述了一个基于 qPCR 的应用来测量从实验感染的成年斑马鱼组织中提取的 DNA 结核杆菌负载。这个应用是基于引物设计围绕十六年代-二十三年代 rRNA 内部转录间隔序列40。用从已知数量的培养的分枝杆菌中提取的 DNA 制备的标准曲线估计鱼类样品中的总结核杆菌负荷, 并假设某一细菌在任何特定时刻都有一份其基因组副本。m. marinum-qPCR 的检测限为约100个菌落形成单...

斑马鱼 (斑马斑马) 是生物医学研究中广泛使用的动物模型, 是常见脊椎动物生物学的公认模型。斑马鱼已经适应了许多领域的研究模拟人类疾病和疾病, 从癌症1和心脏病2到感染和免疫学研究的几个细菌3和病毒感染4,5. 此外, 斑马鱼胚胎的前子宫发育使斑马鱼成为发育生物学6和毒理学7,8的流行模式。
在许多研究领域, 包括感染生物学, 通常使用光学透明斑马鱼幼虫。第一个免疫细胞出现在 24 h 后受精 (hpf), 当原始巨噬细胞被检测到9。中性粒细胞是下一个免疫细胞, 出现在 33 hpf10左右。因此, 斑马鱼幼虫是可行的研究早期感染阶段和先天免疫的作用, 在缺乏自适应免疫细胞11。然而, 成年斑马鱼具有完全功能的适应性免疫系统, 为感染实验提供了额外的复杂性层。T 细胞可以检测到3天后受精12, B 细胞能够产生功能性抗体4周后受精13。成年斑马鱼拥有哺乳动物先天和适应性免疫系统的所有主要对应物。在抗体 isotypes 和淋巴组织解剖中发现了鱼类和人类免疫系统的主要区别。斑马鱼只有三抗体类14, 而人类有五15。在缺乏骨髓和淋巴结的情况下, 鱼的主要淋巴器官是肾脏和胸腺16和脾脏、肾脏和肠道作为次要淋巴器官17。尽管有这些差异, 其完全免疫武库的先天和自适应细胞, 成年斑马鱼是一个高度适用, 易于使用, 非哺乳动物模型的寄主-病原体相互作用的研究。
斑马鱼最近被建立了作为一个可行的模型研究结核病18,19,20,21,22。肺结核是由结核分枝杆菌引起的一种机载疾病。根据世界卫生组织的数据, 结核病在2016年造成1.7人死亡, 是全球23个单一病原体的主要死因。老鼠24、25、兔子26和非人类灵长类27是结核病研究中最著名的动物模型, 但它们都面临着局限性。结核菌感染的非人类灵长类模型最接近人类疾病, 但由于严重的伦理考虑, 使用这种模式是有限的。其他动物模型受到 m. 型结核病宿主特异性的阻碍, 影响到疾病病理学。结核病建模的最大问题可能是人类疾病中广泛的感染和疾病结果: 结核病是一种非常异构的疾病, 从杀菌免疫到潜在的、活跃的和重新激活的感染28, 这可能很难重现和实验模型。
marinum 分枝杆菌是 m.结核的近亲, 有3000同源蛋白, 85% 的氨基酸标识29。m. marinum自然感染斑马鱼生产肉芽肿, 肺结核的标志, 在其内脏 19,30。与其他用于结核病研究的动物模型不同, 斑马鱼生产许多后代, 它只需要有限的空间, 重要的是, 它是 neurophysiologically 最不发达的脊椎动物结核模型。此外, m marinum感染导致潜伏感染, 积极的疾病, 甚至杀菌的结核杆菌感染的成年斑马鱼密切模仿疾病的结果, 人类结核病19,31,32. 在这里, 我们描述了成人斑马鱼的实验性结核模型的方法, 注射m. marinum入腹腔, 并利用定量 PCR 测量斑马鱼的结核杆菌负荷和免疫应答组织样本。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

结核分枝杆菌是目前最致命的人类病原体, 每年造成170万人死亡和1040万次感染。接触这种细菌会引起人类广泛的疾病谱, 从消毒感染到积极进步的致命疾病不等。最常见的形式是潜在的肺结核, 这是无症状的, 但有可能重新激活为暴发性疾病。成年斑马鱼及其天然病原体marinum 分枝杆菌最近被证明是研究结核病广泛疾病谱的适用模型。重要的是, 该模型可以研究结核杆菌感染背景下的自发潜伏期和重新激活以及适应性免疫反应。本文介绍了成年斑马鱼实验性感染的方法, 收集了用于提取核酸的结核杆菌负荷测定和宿主免疫应答的体内器官。在内部开发的, m. marinum特异性 qPCR 检测比传统的电镀方法更敏感, 因为它也检测非分裂, 休眠或最近死的分枝杆菌的 DNA。由于 DNA 和 RNA 都是从同一个体中提取出来的, 因此可以研究患病状态与寄主和病原体基因表达之间的关系。因此, 成年斑马鱼的结核病模型作为一种高度适用的非哺乳动物体内系统来研究寄主-病原体的相互作用。

天然鱼类病原杆菌 marinum感染斑马鱼的内脏, 并产生全身性感染, 组织学可见肉芽肿19。成年斑马鱼通过腹腔注射感染m marinum 。用 dna 作为模板, 提取 dna 和 RNA, 用定量聚合酶链反应 (qPCR) 测定结核杆菌负荷。方法的轮廓如图 1所示。
最初用于感染鱼的分枝杆菌数量是感染结果?...

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Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

在这里, 我们提出了一个在成年斑马鱼使用其天然致病菌分枝杆菌 marinum的人结核病模型的协议。从被感染的斑马鱼内脏中提取的 DNA 和 RNA 可以用来揭示鱼的总结核杆菌负荷和宿主对 qPCR 的免疫应答。

marinum 分枝杆菌感染成人斑马鱼结核的建模

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

这种方法可以帮助回答结核病领域关键问题，如适应性免疫反应的作用和这种多因素疾病的发病机制。这种核酸碱法的主要优点是，细菌载荷和基因表达水平都可以从同一个人中测量。要开始此过程，在文本协议中概述的 7H10 板上培养 M.marinum。将含有ADC浓缩、多糖80和甘油的7H9介质的10毫升转移到细胞培养瓶中。然后，使用无菌的一微升接种循环无菌地将一个循环的M.marinum细菌质量转移到烧瓶中。松开盖子或使用滤网盖，使气体在29摄氏度的黑暗中有足够的气体交换和培养，在三到四天内不摇晃，直到OD600达到0.7左右。稀释并继续培养在文本中概述的细菌。要开始准备细菌溶液的感染，转移一毫升培养成一个新的管。在10，000克的离心机，三分钟。取出上一杯，将颗粒重新在一毫升无菌PBS中。使用无菌PBS与0.3毫克每毫升苯酚红色作为示踪剂，稀释悬浮液，以达到所需的细菌浓度。在此之后，使用一毫升注射器缓慢拉吊架通过27量针三次。在使用每个等分项之前执行此步骤。首先，将稀释的细菌溶液的五微升液滴移液到一块石蜡薄膜上。然后，将液滴拉入30量量胰岛素针中。使用五到八个月大的鱼进行这个实验，其中一种是野生鱼，另一种是抹布突变鱼。将这些鱼的腹侧向上放置在一块潮湿的发泡塑料的缝隙中。以 45 度角在骨盆鳍之间注射胰岛素针。保持针头向上打开，以确保整个开口位于腹腔内。然后，慢慢注射细菌溶液。在此之后，小心地取出针头，并立即将鱼转移到装满新鲜水箱水的回收罐中。每 15 分钟在 7H10 板上从使用的细菌等分中采集一次样品。在29摄氏度下孵育这些样本5天，以验证感染剂量。定期检查鱼的健康，确保任何有感染症状的鱼通过在水中用超过0.02%的3-氨基苯甲酸乙酯孵育它们来安乐死。对鱼进行安乐死后，将针后插入枝条。通过尾巴插入第二个针，将鱼钉在平台上。使用手术刀，打开整个腹腔。然后，用小勺子和锋利的钳子收集从心脏开始，沿着脊柱向尾巴工作的内部器官，将所有内脏器官分离在一个方块中。使用钳子将肠网从丁香中分离出来，将器官转移到含有半打 2.8 毫米陶瓷珠的 1.5 毫升均质管中。立即将管子放在干冰上以冷冻样品。将样品储存在负80摄氏度，直到准备好均质。提取DNA和RNA后，按文本协议中概述的定量PCR测量分枝杆菌载荷。在这项研究中，成年斑马鱼通过内皮内注射感染了M.marinum。高感染剂量被认为会导致一种渐进性疾病，其中分枝杆菌负荷继续增加，直到平均负荷达到约500万细菌最终杀死鱼。另一方面，低剂量导致疾病谱的发展，类似于在人类结核病中出现渐进、潜伏、重新激活和绝育感染的疾病谱。在这种情况下，负载继续增加四个星期后，疾病达到稳定状态，在大部分鱼。这一数据表明，用于感染鱼类的分枝杆菌的初始数量是感染结果的关键决定因素。拉格突变斑马鱼被认为不能充分限制分枝杆菌的生长，导致更高的细菌负荷和更高的发病率。这清楚地表明了适应性免疫在控制分枝杆菌感染方面的重要性。白细胞-4的含量在野生类型组中要高得多，表明有效引入白细胞素-4需要适应性反应，但在分枝杆菌感染后引入干扰素伽马是可有可无的。该协议允许从同一样本中采集DNA和RNA，从而有可能将样品的分枝杆菌负担与宿主和细菌的基因表达数据相结合。这种技术可以与药物或候选疫苗的给药相结合，以评估其对分枝杆菌负荷和免疫反应的影响。在尝试此程序时，在使用生物安全二级病原体时，必须记住遵循当地关于人身安全和废物处理的准则。这项技术使得研究在斑马鱼中具有休眠分枝杆菌的活性结核病和潜伏性结核病成为可能，斑马鱼是一种合乎道德的非哺乳动物体内模型。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

样品制备<em&gt;结核分枝杆菌</em提取物对核磁共振的代谢组学研究

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

科研

免疫与感染

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

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增长结核分枝杆菌生物膜

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

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实验模型后的自然传播到研究结核病，疟疾混合感染结核分枝杆菌和伯氏疟原虫</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

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展现着多药耐药<em&gt;结核分枝杆菌</em&gt;扩增基因芯片

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

建立和高通量安装程序研究优化<em&gt;表皮葡萄球菌</em&gt;和<em&gt;分枝杆菌</em&gt;感染作为模型药物发现

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

造型粘膜念珠菌在斑马鱼幼虫通过鳔注射

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

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关于功能研究的三维人体肺组织模型<em&gt;结核分枝杆菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

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破译和成像发病机制与盘带<em&gt;脓肿分枝杆菌</em&gt;斑马鱼胚胎

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

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系统抑制剂靶向细胞内的疗效和毒性筛选<em&gt;结核分枝杆菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

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高通量兼容检测，以评估对巨噬细胞传代药物疗效<em&gt;结核分枝杆菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...