Name: modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish at JoVE.com

Dette arbejde er blevet støttet af den finske kulturelle fundament (HL), Tampere tuberkulose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), grundlaget for den finske Anti-tuberkulose Association (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane og Aatos Erkko Foundation (M.P.) og Finlands Akademi (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo og Jenna Ilomäki er anerkendt for deres tekniske bistand. Forfatterne anerkender Tampere zebrafisk laboratorium for deres service.

Alle zebrafisk eksperimenter er blevet godkendt af dyr eksperiment bestyrelsen i Finland (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metoder er udført efter loven (497/2013) og regeringsbekendtgørelse (564/2013) om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige eller uddannelsesformål i Finland.
1. dyrkning af Mycobacterium marinum
Bemærk: Da Mycobacterium marinum er en patogen kan forårsage overfladiske infektioner hos mennesker, finde ud af de lokale retningslinj...

Her beskriver vi en qPCR-baseret program til at måle mykobakterielle belastninger fra DNA ekstraheret fra eksperimentelt inficerede voksne zebrafisk væv. Dette program er baseret på primere designet omkring 16S-23S rRNA interne transskriberede spacer sekvens40. Den totale mykobakterielle belastning i en fisk prøve anslås ved hjælp af en standardkurve, der er fremstillet af DNA ekstraheret fra et kendt antal kulturperler mykobakterier og under forudsætning af at en bakterie har en kopi af de...

Zebrafisk (Danio rerio) er et udbredt dyremodel i biomedicinsk forskning, og det er en accepteret model for fælles hvirveldyr biologi. For zebrafisk er blevet tilpasset til mange forskningsområder modellering menneskelige sygdomme og lidelser lige fra kræft1 og hjertesygdom2 til infektion og immunologiske undersøgelser af flere bakterielle 3 og virusinfektioner4 , 5. Derudover ex utero udviklingen af zebrafisk embryoner har gjort zebrafisk en populær model i udviklingsmæssige biologi6 og toksikologi7,8.
I mange områder af forskning, herunder infektion biologi, er optisk gennemsigtig zebrafisk larver almindeligt anvendt. De første immunceller vises inden for 24 timer post befrugtning (hpf), når primitive makrofager er opdaget9. Neutrofiler er de næste immunceller at dukke op omkring 33 hpf10. Zebrafisk larver er således muligt for at studere de tidlige stadier af infektion og rollen af medfødt immunitet i mangel af adaptive immunceller11. Men de voksne zebrafisk med sit fuldt funktionel adaptive immunsystem giver et ekstra lag af kompleksitet til infektion eksperimenter. T-celler kan påvises omkring 3 dage efter befrugtningen12, og B-celler er i stand til at producere funktionelle antistoffer ved 4 uger post befrugtning13. Den voksne zebrafisk har alle de vigtigste modstykker af de pattedyr medfødte og adaptive immunsystem. De væsentligste forskelle mellem immune systems af fisk og mennesker er fundet i antistof isotypes såvel som i anatomi af lymfoide væv. For zebrafisk har kun tre antistof klasser14, der henviser til, at mennesker har fem15. I mangel af knoglemarven og lymfeknuderne, den primære lymfoide organer i fisk nyre og thymus16 og milten, nyrerne og tarmen tjene som sekundære lymfoide organer17. Trods disse forskelle, med dens fulde immun arsenal af medfødte og adaptive celler, er de voksne zebrafisk en yderst relevant, nem at bruge, ikke-pattedyr model for vært-patogen interaktion undersøgelser.
For zebrafisk er sidst blevet etableret som en mulig model til at studere tuberkulose18,19,20,21,22. Tuberkulose er en luftbåren sygdom forårsaget af Mycobacterium tuberkulose. Ifølge World Health Organization, tuberkulose forårsaget1,7 million dødsfald i 2016 og er den hyppigste årsag til død af en enkelt patogen verdensomspændende23. Mus24,25, kaniner26 og ikke-menneskelige primater27 er det mest kendte dyr modeller i tuberkulose forskning men hvert ansigt deres begrænsninger. Primat model af M. tuberkulose -infektion ligner den menneskelige sygdom mest tæt, men ved hjælp af denne model er begrænset på grund af alvorlige etiske overvejelser. Andre animalske modeller er hæmmet af værtsspecificitet M. tuberkulose , der påvirker sygdommen patologi. Sandsynligvis det største problem i modellering tuberkulose er den bredt spektrum af infektion og sygdom resultater i den menneskelige sygdomme: tuberkulose er en meget heterogen sygdom spænder fra sterilisering immunitet til latente, aktive og reaktiveret infektion28 , som kan være svært at reproducere og model eksperimentelt.
Mycobacterium marinum er en nær slægtning af M. tuberkulose med ~ 3.000 orthologous proteiner med 85% aminosyre identitet29. M. marinum inficerer naturligt zebrafisk producerer granulomer, kendetegnende for tuberkulose, i sit indre organer19,30. I modsætning til andre animalske modeller anvendes i tuberkulose forskning, zebrafisk producerer mange afkom, det kræver kun en begrænset plads og vigtigst, det er neurophysiologically de mindst udviklede hvirveldyr tuberkulose model tilgængelig. Derudover forårsager M. marinum infektion latent infektion, aktiv sygdom eller endda Sterilisation af mykobakterielle infektion i voksen zebrafisk nøje efterligne spektrum af sygdom resultater af menneskelig tuberkulose19, 31 , 32. her, vi beskriver metoder til den eksperimentelle tuberkulose model af voksne zebrafisk ved at indsprøjte M. marinum ind i bughulen og bruge kvantitativ PCR til at måle mykobakterielle belastninger og immunrespons fra zebrafisk vævsprøver.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

Mycobacterium tuberkulose er i øjeblikket den dødeligste menneskelige patogen forårsager 1,7 millioner dødsfald og 10,4 millioner infektioner hvert år. Eksponering for denne bakterie forårsager en bred sygdom spektrum i mennesker lige fra en steriliseret infektion til et aktivt fremadskridende dødelig sygdom. Den mest almindelige form er den latent tuberkulose, som er asymptomatiske, men har potentiale til at genaktivere i et fulminant sygdom. Voksen zebrafisk og dens naturlige patogen Mycobacterium marinum har for nylig vist sig for at være en relevant model til at studere det brede sygdom spektrum af tuberkulose. Vigtigere, kan spontane ventetid samt reaktivering og adaptive immunrespons i forbindelse med mykobakterielle infektion studeres i denne model. I denne artikel vil beskrive vi metoder for eksperimentel infektion af voksen zebrafisk, indsamling af indre organer til udvinding af nukleinsyrer til måling af mykobakterielle belastninger og vært immunrespons ved kvantitativ PCR. Den i in-House udviklede, M. marinum -specifikke qPCR analyse er mere følsomme end de traditionelle plating metoder som det registrerer også DNA fra ikke-dividere, sovende eller for nylig døde mykobakterier. Som både DNA og RNA er udvundet fra den samme person, er det muligt at studere forholdet mellem den syge stat og vært og patogen genekspressionen. Voksen zebrafisk model for tuberkulose dermed præsenterer sig selv som en yderst relevant, ikke-pattedyr i vivo system at studere vært-patogen interaktioner.

Naturlige fisk patogen Mycobacterium marinum inficerer de indre organer hos zebrafisk og producerer en systemisk infektion med histologisk synlige granulomer19. Voksen zebrafisk er inficeret med M. marinum ved en intraperitoneal injektion. DNA og RNA er udvundet, og mykobakterielle belastningen måles ved kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) ved hjælp af DNA som skabelon. Omridset af metoden, der er vist i figur 1</s...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish at JoVE.com

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Vi præsenterer her, en protokol til model menneskelige tuberkulose i en voksen zebrafisk ved hjælp af dens naturlige patogen Mycobacterium marinum. Ekstraherede DNA og RNA fra de indre organer hos inficerede zebrafisk kan bruges til at afsløre alt mykobakterielle belastninger i fisk og værtens immunrespons med qPCR.

Modellering tuberkulose i Mycobacterium marinum inficeret voksen zebrafisk

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål inden for tuberkulose, såsom hvad er den rolle adaptive immunrespons og patogenesen af denne multifaktorielle sygdom. Den største fordel ved denne nukleinsyrebasemetode er, at både bakteriebelastninger og genekspressionsniveauer kan måles fra samme person. For at begynde denne procedure, kultur M.marinum på en 7H10 plade som skitseret i teksten protokol.10 milliliter 7H9-medium indeholdende ADC-tilsætning, polysorbat 80 og glycerol overføres til en cellekulturkolbe. Brug derefter en steril en mikroliters inokuleringssløjfe til aseptisk at overføre en loopful af M.marinum bakteriemassen ind i kolben. Lad hætten være løs eller bruge en filterhætte for at give mulighed for tilstrækkelig gasudveksling og kultur ved 29 grader Celsius i mørke uden at ryste i tre til fire dage, indtil OD600 når omkring 0,7.Fortynd og fortsætte med at dyrke bakterierne som beskrevet i teksten. For at begynde at forberede den bakterielle løsning til infektion, overføre en milliliter af kulturen i et frisk rør. Centrifuge ved 10.000 g i tre minutter.Fjern supernatanten, og opslæm pellets igen i en milliliter steril PBS. Brug sterile PBS med en 0,3 milligram per milliliter phenol rød som en sporstof, fortyndes suspensionen for at nå den ønskede bakteriekoncentration. Derefter skal du bruge en 1 millilitersprøjte til langsomt at trække suspensionen gennem en 27 gauge nål tre gange.Udfør dette trin lige før brug for hver aliquot. Først pipette en fem mikroliter dråbe af den fortyndede bakterielle opløsning på et stykke paraffin film. Træk derefter dråben ind i en 30 gauge insulinnål.Brug en fem til otte måneder gammel fisk til dette eksperiment med den ene er en vild type fisk og den anden er en klud mutant fisk. Placer disse fisk ventrale side op i slidser af et stykke fugtigt opskummet plast. Injicer insulinnålen mellem bækkenfinnerne i en vinkel på 45 grader.Hold nåleåbningen opad for at sikre, at hele åbningen er inde i bughulen. Derefter langsomt injicere bakteriel opløsning. Derefter fjernes nålen forsigtigt, og fisken overføres straks til en bjærgningstank fyldt med frisk tankvand.Tag prøver fra den bakterielle aliquot i brug hvert 15. Inkuber disse prøver ved 29 grader Celsius i fem dage for at kontrollere infektionsdosis. Kontroller fiskens velbefindende regelmæssigt, og sørg for at aflive alle fisk med infektion symptomer ved at inkubere dem i vand med mere end 0,02% af 3-aminobenzosyre ethylester.Efter aflive fisken, indsætte en pin posterior til branchiostegal stråler. Indsæt en anden pin gennem halen for at tack fisken på platformen. Ved hjælp af en skalpel, åbne hele bughulen.Brug derefter en lille ske og skarp-ended pincet til at indsamle de indre organer starter ved hjertet og arbejder langs rygsøjlen mod halen til at frigøre alle de indre organer i en blok. Brug pincet til at frigøre tarmnettet fra cloaca og overføre organerne i et 1,5 milliliter homogeniseringsrør, der indeholder et halvt dusin 2,8 millimeter keramiske perler. Rørret straks på tøris for at fryse prøven.Prøven opbevares ved negative 80 grader Celsius, indtil den er klar til at homogenisere. Efter udpakning af DNA og RNA måles mykobakterielle belastninger ved kvantitativ PCR som beskrevet i tekstprotokollen. I denne undersøgelse, voksne zebrafisk er inficeret med M.marinum af en intraperitoneal injektion.En høj infektion dosis ses at føre til en progressiv sygdom, hvor mycobakterielle belastning fortsætter med at stige, indtil den gennemsnitlige belastning når omkring fem millioner bakterier i sidste ende dræbe fisk. En lav dosis på den anden side fører til udvikling af en sygdom spektrum svarende til den, der ses i human tuberkulose med progressiv, latent, reaktiveret, og steriliserede infektioner. I dette tilfælde fortsætter belastningen med at stige i fire uger, hvorefter sygdommen når en stabil tilstand i størstedelen af fisken.Disse data afslører, at det oprindelige antal mycobakterier, der anvendes til at inficere fisken, er en afgørende faktor for resultatet af infektionen. Rag mutant zebrafisk ses at være ude af stand til tilstrækkeligt at begrænse væksten af mycobakterier fører til højere bakterielle belastninger og øget sygelighed. Dette viser klart betydningen af adaptive immunitet i at kontrollere mykobakterielle infektion.Niveauerne af interleukin-4 er betydeligt højere i den vilde type gruppe afslører, at adaptive respons er nødvendig for en effektiv indførelse af interleukin-4, men undværes til indførelse af interferon gamma efter mykobakteriel infektion. Denne protokol gør det muligt at indsamle både DNA og RNA fra den samme prøve, hvilket gør det muligt at kombinere prøvens mycobakterielle byrde med genudfoldelsesdata for både værten og bakterierne. Denne teknik kan kombineres med administration af lægemidler eller vaccine kandidater til at vurdere deres virkning på mykobakterielle belastninger og immunrespons.Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at følge de lokale retningslinjer for personlig sikkerhed og bortskaffelse af affald, når der arbejdes med et biosikkerhedsniveau 2-patogen. Denne teknik gør det muligt at studere både aktiv og latent tuberkulose med hvilende mycobakterier i zebrafisken, som er en etisk ikke-pattedyr in vivo model.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vækst af Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentel model til at studere tuberkulose-Malaria coinfektion på Natural Transmission af Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstration af en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Forstærkning Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimering af en High Throughput Setup til at studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modeling Mucosal Candidiasis i Larve Zebrafisk af swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Menneskelig Lung Tissue Model for Funktionelle Undersøgelser om<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektion

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Dechifrere og Imaging Patogenese og Cording af<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I zebrafisk embryoner

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System til Effekt og cytotoksicitet Screening af inhibitorer Målretning Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

En High-throughput Kompatibel Assay at evaluere Drug Effekt mod makrofag passeres<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...