Name: modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal finlandese Cultural Foundation (H.L.), Tampere tubercolosi Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fondazione dell'associazione anti-tubercolosi finlandese (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane e Aatos Erkko Foundation (M.P.) e Accademia di Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki sono riconosciuti per la loro assistenza tecnica. Gli autori riconoscono il laboratorio di Zebrafish Tampere per il loro servizio.

Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dal comitato di esperimento animale in Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metodi vengono eseguite secondo la legge (497/2013) e il decreto del governo (564/2013) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici o educativi in Finlandia.
1. coltura di Mycobacterium marinum
Nota: Poiché il marinum del micobatterio è un agente patogeno in grado di causare infezioni superficiali in esseri um...

Qui descriviamo un'applicazione basata su qPCR per misurare micobatteriche carichi da DNA Estratto da tessuti infettati sperimentalmente zebrafish adulto. Questa applicazione è basata su primer disegnati intorno ai 16S-23S rRNA distanziatore interno trascritto sequenza40. Il carico totale micobatterico in un campione di pesce è stimato utilizzando una curva standard preparata dal DNA Estratto da un numero noto di micobatteri coltivati e supponendo che un batterio ha una copia del suo genoma in u...

Zebrafish (Danio rerio) è un modello animale ampiamente usato nella ricerca biomedica ed è un modello per la biologia dei vertebrati comune accettato. Zebrafish è stato adattato a molti campi di ricerca malattie umane di modellazione e disturbi che vanno da cancro1 e malattia cardiaca2 infezione e studi immunologici di diversi batteri 3 e infezioni virali4 , 5. Inoltre, lo sviluppo di ex utero degli embrioni di zebrafish ha reso zebrafish un modello popolare in biologia dello sviluppo6 e tossicologia7,8.
In molti campi della ricerca, tra cui biologia di infezione, le larve di zebrafish otticamente trasparenti sono comunemente usate. Le prime cellule immuni vengono visualizzati all'interno di fertilizzazione di 24h post (hpf), quando i macrofagi primitivi sono rilevati9. I neutrofili sono le cellule immunitarie prossime a comparire circa 33 hpf10. Larve di zebrafish sono dunque fattibile per lo studio delle prime fasi di infezione e il ruolo dell'immunità innata in assenza di cellule del sistema immunitario adattativo11. Tuttavia, zebrafish adulto con il suo sistema immunitario adattativo completamente funzionale fornisce un ulteriore livello di complessità per gli esperimenti di infezione. Le cellule di T possono essere rilevate intorno 3 giorni dopo la fecondazione12, e le cellule B sono in grado di produrre anticorpi funzionali da 4 settimane post fertilizzazione13. Zebrafish adulto ha tutte le controparti principali del sistema immunitario innato e adattivo dei mammiferi. Le principali differenze tra la immune systems di pesce e gli esseri umani si trovano in isotipi di anticorpo pure come l'anatomia dei tessuti linfoidi. Zebrafish ha anticorpi solo tre classi14, mentre gli esseri umani hanno cinque15. In assenza di midollo osseo e nei linfonodi, organi linfoidi primari nel pesce sono il rene e il timo16 e la milza, il rene e l'intestino servono come organi linfoidi secondari17. Nonostante queste differenze, con il suo arsenale completo sistema immunitario delle cellule innate e adattive, zebrafish adulto è un modello altamente applicabile, easy-to-use, non mammiferi per studi di interazione ospite-patogeno.
Zebrafish ultimamente è stato stabilito come un possibile modello per studiare la tubercolosi18,19,20,21,22. La tubercolosi è una malattia airborne causata dalla tubercolosi del Mycobacterium. Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, la tubercolosi ha causato1.7 milione morti nel 2016 ed è la principale causa di morte da un singolo agente patogeno in tutto il mondo23. Topi24,25, conigli26 e27 di primati non umani sono che l'animale più noto modelli nella ricerca di tubercolosi ma ogni faccia loro limitazioni. Il modello di primate non umano dell'infezione di tubercolosi del M. è simile alla malattia umana più strettamente, ma utilizzando questo modello è limitato a causa di gravi considerazioni etiche. Altri modelli animali sono ostacolati dalla specificità dell'ospite-di M. tuberculosis che colpisce la patologia di malattia. Probabilmente il problema più grande nel modellare la tubercolosi è l'ampio spettro di esiti di infezione e malattia nella malattia umana: la tubercolosi è una malattia molto eterogenea, che vanno da sterilizzare l'immunità all'infezione latente, attiva e riattivato28 , che può essere difficile da riprodurre e modello sperimentalmente.
Mycobacterium marinum è un parente stretto di M. tuberculosis con proteine orthologous ~ 3.000 con 85% dell'amminoacido identità29. M. marinum infetta naturalmente zebrafish producendo granulomi, i tratti distintivi della tubercolosi, nei suoi organi interni19,30. A differenza di altri modelli animali utilizzati nella ricerca di tubercolosi, zebrafish produce molti figli, richiede solo uno spazio limitato e d'importanza, neurophysiologically è il modello di tubercolosi vertebrati meno sviluppato disponibile. Inoltre, l'infezione di M. marinum provoca infezione latente, malattia attiva o anche sterilizzazione dell'infezione micobatterica in zebrafish adulto che imita molto attentamente lo spettro di risultati di malattia di tubercolosi umana19, 31 , 32. qui, descriviamo i metodi per il modello sperimentale tubercolosi di zebrafish adulto iniettando M. marinum nella cavità addominale e utilizzando la PCR quantitativa per misurare i carichi micobatteriche e risposte immunitarie dallo zebrafish campioni di tessuto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

Tubercolosi del micobatterio è attualmente il più letale agente patogeno umano causando le infezioni 10,4 milioni e 1,7 milioni di morti ogni anno. L'esposizione a questo batterio provoca uno spettro di vasta malattia negli esseri umani che vanno da un'infezione sterilizzati ad una malattia mortale attivamente di progressione. La forma più comune è la tubercolosi latente, che è asintomatico, ma ha il potenziale per riattivare in una malattia fulminante. Zebrafish adulto e sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum hanno recentemente dimostrato di essere un modello applicabile per studiare lo spettro di vasta malattia di tubercolosi. Soprattutto, spontaneo latenza e riattivazione, nonché risposte immunitarie nel contesto dell'infezione micobatterica può essere studiate in questo modello. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'infezione sperimentale di zebrafish adulto, l'insieme degli organi interni per l'estrazione degli acidi nucleici per la misurazione dei carichi micobatteriche e risposta immune dell'ospite mediante PCR quantitativa. L'in-house-sviluppato, M. marinum -qPCR specifici test è più sensibile rispetto ai metodi tradizionali di placcatura, come rileva anche il DNA da micobatteri divisione, dormienti o morti di recente. Come sia DNA che RNA sono estratti dallo stesso individuo, è possibile studiare le relazioni tra lo stato malato e l'espressione genica di ospite e patogeno. Il modello di zebrafish adulto per la tubercolosi, così si presenta come un sistema altamente applicabile, non mammiferi in vivo per studiare le interazioni ospite-patogeno.

L'agente patogeno di pesce naturale Mycobacterium marinum infetta gli organi interni di zebrafish e produce un'infezione sistematica con i granulomi istologicamente visibile19. Zebrafish adulto sono infettati con M. marinum tramite un'iniezione intraperitoneale. Il DNA e RNA sono estratte e micobatterica è misurato da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) utilizzando il DNA come il modello. La struttura del metodo è illustrata n...

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Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per tubercolosi umana modello in un adulto zebrafish utilizzando la sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum. Estratti di DNA e RNA da organi interni di zebrafish infetto può essere utilizzato per rivelare che il totale micobatterico carichi nel pesce e le risposte immunitarie dell'ospite con qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tubercolosi come qual è il ruolo delle risposte immunitarie adattive e la patogenesi di questa malattia multifattoriale. Il principale vantaggio di questo metodo di base dell'acido nucleico è che sia i carichi batterici che i livelli di espressione genica possono essere misurati dallo stesso individuo. Per iniziare questa procedura, cultura M.marinum su una piastra 7H10 come delineato nel protocollo di testo.Trasferire 10 millilitri di mezzo 7H9 contenente arricchimento ADC, polisorbato 80 e glicerolo in un pallone da coltura cellulare. Quindi, utilizzare un ciclo sterile di inoculazione di un microliter per trasferire aseticamente un loopful della massa batterica M.marinum nel pallone. Lasciare il tappo sciolto o utilizzare un tappo filtrante per consentire uno scambio di gas e una coltura sufficienti a 29 gradi Celsius al buio senza tremare per tre o quattro giorni fino a quando l'OD600 raggiunge circa 0,7.Diluire e continuare a coltivare i batteri come delineato nel testo. Per iniziare a preparare la soluzione batterica per l'infezione, trasferire un millilitro della coltura in un tubo fresco. Centrifuga a 10.000 g per tre minuti.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di PBS sterile. Utilizzando PBS sterile con 0,3 milligrammi per millilitro di rosso fenolo come tracciante, diluire la sospensione per raggiungere la concentrazione batterica desiderata. Dopo questo, utilizzare una siringa millilitro per tirare lentamente la sospensione attraverso un ago calibro 27 tre volte.Eseguire questo passaggio appena prima dell'utilizzo per ogni aliquota. In primo luogo, pipettare una goccia a cinque microliter della soluzione batterica diluita su un pezzo di pellicola di paraffina. Quindi, tirare la goccia in un ago di insulina calibro 30.Usa un pesce di cinque-otto mesi per questo esperimento, con uno che è un pesce di tipo selvatico e l'altro è un pesce mutante di straccio. Posizionare il lato ventrale del pesce nelle fessure di un pezzo di plastica espansa umida. Iniettare l'ago di insulina tra le pinne pelviche con un angolo di 45 gradi.Tenere l'ago aperto verso l'alto per assicurarsi che l'intera apertura si trova all'interno della cavità addominale. Quindi, iniettare lentamente la soluzione batterica. Dopo questo, rimuovere con cura l'ago e trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio di recupero pieno di acqua fresca del serbatoio.Prelevare campioni dall'aliquota batterica in uso ogni 15 minuti su piastre 7H10. Incubare questi campioni a 29 gradi Celsius per cinque giorni per verificare la dose di infezione. Controllare regolarmente il benessere del pesce, assicurandosi di eutanasiare qualsiasi pesce con sintomi di infezione incubandoli in acqua con oltre lo 0,02% di estere etilico dell'acido 3-amminobenzoico.Dopo aver eutanasiato il pesce, inserire un perno posteriore ai raggi branchiostegali. Inserire un secondo perno attraverso la coda per appuntare il pesce sulla piattaforma. Usando un bisturi, aprire l'intera cavità addominale.Quindi, usa un piccolo cucchiaio e una pinzetta affilata per raccogliere gli organi interni a partire dal cuore e lavorando lungo la colonna vertebrale verso la coda per staccare tutti gli organi interni in un blocco. Utilizzare una pinzetta per staccare la rete intestinale dalla cloaca e trasferire gli organi in un tubo di omogeneizzazione da 1,5 millilitri contenente una mezza dozzina di perline ceramiche da 2,8 millimetri. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio secco per congelare il campione.Conservare il campione a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'omogeneizzazione. Dopo aver estratto il DNA e l'RNA, misurare i carichi micobatterici per PCR quantitativa come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, i pesci zebra adulti sono infettati da M.marinum da un'iniezione intraperitoneale.Si nota che un'elevata dose di infezione porta a una malattia progressiva in cui la carica micobatterica continua ad aumentare fino a quando il carico medio raggiunge circa cinque milioni di batteri che alla fine uccidono il pesce. Una dose bassa d'altra parte porta allo sviluppo di uno spettro di malattie simile a quello visto nella tubercolosi umana con infezioni progressive, latenti, riattivate e sterilizzate. In questo caso, il carico continua ad aumentare per quattro settimane dopo di che la malattia raggiunge uno stato stazionario nella maggior parte del pesce.Questi dati rivelano che il numero iniziale di micobatteri utilizzati per infettare il pesce è un determinante critico per l'esito dell'infezione. Si vede che i pesci zebra mutanti rag non sono in grado di limitare a sufficienza la crescita dei micobatteri portando a carichi batterici più elevati e a una maggiore morbilità. Ciò dimostra chiaramente l'importanza dell'immunità adattiva nel controllo dell'infezione micobatterica.I livelli di interleuchina-4 sono significativamente più alti nel gruppo di tipo selvaggio rivelando che la risposta adattiva è necessaria per l'introduzione efficiente dell'interleuchina-4, ma dispensabile per l'introduzione della gamma interferone dopo l'infezione micobatterica. Questo protocollo consente la raccolta di DNA e RNA dallo stesso campione, il che consente di combinare il carico micobatterico del campione con i dati di espressione genica sia dell'ospite che dei batteri. Questa tecnica può essere combinata con la somministrazione di farmaci o candidati al vaccino per valutarne l'effetto sui carichi micobatterici e sulle risposte immunitarie.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire le linee guida locali per la sicurezza personale e lo smaltimento dei rifiuti quando si lavora con un agente patogeno di livello due di biosicurezza. Questa tecnica consente di studiare sia la tubercolosi attiva che la tubercolosi latente con micobatteri dormienti nel pesce zebra, che è un modello etico non mammiferi in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

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